WO2013141202A1 - 筋増加剤、及び筋増加物質のスクリーニング方法 - Google Patents

筋増加剤、及び筋増加物質のスクリーニング方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2013141202A1
WO2013141202A1 PCT/JP2013/057651 JP2013057651W WO2013141202A1 WO 2013141202 A1 WO2013141202 A1 WO 2013141202A1 JP 2013057651 W JP2013057651 W JP 2013057651W WO 2013141202 A1 WO2013141202 A1 WO 2013141202A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
muscle
trpv1
group
factor
agent
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/057651
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
武田　伸一
尚基 伊藤
ウルス ルーグ
友子 鈴木
Original Assignee
独立行政法人国立精神・神経医療研究センター
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター filed Critical 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター
Publication of WO2013141202A1 publication Critical patent/WO2013141202A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/06—Anabolic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to a muscle increasing agent and an agent for treating or preventing a disease or disorder that causes muscle atrophy.
  • the present invention also relates to a screening method for a muscle increasing substance or factor.
  • Non-patent Document 1 Skeletal muscle weight is controlled by the balance between protein synthesis and degradation.
  • muscle inactive states such as cast fixation and bed rest
  • muscle protein content decreases due to inhibition of protein synthesis and promotion of proteolysis, resulting in decreased muscle mass and muscle atrophy (disused muscles atrophy).
  • Muscle atrophy is caused not only by space flight under microgravity and immobilization by tail suspension, but also by cachexia, aging (sarcopair), steroid administration, and the like.
  • Non-patent Document 2 amyotrophic lateral sclerosis
  • Neurogenic muscle atrophy a means for inducing muscle hypertrophy or reducing muscle atrophy
  • molecular pathology a means for inducing muscle hypertrophy or reducing muscle atrophy
  • Non-patent Document 3 amyotrophic lateral sclerosis
  • TRPV1 receptor is also called capsaicin receptor and is one of TRP (transient-receptor-potential protein) receptor family.
  • TRPV1 functions as an ion channel and a calcium channel and is activated by capsaicin, thermal stimulation (Non-patent document 6), NO (Non-patent document 6), allicin (Non-patent document 7), LPA (Non-patent document 8), and the like. It is known to be related to blood flow increasing action, sweating action, analgesic action and the like. For this reason, TRPV1 agonists containing capsaicin have been reported to be effective in the treatment of pain, inflammation and the like (for example, Patent Documents 1 to 3).
  • nNOS neuronal nitric oxide synthase
  • Non-patent Document 9 NNOS released from the muscle cell membrane during mouse tail suspension moves to the cytoplasm, produces nitric oxide (NO), inhibits phosphorylation of Forkheadkbox O (Foxo), and activates expression of E3 ubiquitin ligase Caused muscle atrophy.
  • nNOS was involved in recovery from muscle wasting during reloading. This suggests that nNOS controls not only muscle atrophy but also muscle hypertrophy.
  • nNOS neuronal nitric oxide synthase
  • the present invention aims to further elucidate the molecular basis of muscle hypertrophy, and to establish a new treatment method for muscle atrophy, that is, a method and means for promoting muscle hypertrophy based on the molecular basis.
  • the present inventor has identified a calcium channel that functions during muscle hypertrophy and examined the calcium channel as a target.
  • regulation of intracellular calcium concentration via TRPV1 is important for activation of protein synthesis pathway by mTOR and subsequent muscle hypertrophy, and activation of TRPV1 promotes muscle hypertrophy and reduces muscle atrophy.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a muscle increasing agent comprising a TRPV1 agonist as an active ingredient.
  • the muscle increasing agent according to [1] for promoting muscle hypertrophy, preventing muscle atrophy, increasing muscle strength or maintaining muscle strength.
  • the TRPV1 agonist is capsaicin or olbanil, or a salt, ester or prodrug thereof.
  • a screening method for a muscle increasing substance or factor (A) treating a cell expressing TRPV1 with a test substance or factor; (B) measuring a change in TRPV1 activation in the cell; (C) A method comprising the step of identifying a test substance or factor as a muscle augmenting substance or factor candidate when the activation of TRPV1 is increased. [8] The method according to [7], wherein a change in activation of TRPV1 is measured by a change in intracellular calcium concentration or a change in calcium concentration in sarcoplasmic reticulum. [9] A method for increasing muscle in a subject, comprising administering an effective amount of a TRPV1 agonist to the subject.
  • a method for treating or preventing a disease or disorder causing muscle atrophy in a subject comprising administering to the subject a prophylactically or therapeutically effective amount of a TRPV1 agonist.
  • This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2012-063182, which is the basis for the priority of the present application.
  • the muscle increasing agent according to the present invention can effectively promote muscle hypertrophy, reduce muscle atrophy, and increase or maintain muscle strength. Further, the screening method according to the present invention can identify a muscle increasing substance or factor, and is useful for developing a preventive or therapeutic method such as muscle atrophy. Therefore, the present invention is useful in fields such as medicine, pharmacy, and rehabilitation.
  • A shows activation of mTOR upon administration of TRP channel agonist
  • B shows activation of mTOR upon administration of TRPV1, TRPV2 and TRPV4 agonists
  • C shows TRPV1 agonist (capsaicin) and calcium chelator (BAPTA) -AM) shows the activation of mTOR when co-administered
  • D shows loss of mTOR activation upon administration of TRPV1 agonist (capsaicin) in TRPV1-deficient mice (TRPV1-/-).
  • A shows muscle weight after administration of TRPV1 antagonist (capsazepine)
  • B shows muscle weight after administration of TRPV1 agonist (capsaicin) in TRPV1-deficient mice
  • C shows administration of capsaicin in nNOS-deficient mice or capsaicin Is the muscle weight after administration of peroxynitrite scavenger (FeTPPS), co-administration of FeTPPS and capsaicin, or co-administration of FeTPPS, capsaicin and BAPTA-AM in nNOS-deficient mice Indicates.
  • FeTPPS peroxynitrite scavenger
  • FIG. 4A is represented as a graph. It is a fluorescence image which shows that the raise of the calcium concentration in a myoblast by NO / peroxynitrite donor (SIN-1) is inhibited by a TRPV1 antagonist (capsazepine).
  • the time-dependent change of the fluorescence intensity of FIG. 5A is represented as a graph.
  • the peak of the fluorescence intensity in FIG. 5A is represented as a graph. It is the photograph which analyzed the activation of mTOR by capsaicin administration by the Western blot compared with the overload (overload) and exercise (exercise). It is a graph which shows that a muscle weight increases by capsaicin administration.
  • the present invention relates to a muscle increasing agent containing a TRPV1 agonist.
  • TRPV1 agonists have been shown to be effective in promoting muscle hypertrophy, preventing muscle atrophy, increasing muscle strength, and maintaining muscle strength, as described in the Examples below.
  • muscle gain refers to either promoting muscle hypertrophy, preventing muscle atrophy, increasing muscle strength, or maintaining muscle strength, or a combination thereof.
  • muscle hypertrophy refers to an increase in muscle weight due to an increase in the weight of a single muscle fiber or a cross-sectional area accompanying an increase in the amount of endogenous protein
  • promotion of muscle hypertrophy refers to an increase in the amount of endogenous protein.
  • promoting it means promoting the increase of muscle weight due to the increase of single muscle fiber weight or cross-sectional area.
  • muscle atrophy means a state in which the weight or cross-sectional area of a single muscle fiber is partially reduced, accompanied by a decrease in muscle strength
  • “reduction of muscle atrophy” means the weight or cross-sectional area of a single muscle fiber.
  • Muscle strength is a force (muscle tension) for contracting a muscle
  • “increase or maintenance of muscle strength” means that the force is increased or maintained.
  • the muscle increasing agent according to the present invention is useful for the prevention or treatment of diseases or disorders that cause muscle atrophy, particularly for the treatment of patients with severe muscle atrophy and difficulty in exercise therapy such as rehabilitation, and for increasing the muscle mass of bedridden patients. is there. Therefore, the present invention also relates to a therapeutic or prophylactic agent for a disease or disorder that causes muscle atrophy, including a TRPV1 agonist.
  • the muscle increasing agent according to the present invention and the therapeutic or prophylactic agent for diseases or disorders causing muscle atrophy according to the present invention include a TRPV1 agonist as an active ingredient.
  • the agent contains at least one drug selected from TRPV1 agonists.
  • the TRPV1 agonist that is an active ingredient any drug can be used as long as it is a drug known to activate TRPV1 in this technical field.
  • the TRPV1 agonist used in the present invention is capable of activating TRPV1 on the intracellular sarcoplasmic reticulum membrane, ie, capable of penetrating the cell membrane.
  • Drugs known in the art as TRPV1 agonists include capsaicinoids and capsinoids.
  • Capsaicinoid is a generic name for a group of compounds having the same basic skeleton as capsaicin and having the same physiological activity as capsaicin, and has a structure represented by the following formula (I).
  • Capsinoid is a general term for a group of compounds having the same basic skeleton as capsaiate having the same physiological activity as capsaicinoid and having the same physiological activity as capsaiate, and has a structure represented by the following formula (II).
  • R 1 represents an optionally substituted aliphatic hydrocarbon group having 5 to 15 carbon atoms, or an optionally substituted aromatic hydrocarbon group having 6 to 15 carbon atoms
  • R 2 represents Represents an optionally substituted aliphatic hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms, and m and n are each independently 1 to 4].
  • the “aliphatic hydrocarbon group” is not limited, but is a linear or branched alkyl group (for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, butyl group, isobutyl group, t-butyl group, pentyl group, hexyl group, heptyl group, octyl group, nonyl group, decyl group, etc.), linear or branched alkenyl group (eg ethenyl group, propenyl group or isomers thereof), straight A chain or branched alkynyl group (for example, ethynyl group or propynyl group), an alkoxy group (a group in which a linear or branched alkyl group is bonded to an oxygen atom (R—O—), for example, a methoxy group Ethoxy group and the like.
  • a linear or branched alkyl group for example, methyl group
  • the “aromatic hydrocarbon group” is an aryl group (for example, an aryl group, a benzyl group, a tolyl group, a naphthyl group, etc.), an aryloxy group (a group formed by bonding an aromatic hydrocarbon to an oxygen atom, for example, A phenoxy group, a naphthoxy group, etc.), a carboxyl group (also represented as a COOR group, R can be a hydrogen atom, a lower alkyl group, or a halogen atom).
  • aryl group for example, an aryl group, a benzyl group, a tolyl group, a naphthyl group, etc.
  • an aryloxy group a group formed by bonding an aromatic hydrocarbon to an oxygen atom, for example, A phenoxy group, a naphthoxy group, etc.
  • a carboxyl group also represented as a COOR group, R can be a hydrogen atom, a lower alkyl
  • the aliphatic hydrocarbon and aromatic hydrocarbon are each independently a hydrogen atom, halogen atom, oxygen atom, OH group, NO 2 group, CF 3 group, CN group, alkyl group.
  • a group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alkoxy group, a carboxyl group and the like may be further substituted, or may not be substituted.
  • capsaicinoid examples include, for example, capsaicin, dihydrocapsaicin, nordihydrocapsaicin, homocapsaicin, homodihydrocapsaicin, nonivamid, civaamide, and olvanil.
  • Specific compounds contained in capsinoids include, for example, capsiate, dihydrocapsiate, nordihydrocapsiate. In the present invention, such a compound can be used as a TRPV1 agonist.
  • TRPV1 agonists are well known in the art, and can be easily prepared by extraction from a pepper plant or chemical synthesis (for example, JP 2008-539253, JP 2010-77086, JP 2010-174046). issue). All of the above listed TRPV1 agonists are commercially available. In addition, salts, esters and prodrugs of the above-listed compounds are also known and can be used in the present invention (for example, JP-T-2008-539253, JP-T-2008-508202, JP-A-2010-280668). issue).
  • the selected TRPV1 agonist has a suitable muscle increasing action can be confirmed by methods known in the art.
  • the muscle-increasing action can be confirmed by administering a selected TRPV1 agonist to a subject (such as an experimental animal) and measuring the muscle weight, muscle cross-sectional area, muscle tension, etc. of the subject.
  • This agent may contain one TRPV1 agonist as an active ingredient, or may contain a combination of two or more TRPV1 agonists.
  • this agent may contain capsaicinoid and / or capsinoid in the form of a pepper extract.
  • this agent exerts the above-described muscle increasing action.
  • This agent may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive in addition to the TRPV1 agonist which is an active ingredient.
  • carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, xanthan gum, Examples include gum arabic, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, and lactose.
  • the additive to be used is appropriately or in combination selected from the above depending on the dosage form.
  • this drug When this drug is administered orally, tablets, capsules (hard capsules, soft capsules, microcapsules, etc.), granules, powders, pills, troches, liquids for internal use, solutions, suspensions, emulsions, Any of syrups and the like may be used, and it may be a dry preparation which is redissolved when used.
  • this agent When this agent is administered parenterally, for example, intravenous injection (including infusion), intramuscular injection, intraperitoneal injection and subcutaneous injection (eg, solution, emulsion, suspension), ointment, Formulation forms such as creams, suppositories, cataplasms, inhalants, liniments, aerosols and other external preparations can be selected. In the case of injections, they are provided in the form of unit dose ampoules or multi-dose containers. .
  • compositions are excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, lubricants, surfactants, dispersants, buffering agents, pH adjusting agents, preservatives, solubilizers commonly used in medicine.
  • Agents, preservatives, flavoring agents, absorption promoters, soothing agents, stabilizers, tonicity agents and the like can be appropriately selected and produced by conventional methods.
  • the TRPV1 agonist to be mixed with this drug varies depending on the type of active ingredient, application, dosage form, administration route, etc., but is, for example, 0.01 to 90% by weight, preferably 1 to 50% by weight based on the total weight.
  • the effective amount (dosage or intake) of this agent varies depending on the type of active ingredient contained in the agent, the age and weight of the subject, the administration route, and the number of administrations, and can be varied over a wide range.
  • an effective amount of a TRPV1 agonist per day for an adult can usually be administered once or several times daily for about 1 week to about 1 year, preferably about 1 month to about 12 months.
  • This drug does not specifically limit the target (subject) to be used.
  • it can be administered to or ingested by subjects such as humans, domestic animals (such as cows), pets (such as dogs and cats), and laboratory animals (such as monkeys).
  • the subject is, in particular, a subject in need of muscle increase (specifically, a subject undergoing rehabilitation, a subject having difficulty in exercise, a bedridden subject), a patient having a disease or disorder that causes muscle atrophy, and the like.
  • Diseases or disorders that cause amyotrophy include amyotrophic lateral sclerosis, muscular dystrophy, cachexia, aging (sarcope), side effects from steroid administration, and spacewalking.
  • This agent can be combined with other muscle increasing agents known in the art or methods effective for muscle augmentation.
  • administration of protein that is a nutrient necessary for muscle growth administration of hormones that assimilate the nutrient to the muscle (growth hormone, etc.), load on the muscle (eg, mild exercise, strength training, pressure training), etc. be able to.
  • This agent is not limited to the use as a pharmaceutical composition, and may be blended with other foods or feeds, for example.
  • Food and “feed” refer to natural products containing one or more nutrients and processed products thereof, including all food and drink. A food or feed containing this agent is useful as a health supplement product for increasing muscle.
  • this agent When this agent is added to food, it can be added to various forms of food such as solid food, jelly food, liquid food, and capsule food.
  • solid food includes bread dough; dough for baked confectionery such as rice crackers, biscuits and cookies; noodles such as buckwheat and udon; fish products such as kamaboko and chikuwa; livestock products such as ham and sausage; powdered milk and the like It is done.
  • the jelly-like food include fruit jelly and coffee jelly.
  • examples of liquid foods include beverages such as soft drinks and fruit beverages (tea, coffee, tea, fermented milk, lactic acid bacteria beverages, etc.), seasonings (mayonnaise, dressings, seasoning seasonings, etc.).
  • capsule foods include hard capsules and soft capsules.
  • this agent When this agent is added to food, it can be added so that the content of TRPV1 agonist is 0.01 to 90% by weight with respect to the whole food.
  • the intake that can be expected to be effective is appropriately determined according to the individual case, taking into account the age, weight, sex, and degree of symptoms.
  • the number of intakes can be divided into several times a day, in which case the amount can be divided according to the number of times. In addition, it can be taken continuously over a long period of time.
  • TRPV1 agonist or this agent As described above, by administering a TRPV1 agonist or this agent to a subject, it is possible to prevent or treat a disease or disorder that causes muscle increase in the subject or causes muscle atrophy in the subject.
  • TRPV1 regulation of intracellular calcium concentration via TRPV1 is important for activation of protein synthesis pathway by mTOR and subsequent muscle hypertrophy (FIG. 8). Therefore, activating TRPV1 is thought to lead to the development of a drug or technique that pharmacologically induces muscle hypertrophy or reduces muscle atrophy. For example, taking a drug that activates TRPV1 may increase intracellular calcium concentration, induce muscle hypertrophy without exercise, or reduce muscle atrophy. Therefore, the present invention further relates to a method for screening a muscle increasing substance or factor based on a change in activation of TRPV1.
  • a cell expressing TRPV1 is treated with a test substance or a factor, and the activation change of TRPV1 in the cell is measured.
  • the activation of TRPV1 in the cells is measured before treatment with the test substance or factor.
  • Examples of cells expressing TRPV1 include myocytes and myoblasts. These cells can be obtained and prepared according to methods known in the art, or commercially available cells or publicly available cells can be used. For example, C2C12 (RCB0987, RIKEN BioResource Center cell bank: myoblast cell line), HEK-293 cells (known to overexpress human TRPV1), and the like can be used.
  • C2C12 RB0987, RIKEN BioResource Center cell bank: myoblast cell line
  • HEK-293 cells known to overexpress human TRPV1
  • test substance or factor that is the subject of this screening method is not particularly limited.
  • the test substance or factor can be any substance, specifically a naturally occurring molecule such as an amino acid, peptide, oligopeptide, polypeptide, protein, nucleic acid, lipid, carbohydrate (such as sugar), steroid, glycopeptide Synthetic analogs or derivatives of naturally occurring molecules, such as peptidomimetics, nucleic acid molecules (aptamers, antisense nucleic acids, double-stranded RNA (RNAi), etc.), etc .; non-naturally occurring molecules, such as And low molecular organic compounds (inorganic and organic compound libraries, combinatorial libraries, etc.) produced using combinatorial chemistry techniques and the like; and mixtures thereof.
  • the test substance or factor may be a single substance, a complex composed of a plurality of substances, a transcription factor, or the like.
  • the test substance or factor may be an environmental factor such as radiation, ultraviolet rays, carbon concentration, or temperature.
  • test substance or factor a single test substance or factor may be tested independently, or a mixture of several candidate test substances or factors (including a library or the like) may be tested.
  • the library containing a plurality of test substances or factors include a synthetic compound library (such as a combinatorial library) and a peptide library (such as a combinatorial library).
  • the contact conditions vary depending on the type of the substance or factor, but can be easily determined by those skilled in the art.
  • such contact can be achieved by culturing the cells in a medium to which the test substance is added, immersing the cells in a solution containing the test substance, laminating the test substance on the cells, or Can be performed in the presence of a test factor.
  • the effect and effectiveness of the test substance or factor can be examined under several conditions. Such conditions include time or duration, amount (large or small), number of times, etc. of treatment with the test substance or factor.
  • a plurality of doses can be set by preparing a dilution series of the test substance.
  • the treatment period of the test substance or factor can also be set as appropriate.
  • the treatment can be performed over a period of 1 day to several weeks, months, and years.
  • test substances and / or factors may be used in combination.
  • the activation of TRPV1 in the cell is measured at an appropriate time. For example, immediately after treatment, 30 minutes, 1 hour, 3 hours, 5 hours, 10 hours, 15 hours, 20 hours, 24 hours (1 day), 2-10 days, 10-20 Measurements are taken after 20-30 days, 1-6 months later.
  • the change in activation of TRPV1 can be measured by a method known in the art, for example, a change in intracellular calcium concentration or a change in calcium concentration in sarcoplasmic reticulum.
  • a change in calcium concentration can be measured by measuring intracellular fluorescence intensity using Fluo-4 which emits fluorescence by binding to calcium.
  • the test substance or factor that increases the activation of TRPV1 is selected as a muscle increasing substance or factor as compared with the control.
  • a control cells that have not been treated with a test substance or factor can be used.
  • a primary screening cells were treated with a test substance or factor, a test substance or factor showing an increase in TRPV1 activation in the cell was selected, and then selected as a secondary screening.
  • An animal may be treated with a test substance or factor, and the test substance or factor exhibiting increased activation may be selected by measuring the activation of TRPV1 in the muscle cells of the animal.
  • the selected test substance or factor may be administered to an experimental animal to determine whether the test substance or factor increases muscle in the experimental animal.
  • an experimental animal a model animal, preferably a mouse, in which muscle atrophy has been induced by hindlimb suspension, denervation, dexamethasone administration, or the like can be used.
  • Whether or not the test substance or factor increases in the experimental animal depends on the type of the experimental animal, etc., but can be appropriately determined by those skilled in the art by methods known in the art.
  • muscle tissue can be collected from an animal, and its muscle weight, muscle cross-sectional area, and muscle tension can be measured.
  • a muscle augmenting substance or factor candidate can be identified, and further, the effectiveness of the muscle augmenting substance or factor can be confirmed.
  • Example 1 To identify calcium channels that function during muscle hypertrophy, we focused on TRP channels that have been reported to be activated by nitric oxide (NO). It has also been reported that mTOR, which controls the protein synthesis system, is activated by increasing intracellular calcium concentration. Therefore, various TRP channel agonists were intramuscularly injected into mice, and mTOR activation was analyzed using phosphorylation of p70S6k, a downstream molecule of mTOR, as an index.
  • NO nitric oxide
  • mice purchased from Clea Japan (Japan), and Jackson Laboratories (Wilmington, TRPV1-deficient mice purchased from MA) were used.
  • TRP channel agonists thapsigargin (Thapsigargin: 20 ⁇ M, Calbiochem), OAG (10 ⁇ M, Calbiochem), Hyp9 (10 ⁇ M, Sigma-Aldrich), capsaicin (capsaicin: 10 ⁇ M, Sigma-Aldrich), olvanil (olvanil: 10 ⁇ M, Sigma-Aldrich) ), 2-APB (10 ⁇ M, Sigma-Aldrich), RN-1734 (10 ⁇ M, Sigma-Aldrich) and BAPTA-AM (50 ⁇ M, Calbiochem) were administered intramuscularly to C57BL / 6 mice. Only capsaicin (10 ⁇ M, Sigma-Aldrich) was administered intramuscularly to TRPV1-deficient mice.
  • mice were euthanized and plantar muscles were frozen and fixed. After freezing, sliced plantar muscles were sample buffer (0.1% Triton X-100, 50 mM HEPES (pH 7.4), 4 mM EGTA, 10 mM EDTA, 15 mM Na 4 P 2 O 7 , 100 mM glycerophosphate, Homogenization was performed with 25 mM NaF, 5 mM Na 2 VO 4 , and complete protease inhibitor cocktail (Roche)), and the supernatant was collected after centrifugation (15,000 g, 10 minutes).
  • sample buffer (0.1% Triton X-100, 50 mM HEPES (pH 7.4), 4 mM EGTA, 10 mM EDTA, 15 mM Na 4 P 2 O 7 , 100 mM glycerophosphate
  • Homogenization was performed with 25 mM NaF, 5 mM Na 2 VO 4 , and complete protease inhibitor cocktail (Roc
  • sample loading buffer (30% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 2.3% SDS, 62.5 mM Tris-HCl ( pH 6.8), 0.05% bromophenol blue), heat-denatured at 60 ° C. for 15 minutes, and 30 ⁇ g was subjected to Western blotting.
  • the PVDF transfer membrane was blocked with Tris-buffered saline (TBS) + 5% skim milk (snow mark), and incubated for 16 hours at 4 ° C. using the primary antibody.
  • TBS Tris-buffered saline
  • Primary antibodies include Akt (# 9272, Cell Signaling Technology), p-Akt (Ser473) (# 9271, Cell Signaling Technology), p70S6K (# 9202, Cell Signaling Technology), and p-p70S6K (Thr389) (# 9205 , Cell Signaling Technology).
  • Akt 9272, Cell Signaling Technology
  • p-Akt Ser473
  • p70S6K # 9202, Cell Signaling Technology
  • p-p70S6K Thr389
  • p70S6K was phosphorylated by capsaicin, an agonist of TRPV1 channel, and olvanil, an analog thereof, and mTOR was activated (A in FIG. 1).
  • TRAP2 agonist 2-APB and TRPV4 agonist RN-1734 were administered, but mTOR activation was not observed (Fig. 1).
  • B activation of mTOR by capsaicin administration was suppressed by co-administration of BAPTA-AM, a calcium chelator (FIG. 1C). This indicates that mTOR involved in muscle hypertrophy is activated by an increase in intracellular calcium concentration via TRPV1.
  • TRPV1-deficient mice TRPV1-deficient mice
  • mice were subjected to hindlimb synergies and induced compensatory muscle hypertrophy due to overload.
  • nNOS-deficient mice and TRPV1-deficient mice purchased from 12-week-old Jackson Laboratories (Wilmington, MA) and C57BL / 6 mice purchased from Japan Claire (Japan) were used.
  • the soleus tendon was excised under anesthesia to induce compensatory muscle hypertrophy due to overload (Adams, GR & Haddad, F. J Appl Physiol 81, 2509-2516 (1996)).
  • the control group underwent sham surgery to cut the skin.
  • capsazepine (capsazepine: 10 ⁇ M, Sigma-Aldrich)
  • capsaicin capsaicin: 10 ⁇ M, Sigma-Aldrich
  • BAPTA-AM 50 ⁇ M, Calbiochem
  • TRPV1-deficient mice have significantly reduced compensatory muscle hypertrophy induced by overload compared to TRPV1 wild-type mice (FIG. 2B).
  • nNOS-deficient mice show a phenotype in which the progression of muscle hypertrophy due to overload is attenuated (data not shown). This phenotype is restored by capsaicin administration, and the effect is BAPTA-AM (calcium chelator). ) Was co-administered (C in FIG. 2).
  • C2C12 that induced myogenic differentiation was cultured in PSS solution (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 10 mM HEPES, 10 mM glucose pH 7.0) for 6 hours or more, and then 8 ⁇ M Fluo-4 was added. And incubated at room temperature for 30 minutes. After removing excess Fluo-4 and culturing at 37 ° C. for 5 minutes, changes in fluorescence intensity due to SIN-1 (DOJINDO) were measured every 3 seconds using an inverted fluorescence microscope (Olympus).
  • PSS solution 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 10 mM HEPES, 10 mM glucose pH 7.0
  • the increase in intracellular calcium concentration occurs due to the uptake of extracellular calcium or the release of calcium stored in the intracellular sarcoplasmic reticulum.
  • Extracellular calcium was removed (0 Ca 2+ ) or calcium in the sarcoplasmic reticulum was depleted by thapsigargin.
  • SIN-1 the increase in intracellular calcium concentration by SIN-1 was suppressed by depletion of calcium in the sarcoplasmic reticulum (FIGS. 4A and 4B).
  • Example 3 It is known that the release of calcium from the sarcoplasmic reticulum is controlled by ryanodine receptors, IP3 receptors, and the like. In addition, it has been reported in the past that TRPV1 is localized in the sarcoplasmic reticulum (Xin, H. et al. Biochem Biophys Res Commun 332, 756-762, (2005)). With reference to the experimental results of Reference Example 1, it was examined whether the increase in intracellular calcium concentration by peroxynitrite was mediated by TRPV1 localized in the sarcoplasmic reticulum.
  • dantrolene (dantrolene: 10 ⁇ M, Calbiochem) and heparin (heparin: 4 mg / ml, Sigma-Aldrich) were used to inhibit the ryanodine receptor and IP3 receptor, respectively. added.
  • Ruthenium red (10 ⁇ M, Sigma-Aldrich) was added to inhibit TRPV1 in the cell membrane and capsazepine (capsazepine: 10 ⁇ M, Sigma-Aldrich) was added to inhibit TRPV1 in the cell membrane and sarcoplasmic reticulum.
  • Example 4 The activation of mTOR by capsaicin administration was compared with the activation of mTOR by overload and exercise.
  • the subjects used were C57BL / 6 mice purchased from CLEA Japan (Japan) and TRPV1-deficient mice purchased from Jackson Laboratories (Wilmington, MA). Overload was performed by hindlimb synergism as described in Example 2.
  • a treadmill (MK-680S, Muromachi Kikai) was used to apply exercise to the mice. After running at an initial speed of 5 m / min for 5 minutes, the speed was increased by 1 m / min every other minute and increased to a speed of 20 m / min. After running for a total of 30 minutes, the gastrocnemius muscle was collected and analyzed.
  • Muscle tension was measured using the long finger extensor. Specifically, the mouse long finger extensor was isolated and electrically stimulated in a PSS solution (KCl 4 mM, CaCl 2 1.8 mM, MgCl 2 1 mM, Hepes 5 mM, NaCl 150 mM, glucose 5.6 mM, pH 7.4). It was. SEN-3301 (Nihon Kohden) was used for electrical stimulation. Muscle contraction caused by electronic stimulation was measured using a WR300 thermal array coder (Graphtec) to measure muscle tension.
  • Example 5 To examine the therapeutic effect of muscle atrophy targeting TRPV1, sciatic nerve resection and hind limb suspension were performed to induce muscle atrophy due to denervation and deloading. Specifically, disuse muscle atrophy was induced by rearing the hind limbs of 12-week-old mice to be 1 mm or more away from the floor as muscle atrophy due to unloading (Non-patent Document 3). Also, as atrophy due to denervation, neurogenic muscle atrophy was induced by excising the sciatic nerve of 12-week-old mice (Moresi, V. et al. Cell 143, 35-45, (2010)) . Two weeks after induction of each muscle atrophy, the gastrocnemius and soleus were removed, and the muscle weight and muscle fiber cross-sectional area were measured.

Abstract

　筋萎縮の治療法、並びに筋肥大を促進するための方法及び手段を提供すること。　本発明は、TRPV1アゴニストを有効成分として含むことを特徴とする筋増加剤、及びTRPV1アゴニストを有効成分として含むことを特徴とする、筋萎縮を生じる疾患又は障害の治療又は予防剤を提供する。

Description

筋増加剤、及び筋増加物質のスクリーニング方法
　本発明は、筋増加剤、及び筋萎縮を生じる疾患又は障害の治療又は予防剤に関する。また本発明は、筋増加物質又は因子のスクリーニング方法に関する。
　骨格筋重量はタンパク質合成と分解のバランスによって制御されている（非特許文献１）。ギプス固定やベッドレストなどの筋不活動状態においては、タンパク質合成の抑制及びタンパク質分解の促進により、筋タンパク質含有量が低下し、結果として筋量が減少し、筋が萎縮する（廃用性筋萎縮）。筋萎縮は、微小重力下の宇宙飛行や、尾部懸垂などによる不動化だけでなく、カヘキシア、老化（サルコペア）、ステロイド投与などによっても生ずる。
　筋萎縮に対する治療法の開発は、高齢化社会を迎えた日本において非常に大きな課題の一つである。筋肥大を誘導、あるいは筋萎縮を軽減させる手段を得ることができれば、神経原性の筋萎縮を生じる筋萎縮性側索硬化症（非特許文献２）、また筋萎縮を伴う意味では分子病態が共通する可能性のある筋ジストロフィー（非特許文献３）に対する効果的な手段の開発にも結びつくことが期待される。
　タンパク質合成を活性化させることで筋肥大を誘導することは、筋萎縮に対する治療として期待が持たれる。重度の筋萎縮を伴う患者や寝たきりの高齢者に対し、一般的な運動療法を用いることは非常に難しく、薬物治療が望まれる。これまでPI3K/Akt経路を活性化させるIgf-1（非特許文献４）を投与することでタンパク質合成を活性化させる研究が行われてきたが、その効果は疑問視されている。
　一方、TRPV1受容体は、カプサイシン受容体とも呼ばれ、TRP（transient receptor potential protein）受容体ファミリーの1つである。TRPV1はイオンチャネル、カルシウムチャネルとして機能し、カプサイシン、熱刺激（非特許文献５）、NO（非特許文献６）、アリシン（非特許文献７）、LPA（非特許文献８）などによって活性化され、血流増加作用、発汗作用、鎮痛作用などに関係することが知られている。そのため、カプサイシンを含むTRPV1アゴニストは、疼痛、炎症などの治療に有効であることが報告されている（例えば特許文献１～３）。
特開2008-539253号公報 特開2008-508202号公報 特開2010-280668号公報
Sandri, M., Physiology (Bethesda) 23, p.160-170 (2008) Suzuki, N., et al., J Neurol Sci 294(1-2), p.95-101 (2010) Wehling, M., et al., J Cell Biol 155(1), p.123-131 (2001) Rommel, C., et al., Nat Cell Biol 3(11), p.1009-1013 (2001) Caterina, M. J. et al., Nature 389, p.816-824 (1997) Yoshida, T. et al., Nat Chem Biol 2, p.596-607 (2006) Salazar, H. et al., Nat Neurosci 11, p.255-261 (2008) Nieto-Posadas, A. et al., Nat Chem Biol 8, p.78-85 (2011) Suzuki, N., et al., J Clin Invest 117(9), p.2468-2476 (2007)
　本発明者の研究グループは、筋の不動化によってもたらされる筋萎縮では、神経性一酸化窒素シンターゼ（nNOS）が深く関与していることを明らかにしている（非特許文献９）。マウスの尾部懸垂時に筋細胞膜から遊離したnNOSは、細胞質に移って一酸化窒素（NO）を産生し、Forkhead box O（Foxo）のリン酸化を阻害してE3ユビキチンリガーゼの発現を活性化することにより筋萎縮を招いていた。またその後の研究により、nNOSは再負荷時における筋萎縮からの回復にも関与することがわかった。このことはnNOSが筋萎縮のみならず、筋肥大をも制御していることを示唆している。
　また、本発明者の研究グループは、力学的負荷により神経型一酸化窒素合成酵素（nNOS）が活性化され、NOの派生生成物であるペルオキシ亜硝酸（peroxynitrite）を産生し、細胞内カルシウム濃度を制御することで筋肥大を促進することを提唱している（特願2011-200716）。
　本発明は、筋肥大の分子基盤をさらに解明すると共に、その分子基盤を元に新たな筋萎縮の治療法、すなわち筋肥大を促進するための方法及び手段を確立することを目的とする。
　本発明者は、新たな筋肥大の促進及び筋萎縮の治療のための方法及び手段を開発するため、筋肥大時に機能するカルシウムチャネルを同定し、そのカルシウムチャネルをターゲットとして検討を行った。その結果、TRPV1を介した細胞内カルシウム濃度制御が、mTORによるタンパク質合成経路の活性化及びその後の筋肥大に重要であり、TRPV1を活性化することによって筋肥大を促進しかつ筋萎縮を軽減することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明は以下のとおりである。
［1］TRPV1アゴニストを有効成分として含むことを特徴とする筋増加剤。
［2］筋肥大の促進、筋萎縮の防止、筋力の増加又は筋力の維持のための、［1］に記載の筋増加剤。
［3］TRPV1アゴニストを有効成分として含むことを特徴とする、筋萎縮を生じる疾患又は障害の治療又は予防剤。
［4］TRPV1アゴニストが、細胞膜を貫通することができるものである、［1］～［3］のいずれかに記載の剤。
［5］TRPV1アゴニストが、カプサイシノイド及びカプシノイドからなる群より選択される少なくとも1種である、［1］～［4］のいずれかに記載の剤。
［6］TRPV1アゴニストが、カプサイシン若しくはオルバニル、又はこれらの塩、エステル若しくはプロドラッグである、［1］～［5］のいずれかに記載の剤。
［7］筋増加物質又は因子のスクリーニング方法であって、
（a）TRPV1を発現する細胞を、被験物質又は因子で処置するステップ、
（b）該細胞におけるTRPV1の活性化の変化を測定するステップ、
（c）TRPV1の活性化が増大する場合に被験物質又は因子を筋増加物質又は因子の候補として同定するステップ
を含む方法。
［8］TRPV1の活性化の変化を、細胞内カルシウム濃度の変化又は筋小胞体内カルシウム濃度の変化により測定する、［7］に記載の方法。
［9］有効量のTRPV1アゴニストを被験者に投与することを含む、被験者における筋増加方法。
［10］予防上又は治療上有効な量のTRPV1アゴニストを被験者に投与することを含む、被験者において筋萎縮を生じる疾患又は障害を治療又は予防する方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-063182号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明に係る筋増加剤は、筋肥大を効果的に促進し、筋萎縮を軽減し、そして筋力を増加又は維持することができるものである。また本発明に係るスクリーニング方法により、筋増加物質又は因子を同定することができ、筋委縮などの予防法又は治療法の開発に有用である。従って、本発明は、医療、薬学、リハビリテーションなどの分野において有用である。
TRPチャネルアゴニストの投与によるmTORの活性化をウエスタンブロットにより分析した写真である。Aは、TRPチャネルアゴニスト投与時のmTORの活性化を示し、Bは、TRPV1、TRPV2及びTRPV4のアゴニスト投与時のmTORの活性化を示し、Cは、TRPV1アゴニスト（カプサイシン）とカルシウムキレート剤（BAPTA-AM）とを共投与した場合のmTORの活性化を示す。Dは、TRPV1欠損型マウス（TRPV1-/-）におけるTRPV1のアゴニスト（カプサイシン）投与時のmTORの活性化の喪失を示す。 NO/peroxynitriteによって制御された内在性TRPV1の活性化と筋肥大との関係を示すグラフである。Aは、TRPV1アンタゴニスト（カプサゼピン）投与後の筋重量を示し、Bは、TRPV1欠損型マウスにおけるTRPV1アゴニスト（カプサイシン）投与後の筋重量を示し、Cは、nNOS欠損型マウスにおけるカプサイシン投与、又はカプサイシンとBAPTA-AM共投与後の筋重量を示し、Dは、nNOS欠損型マウスにおけるperoxynitrite消去剤（FeTPPS）投与、FeTPPSとカプサイシン共投与、又はFeTPPSとカプサイシンとBAPTA-AMの共投与後の筋重量を示す。 NO/peroxynitrite供与剤（SIN-1）により筋芽細胞内のカルシウム濃度が上昇することを示す蛍光画像である。 図３Ａの蛍光強度の経時的変化をグラフとして表す。 筋芽細胞内のカルシウム濃度が、SIN-1の濃度依存的に上昇することを示すグラフである。 SIN-1による筋芽細胞内のカルシウム濃度の上昇がperoxynitrite消去剤（FeTPPS）により阻害されることを示すグラフである。 NO/peroxynitrite供与剤（SIN-1）が筋小胞体からのカルシウム放出を誘導することを示す蛍光画像である。 図４Ａの蛍光強度のピークをグラフとして表す。 NO/peroxynitrite供与剤（SIN-1）による筋芽細胞内のカルシウム濃度の上昇がTRPV1アンタゴニスト（カプサゼピン）により阻害されることを示す蛍光画像である。 図５Ａの蛍光強度の経時的変化をグラフとして表す。 図５Ａの蛍光強度のピークをグラフとして表す。 過負荷（overload）及び運動（exercise）と比較した、カプサイシン投与によるmTORの活性化をウエスタンブロットにより分析した写真である。 カプサイシン投与により筋重量が増加することを示すグラフである。 カプサイシン投与により筋断面積が増加することを示すグラフである。 TRPV1欠損型マウスではカプサイシンを投与しても筋重量が増加しないことを示すグラフである。 カプサイシン投与により筋張力が増加することを示すグラフである。 カプサイシン投与により、脱負荷又は除神経による筋重量の減少が軽減することを示すグラフである。 カプサイシン投与により、脱負荷又は除神経による筋断面積の減少が軽減することを示すグラフである。 NO/peroxynitrite/TRPV1による細胞内カルシウム濃度の制御を介した筋肥大の促進機構を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、TRPV1アゴニストを含む筋増加剤に関する。TRPV1アゴニストは、後述する実施例に記載のように、筋肥大の促進、筋萎縮の防止、筋力の増加及び筋力の維持に有効であることが示されている。従って、本発明に関連して、「筋増加」とは、筋肥大の促進、筋萎縮の防止、筋力の増加、若しくは筋力の維持のいずれか又はそれらの組合せを指す。
　本発明において、「筋肥大」とは、内在タンパク質量の増加に伴う単一筋線維重量又は断面積の増加による筋重量の増加といい、「筋肥大の促進」とは、内在タンパク質量の増加を促進することによって、単一筋線維重量又は断面積の増加による筋重量の増加を促進することをいう。また「筋萎縮」とは、単一筋線維重量又は断面積が部分的に減少した状態を意味し、筋力低下を伴うものであり、「筋萎縮の軽減」とは、単一筋線維重量又は断面積の減少を阻止する又は減少の速度を遅くすること、あるいは減少した単一筋線維重量又は断面積を増加させることをいう。「筋力」とは、筋肉を収縮させる力（筋張力）であり、「筋力の増加又は維持」とは、その力が増加又は維持されることをいう。
　本発明に係る筋増加剤は、筋萎縮を生じる疾患又は障害の予防又は治療、特に重度の筋萎縮を伴い、リハビリテーション等の運動療法が困難な患者の治療や寝たきりの患者の筋増量に有用である。従って、本発明は、TRPV1アゴニストを含む、筋萎縮を生じる疾患又は障害の治療又は予防剤にも関する。
　本発明に係る筋増加剤、及び本発明に係る筋萎縮を生じる疾患又は障害の治療又は予防剤（以下、まとめて「本剤」ともいう）は、有効成分としてTRPV1アゴニストを含むものである。具体的には、本剤は、TRPV1アゴニストから選択される少なくとも1種の薬物を含む。
　有効成分であるTRPV1アゴニストとしては、当技術分野においてTRPV1を活性化することが知られている薬物であれば任意の薬物を用いることができる。好ましくは、本発明において使用するTRPV1アゴニストは、細胞内の筋小胞体膜上のTRPV1を活性化することができるものであり、すなわち細胞膜を貫通することができるものである。当技術分野においてTRPV1アゴニストとして知られている薬物には、カプサイシノイド及びカプシノイドがある。カプサイシノイドは、カプサイシンと同様の基本骨格を有し、かつカプサイシンと同質の生理活性を有する化合物群の総称であり、下記式（I）に示される構造を有する。またカプシノイドは、カプサイシノイドと同質の生理活性を有するカプシエートと同様の基本骨格を有し、かつカプシエートと同質の生理活性を有する化合物群の総称であり、下記式（II）に示される構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 〔式中、R1は、置換されていてもよい炭素数5～15の脂肪族炭化水素基、又は置換されていてもよい炭素数6～15の芳香族炭化水素基を表し、R2は、置換されていてもよい炭素数1～3の脂肪族炭化水素基を表し、m及びnは、それぞれ独立して1～4である〕。
　ここで「脂肪族炭化水素基」は、限定されるものではないが、直鎖状又は分岐状のアルキル基（例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、t-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等）、直鎖状又は分岐状のアルケニル基（例えばエテニル基、プロペニル基又はこれらの異性体等）、直鎖状又は分岐状のアルキニル基（例えばエチニル基又はプロピニル基）、アルコキシ基（直鎖状又は分岐状のアルキル基が酸素原子に結合してなる基（R－O－）であり、例えばメトキシ基、エトキシ基等）などである。また「芳香族炭化水素基」は、アリール基（例えばアリール基、ベンジル基、トリル基、ナフチル基等）、アリールオキシ基（芳香族炭化水素が酸素原子に結合してなる基であって、例えばフェノキシ基、ナフトキシ基等）、カルボキシル基（COOR基とも表され、Rは、水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子とすることができる）などである。式（I）及び（II）において、脂肪族炭化水素及び芳香族炭化水素は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、酸素原子、OH基、NO2基、CF3基、CN基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、カルボキシル基などによりさらに置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。
　カプサイシノイドに含まれる具体的な化合物としては、例えばカプサイシン、ジヒドロカプサイシン、ノルジヒドロカプサイシン、ホモカプサイシン、ホモジヒドロカプサイシン、ノニバミド、シバマイド、オルバニルなどがある。またカプシノイドに含まれる具体的な化合物としては、例えばカプシエイト、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイトなどがある。本発明においては、このような化合物をTRPV1アゴニストとして用いることができる。
　かかるTRPV1アゴニストは当技術分野において周知であり、トウガラシ植物からの抽出や化学合成によって容易に調製することができる（例えば、特表2008-539253号、特開2010-77086号、特開2010-174046号）。また、上記列挙されたTRPV1アゴニストはいずれも市販されている。また、上記列挙された化合物の塩、エステル及びプロドラッグも知られており、本発明において使用することができる（例えば、特表2008-539253号、特表2008-508202号、特開2010-280668号）。
　なお、選択したTRPV1アゴニストが好適な筋増加作用を有するか否かは、当技術分野で公知の方法により確認することができる。例えば、選択したTRPV1アゴニストを被験体（実験動物など）に投与し、被験体の筋重量、筋断面積、筋張力などを測定することによって、筋増加作用を確認することができる。
　本剤は、有効成分として、1種のTRPV1アゴニストを含有するものであってもよいし、又は2種以上のTRPV1アゴニストを組み合わせて含有するものであってもよい。また、例えばカプサイシノイドやカプシノイドの中には天然にトウガラシ中に含まれるものもあるため、本剤は、トウガラシ抽出物の形態でカプサイシノイド及び／又はカプシノイドを含有してもよい。本剤は、TRPV1アゴニストから選択される少なくとも1種の薬物を有効成分として含有する限り、上述した筋増加作用を発揮する。
　本剤は、有効成分であるTRPV1アゴニストの他、薬学的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
　本剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセルなど）、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤などのいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥製剤にしてもよい。また、本剤を非経口投与する場合は、例えば静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射及び皮下注射用の注射剤（例えば溶液、乳剤、懸濁剤）、軟膏剤、クリーム剤、座剤、パップ剤、吸入剤、リニメント剤、エアゾル剤などの外用剤などの製剤形態を選択することができ、注射剤の場合は単位用量アンプル又は多用量容器の状態で提供される。
　これらの各種製剤は、医薬において通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、pH調整剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、吸収促進剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤などを適宜選択し、常法により製造することができる。
　本剤に配合するTRPV1アゴニストは、その有効成分の種類、用途、剤形、投与経路などにより異なるが、例えば総重量を基準として0.01～90重量％、好ましくは1～50重量％である。
　また、本剤の有効量（投与量又は摂取量）は、該剤に含まれる有効成分の種類、被験体の年齢及び体重、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変更することができる。例えば、通常成人1日当たりのTRPV1アゴニストの有効量を、1日1回又は数回に分けて、約1週間～約1年間、好ましくは約1ヶ月～約12ヶ月にわたり投与することができる。
　本剤は、使用する対象（被験体）を特に限定するものではない。例えば、ヒト、家畜（ウシなど）、愛玩動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（サルなど）などの被験体に投与する又は摂取させることができる。被験体は、特に、筋増加を必要とする被験者（具体的にはリハビリテーション中の被験者、運動が困難な被験者、寝たきりの被験者）や、筋萎縮を生じる疾患又は障害を有する患者などである。筋萎縮を生じる疾患又は障害には、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、カヘキシア、老化（サルコペア）、ステロイド投与による副作用、宇宙遊泳などがある。
　本剤は、当技術分野で公知の他の筋増加剤又は筋増加に有効な方法と組み合わせることができる。例えば、筋増加に必要な栄養素であるタンパク質の投与、該栄養素を筋に同化させるホルモン（成長ホルモンなど）の投与、筋肉への負荷（例えば軽度な運動、筋力トレーニング、加圧トレーニング）などと組み合わせることができる。
　本剤は、医薬組成物としての用途に限定されず、その他、例えば食品又は飼料などに配合されてもよい。「食品」及び「飼料」とは、栄養素を1種以上含む天然物及びその加工品をいい、あらゆる飲食物を含む。本剤が配合された食品又は飼料は、筋増加のための健康補助製品として有用である。
　本剤を食品に配合する場合、固体状食品、ゼリー状食品、液状食品、カプセル状食品など様々な形態の食品に添加することができる。ここで、固体状食品としては、パン生地；せんべい、ビスケット、クッキーなどの焼き菓子用生地；そば、うどんなどの麺類；かまぼこ、ちくわなどの魚肉製品；ハム、ソーセージなどの畜肉製品；粉ミルクなどが挙げられる。また、ゼリー状食品としては、フルーツゼリー；コーヒーゼリーなどが挙げられる。さらに、液状食品としては、清涼飲料・果実飲料などの飲料類（茶、コーヒー、紅茶、発酵乳、乳酸菌飲料など）、調味料など（マヨネーズ、ドレッシング、味付け調味液など）が挙げられる。カプセル状食品としては、ハードカプセル、ソフトカプセルなどがあげられる。
　本剤を食品に添加する場合、添加量としては、食品全体に対してTRPV1アゴニストの含有量が0.01～90重量％となるように配合することができる。効果が期待できる摂取量は年齢、体重、性別、症状の程度などを考慮して、個々の場合に応じて適宜決定される。摂取回数は一日に何回かに分けて摂取できるが、その場合は、回数に応じて量を分割することも可能である。また、長期にわたり連続して摂取することが可能である。
　以上のようにして、TRPV1アゴニスト又は本剤を被験体に投与することにより、被験体において筋増加し、あるいは被験体において筋萎縮を生じる疾患又は障害を予防又は治療することができる。
　また本発明者の研究により、TRPV1を介した細胞内カルシウム濃度制御が、mTORによるタンパク質合成経路の活性化、及びその後の筋肥大に重要であることが明らかになった（図8）。そのため、TRPV1を活性化することで、薬理学的に筋肥大を誘導し又は筋萎縮を軽減する薬剤又は手法の開発に繋がると考えられる。例えば、TRPV1を活性化させる薬剤の服用により、細胞内カルシウム濃度を上昇させ、運動を伴わずに筋肥大を誘導し又は筋萎縮を軽減できる可能性がある。従って、本発明はさらに、TRPV1の活性化の変化を基準として筋増加物質又は因子をスクリーニングする方法に関する。
　本発明に係るスクリーニング方法（以下、「本スクリーニング方法」ともいう）においては、TRPV1を発現する細胞を、被験物質又は因子で処置し、該細胞におけるTRPV1の活性化の変化を測定する。好ましくは、被験物質又は因子による処置を行う前に、細胞におけるTRPV1の活性化を測定する。
　TRPV1を発現する細胞としては、筋細胞、筋芽細胞などが挙げられる。これらの細胞は、当技術分野で公知の方法に従って入手し調製することができ、あるいは市販の細胞又は公に入手可能な細胞を使用することも可能である。例えば、C2C12（RCB0987、理研バイオリソースセンターセルバンク：筋芽細胞株）、HEK-293細胞（ヒトTRPV1を過剰に発現することが知られている）などを用いることができる。
　本スクリーニング方法の対象となる被験物質又は因子の種類は特に限定されるものではない。例えば、被験物質又は因子は、任意の物質、具体的には、天然に生じる分子、例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体、例えば、ペプチド擬態物、核酸分子（アプタマー、アンチセンス核酸、二本鎖RNA（RNAi）等）など；天然に生じない分子、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作製した低分子有機化合物（無機及び有機化合物ライブラリー、又はコンビナトリアルライブラリー等）など；並びにそれらの混合物を挙げることができる。また被験物質又は因子は、単一物質であってもよいし、複数の物質から構成される複合体や、転写因子等であってもよい。さらに、被験物質又は因子は、放射線、紫外線、炭素濃度、温度などの環境因子であってもよい。
　また、被験物質又は因子としては単一の被験物質又は因子を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質又は因子の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質又は因子を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。
　細胞を被験物質又は因子と接触させる場合、その接触の条件は、その物質又は因子の種類により異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、そのような接触は、細胞を被験物質を添加した培地中で培養することにより、細胞を被験物質を含む溶液中に浸漬することにより、細胞上に被験物質を積層することにより、又は細胞を被験因子の存在下で培養することにより行うことができる。
　また、被験物質又は因子の効果及び有効性は、いくつかの条件で検討することも可能である。そのような条件としては、被験物質又は因子で処置する時間又は期間、量（大小）、回数などが挙げられる。例えば、被験物質の希釈系列を調製するなどして複数の用量を設定することができる。被験物質又は因子の処置期間も適宜設定することができるが、例えば、1日から数週間、数ヶ月、数年の期間にわたって処置を行うことができる。
　さらに、複数の物質及び／又は因子の相加作用、相乗作用などを検討する場合には、被験物質及び／又は因子を組み合わせて用いてもよい。
　続いて、細胞を被験物質又は因子で処置した後、適当な時期に、該細胞におけるTRPV1の活性化を測定する。例えば、処置の直後、30分後、1時間後、3時間後、5時間後、10時間後、15時間後、20時間後、24時間（1日）後、2～10日後、10～20日後、20～30日後、1ヶ月～6ヵ月後に測定を行う。
　TRPV1の活性化の変化は、当技術分野で公知の方法により、例えば細胞内カルシウム濃度の変化、筋小胞体内カルシウム濃度の変化により測定することができる。具体的な方法としては、例えばカルシウムと結合することにより蛍光を発するFluo-4などを使用して、細胞内の蛍光強度を測定することによりカルシウム濃度の変化を測定することができる。
　細胞におけるTRPV1の活性化を測定した後、対照と比較し、TRPV1の活性化を増大させる被験物質又は因子を、筋増加物質又は因子として選択する。対照としては、被験物質又は因子による処置を受けていない細胞などを用いることができる。
　また、本発明においては、一次スクリーニングとして、細胞を被験物質又は因子で処置し、該細胞におけるTRPV1の活性化の増大を示した被験物質又は因子を選択し、次に二次スクリーニングとして、選択した被験物質又は因子で動物を処置し、該動物の筋細胞におけるTRPV1の活性化を測定して活性化増大を示した被験物質又は因子を選択してもよい。
　さらに、筋増加物質又は因子のスクリーニングにおいては、選択された被験物質又は因子を、実験動物に投与して、被験物質又は因子が実験動物において筋増加するか否かを判定してもよい。実験動物としては、後肢懸垂、除神経、デキサメタゾン投与等により筋萎縮が誘導されたモデル動物、好ましくはマウスを用いることができる。被験物質又は因子が実験動物において筋増加するか否かの判定は、実験動物の種類などにより異なるが、当業者であれば、当技術分野で公知の方法により適宜判定することができる。例えば、動物から筋組織を採取し、その筋重量、筋断面積、筋張力を測定することができる。
　以上のようにして、本スクリーニング方法により、筋増加物質又は因子の候補を同定し、さらには筋増加物質又は因子の有効性を確認することができる。
　以下、本発明を実施例及び図面によりさらに具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を限定するものではない。
　なお、実施例に示す実験結果について、2群間のデータの比較にはstudent-t検定を用いた。また、多群間比較には、ANOVA検定を行った後、Tukey's法による多群間検定を行った。データは平均値±標準誤差を用いて示し、p < 0.05を有意差ありと判定した。
［実施例１］
　筋肥大時に機能するカルシウムチャネルを同定するため、一酸化窒素（NO）によって活性化されることが報告されているTRPチャネルに注目した。また、細胞内カルシウム濃度の上昇により、タンパク質合成系を制御するmTORが活性化することが報告されている。そのため、各種TRPチャネルのアゴニストをマウスに筋注し、mTORの下流分子であるp70S6kのリン酸化を指標としてmTORの活性化を解析した。
　対象には、日本クレア（日本）より購入したC57BL/6マウス、及びJackson Laboratories（Wilmington,　MA）より購入したTRPV1欠損型マウスを用いた。TRPチャネルアゴニストとして、タプシガルジン（Thapsigargin：20μM, Calbiochem）、OAG（10μM, Calbiochem）、Hyp9（10μM, Sigma-Aldrich）、カプサイシン（capsaicin：10μM, Sigma-Aldrich）、オルバニル（olvanil：10μM, Sigma-Aldrich）、2-APB（10μM, Sigma-Aldrich）、RN-1734（10μM, Sigma-Aldrich）及びBAPTA-AM（50μM, Calbiochem）をC57BL/6マウスに筋注にて投与した。TRPV1欠損型マウスには、capsaicin（10μM, Sigma-Aldrich）のみを筋注にて投与した。
　マウスを安楽死させ、足底筋を凍結固定した。凍結後、薄切した足底筋をサンプルバッファー（0.1％Triton X-100, 50 mM HEPES (pH7.4), 4 mM EGTA, 10 mM EDTA, 15 mM Na4P2O7, 100 mM glycerophosphate, 25 mM NaF, 5 mM Na2VO4, 及びコンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル (Roche)）でホモジナイズし、遠心分離（15,000g，10分間）後に上澄を採取した。Coomassie Brilliant Blue G-250（BioRad, CA, USA）を用いてタンパク質濃度を測定した後、等量のサンプルローディングバッファー（30％glycerol, 5％2-mercaptoethanol, 2.3％SDS, 62.5 mM Tris-HCl (pH6.8), 0.05％bromophenol blue）と混ぜ、60℃で15分間の熱変性を行い、30μgをウエスタンブロットに供した。PVDF転写膜はトリス緩衝生理食塩水（TBS）＋5％スキムミルク（雪印）でブロッキングを行い、1次抗体を用いて4℃で16時間のインキュベーションを行った。1次抗体にはAkt（#9272, Cell Signaling Technology）、p-Akt（Ser473）（#9271, Cell Signaling Technology）、p70S6K（#9202, Cell Signaling Technology）、及びp-p70S6K（Thr389）（#9205, Cell Signaling Technology）を用いた。転写膜を0.1％Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水（TBST）で洗浄後、2次抗体（ウサギ特異的HRP標識抗体、GE Healthcare）でインキュベートを行い、再度TBSTで洗浄し、ECL Western Blotting Detection System（GE HealthCare, Buckinghamshire, UK）で検出した。
　その結果、TRPV1チャネルのアゴニストであるcapsaicin及びそのアナログであるolvanilによってp70S6Kがリン酸化されており、mTORが活性化されることがわかった（図1のA）。また、他のTRPVチャネルのmTORへの寄与を調べるため、TRPV2のアゴニストである2-APB、TRPV4のアゴニストであるRN-1734を投与したが、mTORの活性化は見られなかった（図1のB）。一方、capsaicin投与によるmTORの活性化は、カルシウムキレート剤であるBAPTA-AMの共投与により抑制された（図1のC）。このことから、TRPV1を介した細胞内カルシウム濃度の上昇により、筋肥大に関与するmTORが活性化されることがわかった。また、TRPV1アゴニストを用いることにより、筋肥大に関与するmTORが活性化されることが示された。さらに、TRPV1欠損型マウス（TRPV1-/-）では、TRPV1野生型マウス（TRPV1+/+＝C57BL/6）で確認されたcapsaicinによるmTORの活性化が失われることが明らかとなった（図1のD）。この結果は、本実施例で確認されたcapsaicinによるmTORの活性化がTRPV1を介していることを示している。
［実施例２］
　筋肥大におけるTRPV1の機能を明らかにするため、マウスに後肢共働筋切除を行い、過負荷による代償性筋肥大を誘導した。対象として、12週齢のJackson Laboratories（Wilmington, MA）より購入したnNOS欠損型マウス及びTRPV1欠損型マウス、並びに日本クレア（日本）より購入したC57BL/6マウスを使用し、これらのマウスの腓腹筋及びヒラメ筋の腱を麻酔下で切除し、過負荷による代償性筋肥大を誘導した（Adams, G. R. & Haddad, F. J Appl Physiol 81, 2509-2516 (1996)）。対照群には皮膚を切る偽手術（sham）を施した。
　この後肢共働筋切除の前に、カプサゼピン（capsazepine：10μM, Sigma-Aldrich）、カプサイシン（capsaicin：10μM, Sigma-Aldrich）、及びBAPTA-AM（50μM, Calbiochem）を筋注にて投与した。またFeTPPS（20 mg/ml, Calbiochem）は過負荷30分前に腹腔内投与した。
　TRPV1のアンタゴニストであるcapsazepineを術前に投与した結果、術後7日の筋重量が対照群と比べ有意に低下した（図2のA）。一方、TRPV1欠損型マウスは、TRPV1野生型マウスと比較すると過負荷により誘導される代償性筋肥大が有意に低減することが示された（図2のB）。また、nNOS欠損型マウスは、過負荷による筋肥大の進行が減弱するという表現型を示す（データ示さず）が、この表現型はcapsaicin投与により回復し、その効果はBAPTA-AM（カルシウムキレート剤）の共投与により抑制された（図2のC）。さらに、peroxynitrite消去剤であるFeTPPS投与群における表現型も、capsaicin投与によって回復され、その効果はBAPTA-AMの共投与により抑制された（図2のD）。これらの結果から、NO/peroxynitriteがTRPV1を介した細胞内カルシウム濃度制御により筋肥大を促進することが示唆された。
［参考例１］
　筋芽細胞における細胞内カルシウム濃度の変化をin vitroにおいて解析した。具体的には、筋芽細胞株であるC2C12（RCB0987、理研バイオリソースセンターセルバンク）を成長培地（DMEM, 10％ウシ胎児血清, 1％ペニシリン-ストレプトマイシン）で37℃、5％CO2濃度で培養した。その後、分化培地（DMEM, 2％ウマ血清, 1％ペニシリン-ストレプトマイシン）で2日間培養し、筋分化を誘導した。細胞内カルシウム濃度の変化はカルシウム指示薬であるFluo-4（DOJINDO）を用いて計測した。筋分化を誘導したC2C12をPSS溶液（140mM NaCl, 5mM KCl, 2.5mM CaCl2, 1mM MgCl2, 10mM HEPES, 10mM glucose pH7.0）にて6時間以上培養した後、8μMのFluo-4を添加し、30分間室温で培養した。過剰なFluo-4を取り除き、37℃にて5分間培養した後、SIN-1（DOJINDO）による蛍光強度の変化を倒立蛍光顕微鏡（Olympus）を用いて3秒おきに計測した。細胞外カルシウムを取り除く場合、SIN-1を0 Ca2+溶液（細胞外のCa2+を完全に取り除き、さらにEGTAを加えた溶液;140mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl2, 10mM HEPES, 10mM glucose, 2mM EGTA pH7.0）を用いて、細胞に添加した。また、SIN-1による処理の際に、peroxynitrite消去剤であるFeTPPS（calbiochem）を100μMの濃度でSIN-1と一緒に添加した。筋小胞体のカルシウムを枯渇させる場合、Fluo-4と共にthapsigargin（Calbiochem, 2μM）を加えた。
　その結果、NO/peroxynitrite供与剤であるSIN-1で細胞を処理した直後から細胞内カルシウム濃度が上昇した（図3A及び図3B）。この細胞内カルシウム濃度の上昇は濃度依存的であり（図3C）、peroxynitrite消去剤であるFeTPPSにより阻害された（図3D）。これらの結果から、peroxynitriteは細胞内カルシウム濃度を上昇させることがわかった。
　細胞内カルシウム濃度の上昇は、細胞外のカルシウムの取り込み、又は細胞内筋小胞体に貯蔵されているカルシウムの放出によって起こる。細胞外のカルシウムを取り除く（0 Ca2+）、又はthapsigarginにより筋小胞体内のカルシウムを枯渇させた。その結果、SIN-1による細胞内カルシウム濃度の上昇は筋小胞体内カルシウムの枯渇によって抑制された（図4A及び図4B）。これらの結果から、peroxynitriteは筋小胞体からのカルシウム放出を誘導することがわかった。
［実施例３］
　筋小胞体からのカルシウムの放出はリアノジン受容体、IP3受容体等が制御していることが知られている。また、TRPV1が筋小胞体に局在していることが過去に報告されている（Xin, H. et al. Biochem Biophys Res Commun 332, 756-762, (2005)）。参考例１の実験結果を参照して、peroxynitriteによる細胞内カルシウム濃度の上昇が筋小胞体に局在するTRPV1を介したものかを検討した。具体的な実験手順は参考例１と同様であり、リアノジン受容体、IP3受容体を阻害するために、ダントロレン（dantrolene：10μM, Calbiochem）及びヘパリン（heparin：4mg/ml, Sigma-Aldrich）をそれぞれ加えた。細胞膜におけるTRPV1を阻害するためにルテニウムレッド（ruthenium red：10μM, Sigma-Aldrich）を、また細胞膜及び筋小胞体におけるTRPV1を阻害するためにカプサゼピン（capsazepine：10μM, Sigma-Aldrich）を加えた。
　その結果、この細胞内カルシウム濃度の上昇はリアノジン受容体の阻害剤であるdantrolene及びIP3受容体の阻害剤であるheparinによっては阻害されず、TRPV1の阻害剤であるcapsazepineによって阻害された（図5A、図5B、図5C）。また、capsazepineは細胞膜を透過することで、細胞膜及び筋小胞体に局在するTRPV1を阻害するが、ruthenium redは細胞膜を透過せず、細胞膜に局在するTRPV1のみを阻害する。ruthenium redはこの細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制しなかった（図5A）ことから、peroxynitriteは筋小胞体に局在するTRPV1を介して細胞内カルシウム濃度を上昇させることがわかった。
［実施例４］
　capsaicin投与によるmTORの活性化を、過負荷及び運動によるmTORの活性化と比較した。対象には、日本クレア（日本）より購入したC57BL/6マウス、及びJackson Laboratories（Wilmington, MA）より購入したTRPV1欠損型マウスを用いた。
　過負荷（overload）は、実施例２に記載のように後肢共働筋切除により行った。マウスに運動負荷（exercise）をかけるため、トレッドミル（MK-680S,室町機械）を用いた。初速5m/minにて5分走らせた後、1分置きに1m/minずつ速度を上げていき、速度20m/minまで速度を上げた。合計30分走らせた後、腓腹筋を回収し、解析を行った。mTOR活性化の測定は、実施例１に記載のように行った。また筋線維断面積は、薄切切片を抗ラミニンα2抗体（invitrogen）にて免疫染色を行った後、KEYENCE蛍光顕微鏡及び付属ソフトを用いて計測した。筋張力は、長指伸筋を用いて測定した。具体的には、マウス長指伸筋を単離し、PSS溶液（KCl 4mM, CaCl2 1.8mM, MgCl2 1mM, Hepes 5mM, NaCl 150mM, glucose 5.6mM, pH7.4）内にて電気刺激を加えた。電気刺激にはSEN-3301（日本光電）を用いた。電子刺激により生じた筋収縮をWR300サーマルアレイコーダー（Graphtec）を用いて計測し、筋張力を測定した。
　その結果、capsaicin投与によるmTORの活性化は、過負荷及び運動によるmTORの活性化に匹敵した（図６A）。このことは、TRPV1を活性化させるだけで、運動負荷と同様の効果が得られることを示している。またTRPV1野生型マウスであるC57BL/6マウスにcapsaicinを1日2回、1週間投与した結果、腓腹筋、ヒラメ筋及び足底筋の筋重量が増加し、筋断面積が増加した（図6B、図6C）。一方、TRPV1欠損型マウスにcapsaicinを同様に1日2回、1週間投与した結果、筋重量の増加は、腓腹筋、ヒラメ筋及び足底筋のいずれも認められなかった（図６D）。また筋機能を評価するため、筋張力を測定した結果、capsaicin投与群は単収縮力（twitch force）が増加する傾向にあり、また強縮力（tetanic force）、及び単位面積当たりの強縮力（specific force）が有意に増加した（図6E）。これらの結果から、capsaicin投与によりTRPV1を介して筋肥大が誘導され、筋重量のみならず、筋機能も増強されることがわかった。
［実施例５］
　TRPV1をターゲットとした筋萎縮の治療効果を検討するため、坐骨神経切除及び後肢懸垂を行い、除神経及び脱負荷による筋萎縮を誘導した。具体的には、脱負荷による筋萎縮として、12週齢マウスの後肢が床から1mm以上離れるように飼育することで、廃用性筋萎縮を誘導した（非特許文献３）。また、除神経による筋萎縮として、12週齢マウスの坐骨神経を切除することで、神経原性の筋萎縮を誘導した（Moresi, V. et al. Cell 143, 35-45, (2010)）。それぞれの筋萎縮誘導の2週間後、腓腹筋及びヒラメ筋を摘出し、筋重量及び筋線維断面積を計測した。
　2週間後の筋重量を測定した結果、対照群は除神経及び脱負荷により筋萎縮が誘導されたが、capsaicin投与群は筋重量の低下が減弱された（図7A）。また、カプサイシン投与群は、対照群と比べ、筋断面積も増加した（図7B）。
　実施例１～５の結果から、NO/peroxynitriteはTRPV1チャネルによる細胞内カルシウム濃度の制御を介して、mTORを活性化し、筋肥大を促進することが示唆された（図8）。またTRPV1のアゴニストを投与することで、人為的に筋肥大を促進、また筋萎縮を治療できる可能性があると考えられる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (8)

  1. 　TRPV1アゴニストを有効成分として含むことを特徴とする筋増加剤。
  2. 　筋肥大の促進、筋萎縮の防止、筋力の増加又は筋力の維持のための、請求項１に記載の筋増加剤。
  3. 　TRPV1アゴニストを有効成分として含むことを特徴とする、筋萎縮を生じる疾患又は障害の治療又は予防剤。
  4. 　TRPV1アゴニストが、細胞膜を貫通することができるものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の剤。
  5. 　TRPV1アゴニストが、カプサイシノイド及びカプシノイドからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１～４のいずれか１項に記載の剤。
  6. 　TRPV1アゴニストが、カプサイシン若しくはオルバニル、又はこれらの塩、エステル若しくはプロドラッグである、請求項１～５のいずれか１項に記載の剤。
  7. 　筋増加物質又は因子のスクリーニング方法であって、
    （a）TRPV1を発現する細胞を、被験物質又は因子で処置するステップ、
    （b）該細胞におけるTRPV1の活性化の変化を測定するステップ、
    （c）TRPV1の活性化が増大する場合に被験物質又は因子を筋増加物質又は因子の候補として同定するステップ
    を含む方法。
  8. 　TRPV1の活性化の変化を、細胞内カルシウム濃度の変化又は筋小胞体内カルシウム濃度の変化により測定する、請求項７に記載の方法。
PCT/JP2013/057651 2012-03-21 2013-03-18 筋増加剤、及び筋増加物質のスクリーニング方法 WO2013141202A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012063182 2012-03-21
JP2012-063182 2012-03-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013141202A1 true WO2013141202A1 (ja) 2013-09-26

Family

ID=49222659

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/057651 WO2013141202A1 (ja) 2012-03-21 2013-03-18 筋増加剤、及び筋増加物質のスクリーニング方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2013141202A1 (ja)
WO (1) WO2013141202A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017179225A1 (ja) * 2016-04-13 2017-10-19 味の素株式会社 加齢に伴う身体機能低下もしくは身体機能障害、または加齢に伴う精神機能低下もしくは精神機能障害の抑制または改善用組成物
US10656141B2 (en) 2014-01-23 2020-05-19 Biogaia Ab Selection of agents modulating gastrointestinal pain

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011006073A1 (en) * 2009-07-10 2011-01-13 President And Fellows Of Harvard College Permanently charged sodium and calcium channel blockers as anti-inflammatory agents

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011006073A1 (en) * 2009-07-10 2011-01-13 President And Fellows Of Harvard College Permanently charged sodium and calcium channel blockers as anti-inflammatory agents

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ITO N ET AL.: "Activation of calcium signaling through Trpvl by nNOS and peroxynitrite as a key trigger of skeletal muscle hypertrophy", NATURE MEDICINE, vol. 19, no. 1, January 2013 (2013-01-01), pages 101 - 106 *
KEISUKE KAWAKAMI ET AL.: "Kin Saisei to Rigaku Ryoho Undo, Kaju, Shincho ga Kin Ishuku Yobo ni Ataeru Koka to sono Mechanism", THE JAPANESE JOURNAL OF PHYSICAL THERAPY, vol. 43, no. 7, 15 July 2009 (2009-07-15), pages 581 - 590 *
KEISUKE KAWAKAMI: "Mechanism of muscular hypertrophy and suppressing muscle atrophy with mechanical stimulus", NIPPON BUTSURI RYOHO GAKKAI KAISHI, vol. 18, 2011, pages 15 - 20 *
LUO Z ET AL.: "TRPV1 activation improves exercise endurance and energy metabolism through PGC-1a upregulation in mice", CELL RESEARCH, vol. 22, 20 December 2011 (2011-12-20), pages 551 - 564, Retrieved from the Internet <URL:http://www.nature.com/cr/journal/v22/n3/pdf/cr2011205a.pdf> [retrieved on 20130612] *
TIDBALL JG: "Mechanical signal transduction in skeletal muscle growth and adaptation", JOURNAL OF APPLIED PHYSIOLOGY, vol. 98, no. 5, 2005, pages 1900 - 1908 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10656141B2 (en) 2014-01-23 2020-05-19 Biogaia Ab Selection of agents modulating gastrointestinal pain
US11371985B2 (en) 2014-01-23 2022-06-28 Biogaia Ab Selection of agents modulating gastrointestinal pain
WO2017179225A1 (ja) * 2016-04-13 2017-10-19 味の素株式会社 加齢に伴う身体機能低下もしくは身体機能障害、または加齢に伴う精神機能低下もしくは精神機能障害の抑制または改善用組成物
JPWO2017179225A1 (ja) * 2016-04-13 2019-02-14 味の素株式会社 加齢に伴う身体機能低下もしくは身体機能障害、または加齢に伴う精神機能低下もしくは精神機能障害の抑制または改善用組成物

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2013141202A1 (ja) 2015-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220168324A1 (en) Cancer therapy
Chen et al. Endogenous Nampt upregulation is associated with diabetic nephropathy inflammatory‑fibrosis through the NF‑κB p65 and Sirt1 pathway; NMN alleviates diabetic nephropathy inflammatory‑fibrosis by inhibiting endogenous Nampt
Kishida et al. Go-sha-jinki-Gan (GJG), a traditional Japanese herbal medicine, protects against sarcopenia in senescence-accelerated mice
Colitti et al. Nutraceuticals and regulation of adipocyte life: premises or promises
Negro et al. Effects of 12 weeks of essential amino acids (EAA)-based multi-ingredient nutritional supplementation on muscle mass, muscle strength, muscle power and fatigue in healthy elderly subjects: a randomized controlled double-blind study
EP2992933B1 (en) Ginsenoside f2 for prophylaxis and treatment of liver disease
WO2013141202A1 (ja) 筋増加剤、及び筋増加物質のスクリーニング方法
JP6660668B2 (ja) Ｕｃｐ−１発現促進剤
WO2018206719A1 (en) Compounds for upregulating ucp1 expression and promoting transdifferentiation into brown adipose tissue
KR102324725B1 (ko) 포스포리파아제 d2 억제제를 포함하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
Niu et al. Adiponectin pathway attenuates malignant mesothelioma cell growth
JP6553375B2 (ja) Ｕｃｐ−１発現促進剤
KR20120058047A (ko) 스핑고신-1-포스페이트（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ） 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR20150086429A (ko) 오스모틴을 포함하는 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 이를 이용한 신경 질환의 예방 또는 치료 방법
US10765720B2 (en) Composition for preventing or treating hyperoxia-induced lung injury comprising WKYMVm peptide as an active ingredient
KR102118953B1 (ko) 골손실의 완화, 치료 또는 예방용 약학조성물 및 건강기능식품
US20230293482A1 (en) Central nervous system potentiating composition
JP6533412B2 (ja) ＦｏｘＯ３ａリン酸化阻害試薬
JP2014152149A (ja) Ａｍｐキナーゼ活性化剤及びその用途
KR20230061243A (ko) 미토콘드리아 활성산소 수준을 감소시키는 신규 화합물 및 이의 용도
WO2013038740A1 (ja) 筋肥大を促進する物質又は因子のスクリーニング方法
WO2023192259A1 (en) Synergy for increasing insulin sensitivity
KR20190125068A (ko) 6&#39;-o-아세틸 만지페린을 포함하는 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 개선용 조성물
CN116173045A (zh) 甘油磷脂类化合物在预防和治疗高血脂、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝和肥胖中的用途
JP2011037732A (ja) Ａｍｐキナーゼ活性化剤及びその用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13764354

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014506226

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 18/03/2015)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13764354

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1