JP6553375B2

JP6553375B2 - Ｕｃｐ−１発現促進剤

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Publication number: JP6553375B2
Application number: JP2015042638A
Authority: JP
Inventors: 里美木内; 村瀬　孝利; 孝利村瀬
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2015-03-04
Publication date: 2019-07-31
Anticipated expiration: 2035-03-04
Also published as: JP2016027013A

Description

本発明は、褐色脂肪化を促し、ＵＣＰ−１の発現を促進する、ＵＣＰ−１発現促進剤に関する。

従来、脂肪は白色脂肪（ｗｈｉｔｅａｄｉｐｏｓｅ）と褐色脂肪（ｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｓｅ）とに大別されてきた。白色脂肪は、白色脂肪細胞中に過剰なエネルギーを単房性の脂肪滴の形態で貯蔵し、栄養状態に応じて脂肪酸を放出する器官である。褐色脂肪に多い褐色脂肪細胞は、多くのミトコンドリアを有し、特異的にＵＣＰ−１（脱共役タンパク質（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）−１）が多く発現しており、エネルギーを熱の形で放散する特性を有している。

ＵＣＰは、ミトコンドリア内膜での酸化的リン酸化反応を脱共役させ、エネルギーを熱として散逸する機能を持っている。褐色脂肪細胞の代表的なＵＣＰであるＵＣＰ−１は、近年の研究により、その発現量の増加が熱産生を促進させ、その結果としてエネルギーの消費を増大させ、脂肪蓄積や肥満、糖尿病を抑制することに繋がることが明らかとなり、褐色脂肪化が肥満やメタボリックシンドロームの予防、改善の観点から注目されている（非特許文献１）。

一方、ＰＰＡＲγ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ-ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ γ）は、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）の一種であり、その活性化により糖尿病やインスリン抵抗性を予防・改善することが知られている（非特許文献２）。例えば、ＰＰＡＲγアゴニストであるピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）やロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）は２型糖尿病薬として利用されている（非特許文献３）。

他方、Ｓｍａｄファミリーは、ＴＧＦβ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒβ）ファミリー分子の刺激によってリン酸化を受け、核にそのシグナルを伝達する細胞内情報伝達因子である。また、Ｓｍａｄ３特異的な阻害剤であるＳＩＳ３（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＳｍａｄ３）は、ＴＧＦβに起因する組織の線維化を予防、改善する薬剤として期待されている（非特許文献４）。また、近年、Ｓｍａｄ３欠損マウスが食餌性肥満及び糖尿病に対して耐性を示すことより、このＴＧＦβ／Ｓｍａｄ３シグナル伝達経路がグルコース及びエネルギーの恒常性に関与する可能性が示唆されており、肥満及び糖尿病予防、改善におけるＴＧＦβ制御法の適用が検討されている（非特許文献５）。一方で、Ｓｍａｄ３欠損マウスにおいては、血中トリグリセリドレベルはむしろ増加し、インスリンも増加するという報告もされている（非特許文献６）。

Patrick Seale et al., DIABETES, VOL. 58, 1482-1484, JULY 2009 Michael Lehrke et al., Cell 123, 993-999, December 16, 2005 Steven M. Watkins et al., Journal of Lipid Research Volume 43, 1809-1817, 2002 Masatoshi Jinnin et al., Mol Pharmacol 69, 597-607, 2006 Hariom Yadav et al., Cell Metabolism 14, 67-79, July 6, 2011 Chek Kun Tan et al., Diabetes, 60, 464-476, 2011

本発明は、優れたＵＣＰ−１発現促進作用を有し、褐色脂肪化（褐色化とも称する）を促すＵＣＰ−１発現促進剤を提供することに関する。

本発明者らは、上記課題に鑑み検討したところ、ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤とを組み合わせて使用した場合に、ＵＣＰ−１の発現を有意に促進して、褐色脂肪化を促し、斯かる組み合わせがエネルギー消費促進、体脂肪蓄積抑制、肥満の予防又は改善、高脂血症抑制、糖尿病の予防または改善の各効果を発揮し得る医薬品、医薬部外品、皮膚外用剤、食品等の素材として有用であることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（８）に係るものである。
（１）ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなるＵＣＰ−１発現促進剤。
（２）ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる褐色脂肪化促進剤。
（３）ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなるエネルギー消費促進剤。
（４）ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる体脂肪蓄積抑制剤。
（５）ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる肥満予防又は改善剤。
（６）ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる糖尿病予防又は改善剤。
（７）ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる高脂血症予防又は改善剤。
（８）ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせて摂取又は投与すること、又はＰＰＡＲγ活性化剤の摂取又は投与とＳｍａｄ３を阻害するための処置を組み合わせることを特徴とする、非治療的ＵＣＰ−１発現促進方法、非治療的褐色脂肪化促進方法、非治療的エネルギー消費促進方法、非治療的体脂肪蓄積抑制方法、非治療的肥満予防又は改善方法、非治療的糖尿病予防又は改善方法、又は非治療的高脂血症予防又は改善方法。

本発明によれば、優れたＵＣＰ−１発現促進作用及び褐色脂肪化作用を有し、エネルギー消費促進、体脂肪蓄積抑制、肥満の予防又は改善、糖尿病の予防又は改善、高脂血症の予防又は改善等のために有用な、医薬品、医薬部外品若しくは皮膚外用剤、或いは医薬品、医薬部外品、皮膚外用剤又は食品に使用される素材及び方法を提供できる。したがって、本発明によれば、ＵＣＰ−１の発現及び褐色脂肪化を促進させ、エネルギー消費の促進、体脂肪蓄積の抑制、肥満予防又は改善、糖尿病の予防又は改善、及び高脂血症の予防又は改善が可能となる。

ＵＣＰ−１発現量（ｉｎｖｉｔｒｏ）を示すグラフ。ＵＣＰ−１発現量（ｉｎｖｉｖｏ）を示すグラフ。左図：定量的ＰＣＲの結果、右図：ウエスタンブロッティングの結果鼠径部皮下脂肪におけるＵＣＰ−１の免疫組織化学の染色像を示す顕微鏡写真。糖代謝及び脂質代謝改善作用を示すグラフ。左上図：血糖値のΔＡＵＣ、左下図：インスリンのΔＡＵＣ、右上図：トリグリセリドのΔＡＵＣ、右下図：ＮＥＦＡのΔＡＵＣ。ＴＧＦβ刺激応答性のＳｍａｄ３リン酸化亢進抑制作用を示す図。（レーン左；低濃度サンプル、レーン右；高濃度サンプル）ＰＰＡＲγの活性化作用を示す図。

本発明において用いられるＰＰＡＲγ活性化剤とは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）γを活性化する物質の総称であり、ＰＰＡＲγアゴニスト或いはＰＰＡＲγリガンドともいわれる。代表的ＰＰＡＲγ活性化剤として知られるチアゾリジン誘導体は、脂肪組織において小型の脂肪細胞を増加させ、アディポネクチンなどのインスリン感受性ホルモンの分泌を促進することで、インスリン抵抗性を改善することから、広く２型糖尿病薬として利用されている。
ＰＰＡＲγ活性化剤としては、例えば下記構造式で表わされるロシグリタゾン（BRL49653）（J Biol Chem. 1995 Jun 2;270(22):12953-6.）、ピオグリタゾン（J Biol Chem. 1995 Jun 2;270(22):12953-6.）の他、ネトグリタゾン（Bone. 2006 Jan;38(1):74-84.）、ダルグリタゾン（J Pharmacol Exp Ther 305:1173-1182）、シグリタゾン（J Biol Chem. 1995 Jun 2;270(22):12953-6.）、エングリタゾン（J Biol Chem. 1995 Jun 2;270(22):12953-6.）、トログリタゾン（Eur J Biochem. 1996 Jul 1;239(1):1-7.）、リヴォグリタゾン（Ann Pharmacother. 2013 Jun;47(6):877-85.）、FK-614（Metabolism. 2005 Sep;54(9):1250-8.）、Tesaglitazar（AZ-242）（Structure. 2001 Aug;9(8):699-706.）、Ragaglitazar （J Med Chem. 2001 Aug 2;44(16):2675-8.）、Prostaglandin D2、J2、delta12-prostaglandin J2、15-Deoxy-delta 12, 14-prostaglandin J2（Cell. 1995 Dec 1;83(5):803-12.）、docosahexaenoic acid、eicosapentaenoic acid、 linolenic acid、linoleic acid、arachidonic acid（Mol Endocrinol. 1997 Jun;11(6):779-91.）、Telmisartan（Acta Diabetol. 2005 Apr;42 Suppl 1:S9-16.）、Carsonic acid (Planta Med. 2006 Aug;72(10):881-7.)、ＦＭＯＣ−Ｌ−ロイシンおよびその誘導体（特表２００４−５０１８９６号公報）、アリールオキシ酢酸置換基を有するＮ−置換インドール、デヒドロジオイゲノールＡ、デヒドロジオイゲノールＢ、マグノロール、オレアノール酸、ベツリン酸（特開２００５−９７２１６号公報）、ロスマリン酸誘導体（特開２００６−２７３７４１号公報）、モノアシルグリセロールまたはその誘導体（特開２００８−１０６０４０号公報）、ジンゲロール類またはその誘導体（特開２００８−２８５４３８号公報）、ショウガ（特開２０１０−１０６００１号公報）、ジフェニルエテン誘導体（特開２０１２−１１６７９９号公報）、炭素鎖長２０〜２２の高度不飽和脂肪酸の水酸化誘導体（国際公開第２００２／１０２３６４号）、ＧＷ１９２９（Diabetes. 1999 Jul;48(7):1415-24）、nTZDpa（Mol Endocrinol. 2003 Apr;17(4):662-76.）、乳酸菌処理物（国際公開第２０１３／０８４９７１号）、醤油粕（特開２００９−２４２３８２号公報）、クルクミン（Evid Based Complement Alternat Med. 2013;2013:470975. doi: 10.1155/2013/470975.）等が挙げられる。

また、後記参考例に示すように、ショウガ抽出物、ナツメグ抽出物、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ロベージ抽出物、エレミ抽出物、クローブ抽出物、シトロネラ抽出物、ベイ抽出物、シンナモン抽出物、ダバナ抽出物、アサの実抽出物、ケシの実抽出物、アシタバカルコンには、ＰＰＡＲγ活性化作用があることが確認されており、ショウガ又はその抽出物、ナツメグまたはその抽出物、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ロベージ及びその抽出物、エレミ又はその抽出物、クローブ又はその抽出物、シトロネラ又はその抽出物、ベイ又はその抽出物、シンナモン、又はその抽出物、ダバナ又はその抽出物、アサの実又はその抽出物、ケシの実又はその抽出物、アシタバカルコンを本発明のＰＰＡＲγ活性化剤として用いることができる。このうち、ショウガ又はその抽出物、ナツメグ又はその抽出物、ＤＨＡ、ＥＰＡ及びそれらを含有する魚油、クローブ又はその抽出物、シンナモン又はその抽出物、ベイ又はその抽出物が好ましい。

本発明において用いられるＳｍａｄ３阻害剤とは、Ｓｍａｄ３が担う細胞内シグナル伝達系の阻害作用を有する物質を意味し、例えばＳｍａｄ３のリン酸化抑制剤やＳｍａｄ３の発現抑制剤が挙げられる。また、Ｓｍａｄ３とＳｍａｄ４の相互作用を阻害する物質や、ＴＧＦβ受容体拮抗剤、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤、アクチビン受容体拮抗剤、Ｓｍａｄ３分解促進剤等もＳｍａｄ３阻害剤として挙げられる。Ｓｍａｄ３阻害剤としては、代表的にはＳｐｅｃｉｆｉｃＩｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＳｍａｄ３（ＳＩＳ３）として知られている、下記式で示される６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン又はその塩（ Molecular Pharmacology 69(2) 597-607）が挙げられるが、塩酸塩が好ましい。

その他、Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ（Pharmaceutical Research 23(1) 82-89, 2006）、ＳＢ４３１５４２（Molecular Pharmacology 62: 58-64, 2002）、ＬＹ２１５７２９９（Proc Amer Assoc Cancer Res. 2006:47. Abstract 250.）、ウルソール酸（特開２０００−１５９６７３号公報）、オレアノール酸（特開２０００−１５９７９３号公報）、ピリジルアクリル酸アミド誘導体（国際公開第９９／０５１０９号）、キナゾリン誘導体（特表２００２−５２３５０２号公報）、シクロピロパンカルボン酸アミド化合物（特開２００４−３５４７５号公報）、ピリジン／トリアジン誘導体（特表２００６−５０３０４３号公報）、ピラジン誘導体（特表２００６−５１９８３３号公報）、縮合複素芳香族化合物（特表２００６−５１９２４９号公報）、イソチアゾール誘導体（特表２００６−５１６６０３号公報）、イソチアゾール／イソキサゾール誘導体（特表２００６−５０６４４３号公報）、ピラゾール誘導体（特表２００６−５０７３５３号公報）、イミダゾール誘導体（特表２００６−５０２２３７号公報）、トリアゾール誘導体（特表２００６−５０２２３６号公報）、トリアゾール／オキサゾール誘導体（特表２００６−５０２２３５号公報）、キナゾリン誘導体（特表２００７−５１７０４６号公報）、ピリミジニルイミダゾール誘導体（特表２００８−５１１６３１号公報、特表２００８−５１１６３０号公報）、ピラゾール誘導体（特開２００９−１９７０１６号公報、特表２００９−５０２７８０号公報、特表２００４−５３５４０４号公報）、二本鎖ＲＮＡ（特表２０１１−５２７８９３号公報）、ＴＧＦβ１阻害ペプチド（特表２０１２−５１９６７１号公報、特開２０１２−２１４４８９号公報、特表２００９−５１２７２７号公報、特開２００８−５６６８５号公報、特開２００７−１８６５１９号公報）、アルコキシ−チエノピリミジン誘導体（特表２０１２−５３０７３１号公報）、イミダゾチアジアゾール誘導体（特表２０１１−５２９４５６号公報）、チエノピリミジン誘導体（特表２０１１−５１８１３２号公報）、トリアザベンゾ［ｅ］アズレン誘導体（特表２０１０−５０８３１１号公報）、トリアゾール誘導体（特表２００９−５２０７０６号公報）、ヘテロサイクル誘導体（特表２００６−５２７７２２号公報）、チアゾール誘導体（特表２００６−５２７７２０号公報）、ピラゾール湯導体（特表２００５−５３９０２６号公報）、２−フェニルピリジン−４−イルヘテロサイクル誘導体（特表２００５−５３９０００号公報）、ピリジン誘導体（特表２００５−５３７２９１号公報）、トリアゾール誘導体（特表２００５−５３８９９７号公報）、アミノチアゾール誘導体（特表２００５−５３８９９６号公報）、ベンゾオキサジノン誘導体（特表２００５−５３０８００号公報）、チアゾール誘導体（特表２００４−５２１９０３号公報）、ピラゾール誘導体（特表２００４−５２１９０１号公報）、チアゾール誘導体（特表２００４−５２３５４０号公報）、チアゾールアミン誘導体（特表２００４−５２４３０２号公報）、トリアゾール誘導体（特表２００４−５１７０６９号公報）、ピリジニルイミダゾール誘導体（特表２００３−５２４０１０号公報）、トリアリールイミダゾール誘導体（特表２００２−５４１２５３号公報）等を、Ｓｍａｄ３阻害に有効なＴＧＦβ阻害剤として挙げることができる。
また、後記参考例に示すように、植物タンニン、ルテオリン、ローズマリー抽出物、白茶抽出物、マリアアザミ抽出物、ログウッド色素、ピーナツ種皮抽出物、ライチポリフェノール、リンゴポリフェノール、ウーロン茶抽出物、及びオールスパイスには、Ｓｍａｄ３阻害作用があることが確認されており、植物タンニン、ルテオリン、ローズマリー又はその抽出物、白茶又はその抽出物、マリアアザミ又はその抽出物、ログウッド色素、ピーナツ種皮又はその抽出物、ライチポリフェノール、リンゴポリフェノール、ウーロン茶又はその抽出物、及びオールスパイスを本発明のＳｍａｄ３阻害剤として用いることができる。このうち、植物タンニン、ローズマリー又はその抽出物、オールスパイス又はその抽出物、またはルテオリンが好ましい。

ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤の好適な組み合わせとしては、ＵＣＰ−１発現誘導の点から、チアゾリジン誘導体とＳｍａｄ３阻害剤の組合せ、好ましくはロシグリタゾン（マレイン酸ロシグリタゾン）又はピオグリタゾンとＳＩＳ３の組み合わせ、さらに好ましくはロシグリタゾン（マレイン酸ロシグリタゾン）とＳＩＳ３の組み合わせが挙げられる。

また、Ｓｍａｄ３を阻害するための処置としては、Ｓｍａｄ３が担う細胞内シグナル伝達系を阻害するための処置、例えばＳｍａｄ３のリン酸化抑制やＳｍａｄ３の発現抑制を行うための処置が挙げられ、具体的には、温熱処置（特開２００９−２２６０６９号公報）等が挙げられる。

本発明のＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなるＵＣＰ−１発現促進剤、褐色脂肪化促進剤、エネルギー消費促進剤、体脂肪蓄積抑制剤、肥満予防又は改善剤、糖尿病予防又は改善剤、及び高脂血症予防又は改善剤は、配合剤として、それぞれの有効量を適当な配合比において一の剤型に製剤化したものでも、またそれぞれの有効量を含有する薬剤を単独に製剤化したものを同時に又は間隔を空けて別々に使用できるようにしたキットであってもよいが、同時摂取が好ましい。また、Ｓｍａｄ３を阻害するための処置は、ＰＰＡＲγ活性化剤の投与と同時に又は間隔を空けて行ってもよいが、好ましくは剤の投与と同時に処置を行う。

また、ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせて配合剤とする場合、その配合比率は、素材、用途又は製剤の種類に応じて適宜選択することができるが、概ね、ＰＰＡＲγ活性化剤：Ｓｍａｄ３阻害剤が、１：０．００１〜１００００、好ましくは１：０．０１〜１０００、さらに好ましくは１：０．０２〜１００である。

後記実施例に示すように、ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤とを組み合わせて、ラット皮下脂肪由来培養細胞に添加した場合、ＵＣＰ−１遺伝子の発現が有意に増加し、また、ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤とを組み合わせてラットに投与した場合に、皮下脂肪においてＵＣＰ−１遺伝子の発現が有意に増加し、その効果は、ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤をそれぞれ単独で添加又は投与した場合に得られる効果の相加を超え、相乗的効果であると云える。
すなわち、ＰＰＡＲγ活性化剤と、Ｓｍａｄ３阻害剤或いはＳｍａｄ３を阻害する処置との併用は、ＵＣＰ−１発現を促進するため或いは脂肪細胞を褐色化するために使用すること、例えばＵＣＰ−１発現促進剤又は褐色脂肪化促進剤として使用することができ、また、当該ＵＣＰ−１発現促進剤又は褐色脂肪化促進剤を製造するために使用することができる。

また、ＵＣＰ−１の発現が促進されることにより、熱産生が促進され、その結果としてエネルギーの消費が増大し、脂肪蓄積や肥満を抑制すると考えられており（前記非特許文献１）、実際に、ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせて使用した場合に、血糖値、血中インスリン値、中性脂肪（ＴＧ）値、ＮＥＦＡ（脂肪酸）値が顕著に低下し、糖代謝改善作用及び脂質代謝改善作用が認められている（実施例２）。したがって、Ｓｍａｄ３阻害剤或いはＳｍａｄ３を阻害するための処置との併用は、エネルギー消費促進、体脂肪蓄積抑制、肥満予防又は改善、糖尿病予防又は改善、高脂血症予防又は改善のために使用すること、例えばエネルギー消費促進剤、体脂肪蓄積抑制剤、肥満予防又は改善剤、糖尿病予防又は改善剤、高脂血症予防又は改善剤として使用することができ、また、当該エネルギー消費促進剤、体脂肪蓄積抑制剤、肥満予防又は改善剤、糖尿病予防又は改善剤、及び高脂血症予防又は改善剤を製造するために使用することができる。

尚、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。ここで、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。

ここで、「ＵＣＰ−１の発現促進」とは、ＵＣＰ−１ｍＲＮＡへのＵＣＰ−１遺伝子の転写を誘導又は促進すること、ＵＣＰ−１タンパク質へのＵＣＰ−１ｍＲＮＡの翻訳を誘導又は促進することが挙げられる。
また、「褐色脂肪化促進」とは、白色脂肪の褐色脂肪化を誘導又は促進する、あるいは、前駆脂肪細胞から褐色脂肪（細胞）への分化を誘導又は促進することを意味し、「褐色脂肪化」とは、白色脂肪の形質が褐色脂肪に特徴的な形質に転化する、あるいは前駆脂肪細胞から褐色脂肪（細胞）に特徴的な形質を有する脂肪細胞を誘導することをいう。具体的には、組織学的には、褐色脂肪細胞に特異的な細胞径の小型化、あるいは多房性の中性脂肪蓄積構造などを呈する、あるいはミトコンドリアが増加する、あるいは、ｍＲＮＡまたは蛋白質レベルで、褐色脂肪細胞のマーカー分子として知られるＵＣＰ−１を発現していることが挙げられる。

尚、本発明において、「褐色脂肪（細胞）」には、「古典的褐色脂肪（細胞）」の他に「Ｂｅｉｇｅ脂肪（細胞）」或いは「Ｂｒｉｔｅ脂肪（細胞）」と呼ばれる脂肪（細胞）も含まれるものとし（篠田幸作、梶村真吾：細胞工学 Vol.32,No.7,769-773,2013）、「褐色脂肪化」には「古典的褐色脂肪化」、「Ｂｅｉｇｅ脂肪化」、「Ｂｒｉｔｅ脂肪化」も含まれるものとする。

従って、本発明のＵＣＰ−１発現促進剤、褐色脂肪化促進剤、エネルギー消費促進剤、体脂肪蓄積抑制剤、肥満予防又は改善剤、糖尿病予防又は改善剤、及び高脂血症予防又は改善剤（以下、「ＵＣＰ−１発現促進剤等」と称する）を含む組成物は、ＵＣＰ−１の発現促進、脂肪細胞の褐色化、エネルギー消費促進、体脂肪蓄積抑制、肥満の予防又は改善、糖尿病の予防又は改善、高脂血症予防又は改善の各効果を奏する医薬品、医薬部外品、皮膚外用剤、食品となり、ＵＣＰ−１発現促進剤等は、医薬品、医薬部外品、皮膚外用剤若しくは食品へ配合するための素材又は製剤として有用である。

上記医薬品（医薬部外品も含む）の剤形は、例えば注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、各種外用剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の何れでもよく、投与形態も、経口投与（内用）、非経口投与（外用、注射）の何れであってもよい。このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、例えば本発明のＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤、他の薬効成分等を適宜組み合わせて用いることができる。

上記皮膚外用剤（医薬部外品も含む）は、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の皮膚外用剤は、例えば本発明のＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤と、皮膚外用剤に配合され得る、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。

上記医薬品や皮膚外用剤（医薬部外品も含む）に配合可能な薬効成分としては、例えば、ビタミン類、脂肪代謝促進作用が知られている薬物或いは天然物（例えば、キサンチン誘導体、α−アドレナリン作用抑制薬、ＰＰＡＲα活性化剤、ＰＰＡＲδ活性化剤、ビピリジン誘導体、イソフラボン酸、グレープフルーツオイル、ヌートカトン、カフェイン、唐辛子又はそのエキス、カプサイシン又はその類縁体、レスベラトロール、カテキン類、ココアポリフェノール、コーヒーポリフェノール、クロロゲン酸、フェルラ酸、ケルセチン、ヘスペリジン及びその配糖体、アスタキサンチン、αリポ酸、リン脂質等）等が挙げられる。

上記医薬品や皮膚外用剤（医薬部外品も含む）におけるＰＰＡＲγ活性化剤の含有量は、通常、製剤全質量の０．０１質量％以上、好ましくは０．１質量％以上、更に好ましくは１．０質量％以上であり、そして９５質量％以下、好ましくは８０質量％以下、更に好ましくは６０質量％以下である。また、０．０１〜９５質量％、好ましくは０．１〜８０質量％、更に好ましくは１．０質量％〜６０質量％が挙げられる。
また、Ｓｍａｄ３阻害剤の含有量は、製剤全質量の０．０１質量％以上、好ましくは０．１質量％以上、更に好ましくは１．０質量％以上であり、そして９５質量％以下、好ましくは８０質量％以下、更に好ましくは６０質量％以下である。また、０．０１〜９５質量％、好ましくは０．１〜８０質量％、更に好ましくは１．０質量％〜６０質量％が挙げられる。

また、上記食品には、エネルギー消費促進、体脂肪蓄積抑制、肥満予防又は改善、糖尿病予防又は改善、高脂血症予防又は改善等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した、病者用食品、栄養機能食品、保健食品又は特定保健用食品等の機能性食品が包含される。

食品の形態は、固形、半固形または液状であり得る。食品の例としては、パン類、麺類、クッキー等の菓子類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、でんぷん加工製品、加工肉製品、その他加工食品、お茶やコーヒー飲料、果実飲料、炭酸飲料、ゼリー状飲料等の飲料、スープ類、調味料、栄養補助食品等、及びそれらの原料が挙げられる。
また食品は、サプリメントのように、上記の経口投与製剤と同様、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。

斯かる食品は、任意の飲食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、増粘剤、固着剤、分散剤、湿潤剤等を適宜組み合わせて配合し、調製することができる。また、ビタミン類、脂肪代謝促進作用が知られている薬物或いは天然物（例えば、イソフラボン酸、グレープフルーツオイル、ヌートカトン、カフェイン、唐辛子又はそのエキス、カプサイシン又はその類縁体、レスベラトロール、ココアポリフェノール、コーヒーポリフェノール、クロロゲン酸、フェルラ酸、ケルセチン、ヘスペリジン及びその配糖体、アスタキサンチン、αリポ酸、リン脂質等）等の薬効成分を適宜配合することができる。

上記の食品中のＰＰＡＲγ活性化剤の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、０．０００１質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上、更に好ましくは０．０１質量％以上であり、そして５０質量％以下、好ましくは２０質量％以下、更に好ましくは１０質量％以下である。例えば、０．０００１％〜５０質量％、好ましくは０．００１〜２０質量％、更に好ましくは０．０１〜１０質量％が挙げられる。また、Ｓｍａｄ３阻害剤の含有量は、製剤全質量の０．０００１質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上、更に好ましくは０．０１質量％以上であり、そして５０質量％以下、好ましくは２０質量％以下、更に好ましくは１０質量％以下である。例えば、０．０００１％〜５０質量％、好ましくは０．００１〜２０質量％、更に好ましくは０．０１〜１０質量％が挙げられる。

本発明のＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤の組み合わせを医薬品或いはサプリメントとして、或いは医薬品或いはサプリメントに配合して使用する場合の投与量は、ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤の種類により、また、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、ＰＰＡＲγ活性化剤として１ｍｇ以上、好ましくは５ｍｇ以上、更に好ましくは１５ｍｇ以上であり、そして１０ｇ以下、好ましくは５ｇ以下、更に好ましくは１ｇ以下である。ピオグリタゾンの場合は、通常一日あたり５ｍｇ〜４５ｍｇ、特に１５ｍｇ〜４５ｍｇ、ロシグリタゾンの場合は通常一日当り１ｍｇ〜８ｍｇ、特に４ｍｇ〜８ｍｇが好ましい。また、Ｓｍａｄ３阻害剤として、１ｍｇ以上、好ましくは５ｍｇ以上、更に好ましくは１５ｍｇ以上であり、そして１０ｇ以下、好ましくは５ｇ以下、更に好ましくは１ｇ以下である。
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。
また、投与又は摂取対象としては、それを必要としている若しくは希望している動物であれば特に限定されないが、エネルギー消費促進、体脂肪蓄積抑制、または肥満予防又は改善を必要とする若しくは希望するヒトが挙げられる。

上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
＜１＞ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなるＵＣＰ−１発現促進剤。
＜２＞ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる褐色脂肪化促進剤。
＜３＞ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなるエネルギー消費促進剤。
＜４＞ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる体脂肪蓄積抑制剤。
＜５＞ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる肥満予防又は改善剤。
＜６＞ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる糖尿病予防又は改善剤。
＜７＞ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる高脂血症予防又は改善剤。
＜８＞ＵＣＰ−１発現促進剤、褐色脂肪化促進剤、エネルギー消費促進剤、体脂肪蓄積抑制剤、肥満予防又は改善剤、糖尿病予防又は改善剤、または高脂血症予防又は改善剤を製造するためのＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤の組み合わせの使用。
＜９＞ＵＣＰ−１発現促進、褐色脂肪化促進、エネルギー消費促進、体脂肪蓄積抑制、肥満予防又は改善、糖尿病予防又は改善、または高脂血症予防又は改善に使用するためのＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤の組み合わせ。
＜１０＞ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてその有効量を投与又は摂取すること、又はＰＰＡＲγ活性化剤の摂取又は投与とＳｍａｄ３を阻害するための処置を組み合わせることを特徴とするＵＣＰ−１発現促進方法、褐色脂肪化促進方法、エネルギー消費促進方法、体脂肪蓄積抑制方法、肥満予防又は改善方法、糖尿病予防又は改善方法、または高脂血症予防又は改善方法。
＜１１＞前記＜１＞〜＜１０＞において、ＰＰＡＲγ活性化剤は、ロシグリタゾン又はピオグリタゾンである。
＜１２＞前記＜１＞〜＜１０＞において、ＰＰＡＲγ活性化剤は、ショウガ又はその抽出物、ナツメグまたはその抽出物、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エレミ又はその抽出物、クローブ又はその抽出物、シトロネラ又はその抽出物、ベイ又はその抽出物、シンナモン又はその抽出物、アシタバカルコン、ロベージ又はその抽出物、ダバナ又はその抽出物、ケシの実又はその抽出物、アサの実又はその抽出物のいずれか１以上である。
＜１３＞前記＜１＞〜＜１２＞において、Ｓｍａｄ３阻害剤は、ＳＩＳ３である。
＜１４＞前記＜１＞〜＜１２＞において、Ｓｍａｄ３阻害剤は、植物タンニン、ルテオリン、ローズマリー又はその抽出物、白茶又はその抽出物、マリアアザミ又はその抽出物、ログウッド色素、ピーナツ種皮又はその抽出物、ライチポリフェノール、リンゴポリフェノール、ウーロン茶、又はオールスパイスのいずれか１以上である。
＜１５＞前記＜８＞において、使用は非治療的使用である。
＜１６＞前記＜１０＞において、方法は非治療的方法である。
＜１７＞前記＜１０＞において、投与又は摂取の対象は、エネルギー消費促進、体脂肪蓄積抑制、肥満予防又は改善、糖尿病予防又は改善、または高脂血症予防又は改善を必要とする若しくは希望するヒトである。
＜１８＞前記＜１＞〜＜１７＞において、ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を医薬品或いはサプリメントとして経口投与する場合の成人１人当たりの１日の投与量は、ＰＰＡＲγ活性化剤として１ｍｇ以上、好ましくは５ｍｇ以上、さらに好ましくは１５ｍｇ以上、そして１０ｇ以下、好ましくは５ｇ以下、さらに好ましくは１ｇ以下であり、Ｓｍａｄ３阻害剤として、１ｍｇ以上、好ましくは５ｍｇ以上、さらに好ましくは１５ｍｇ以上、そして１０ｇ以下、好ましくは５ｇ以下、さらに好ましくは１ｇ以下である。

実施例１ＵＣＰ−１発現誘導作用（細胞）
（１）脂肪細胞の単離および培養
Ｗｉｓｔａｒラット（ＳＬＣ、♂、８週齢）を用いた。食餌は、標準固形飼料ＣＥ−２（オリエンタル酵母工業）を自由摂食させ、水道水を自由摂水させた。飼育環境は、室温を２３±２度、湿度を５５±１０％とし、明期を７〜１９時とした。
上記ラットをイソフルラン麻酔下にて開腹し、腹部皮下脂肪を摘出した。脂肪組織をメスにて細切後、０．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ溶液中に懸濁し、３７℃で１５分間インキュベートすることで細胞を分離分散させた。適宜培地を加え、速やかに１０００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を除去した。沈殿として得られた間質血管系画分（ＳＶＦ；ｓｔｒｏｍａｌｖａｓｃｕｌａｒｆｒａｃｔｉｏｎ）を培地に懸濁し、これを脂肪組織由来の前駆培養細胞とした。
培地は、１０％ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ，ＡｕｓＧｅｎｅＸ）および１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍＬｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）を使用し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下にて培養した。

（２）ＵＣＰ−１発現誘導
得られた前駆培養細胞を、Ｉ型コラーゲンにてコートした１２穴プレートに播種し、翌日ＰＰＡＲγ活性化剤（ロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）（和光純薬）、１μＭ）および／あるいはＳｍａｄ３阻害剤（ＳＩＳ３（ＳＩＧＭＡ）、１０μＭ）を添加した。

（３）定量的ＰＣＲ
ＴｏｔａｌＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて定法に従い行った。逆転写は、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡＫｉｔ（アプライドバイオシステム）を用いて定法に従い行った。
得られたｃＤＮＡ（３０ｎｇ／ｗｅｌｌ）を鋳型として、７５００ＦａｓｔＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム）を用いて定量的ＰＣＲを行った。ＵＣＰ−１遺伝子の発現量は、３６Ｂ４遺伝子発現量を内部標準として補正した。

図１より、ＵＣＰ−１の発現量は、ロシグリタゾンとＳＩＳ３を組み合わせることにより、相乗的に増加した。

実施例２ＵＣＰ−１発現誘導作用（マウス）
（１）動物およびその飼育
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＳＬＣ、♂、１０週齢）を体重が均等になるように２群に分けた。食餌は、標準固形飼料ＣＥ−２（オリエンタル酵母工業）を自由摂食させ、水道水を自由摂水させた。飼育環境は、室温を２３±２℃、湿度を５５±１０％とし、明期を７〜１９時とした。

（２）Ａｌｚｅｔ浸透圧ポンプの埋め込み手術
ソムノペンチル１／１３希釈溶液を１０ｍＬ／ｋｇ体重にて腹腔内投与した後、鎮痛剤ペンタゾシンを１ｍｇ／ｋｇ体重にて皮下注射した。背部を毛刈り後、以下の被験化合物を充填した浸透圧ポンプＡｌｚｅｔ（ＤＵＲＥＣＴ）を皮下に埋め込むことで、持続投与した。尚、各被験化合物は５０％ＤＭＳＯ／２０％エタノール／３０％水溶液に溶解して用いた。
＜被験化合物＞
第１群：対照群
第２群：ＰＰＡＲγ活性化剤（ロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）（和光純薬）、５ｍｇ／ｋｇ体重／日）＋Ｓｍａｄ３阻害剤（ＳＩＳ３（ＳＩＧＭＡ）、５ｍｇ／ｋｇ体重／日）

手術一週間後、ＵＣＰ−１発現量の解析のため、鼠蹊部皮下脂肪の採取を行った。採取組織は液体窒素を用いて即時凍結し、使用時まで−８０℃にて保存した。また、組織染色用に１０％ホルマリン溶液にて固定した。

（３）定量的ＰＣＲ
ＴｏｔａｌＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙＬｉｐｉｄＴｉｓｓｕｅＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて定法に従い行った。逆転写は、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡＫｉｔ（アプライドバイオシステム）を用いて定法に従い行った。
逆転写反応により得られたｃＤＮＡ（３０ｎｇ／ｗｅｌｌ）を鋳型として、７５００ＦａｓｔＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム）を用いて定量的ＰＣＲを行った。ＵＣＰ−１遺伝子の発現量は、３６Ｂ４遺伝子発現量を内部標準として補正した。

図２（左図）より、ＵＣＰ−１の発現量は、ロシグリタゾンとＳＩＳ３を組み合わせることにより、顕著に上昇した。

（４）ウエスタンブロッティング
組織にＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを加えホモジナイズした。３０００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心により固化した脂肪層を除去した後、１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した上清をタンパク質溶液として得た。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、１レーンあたりタンパク質１０μｇ分、４ｘＳＤＳＳａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を１／４容量含む調製サンプルに対し、９５℃で５分間熱変性をかけたものを用いた。Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ^ＴＭＰＶＤＦＭｅｍｂｒａｎｅ（ＢｉｏＲａｄ）に転写し、以下の手順でブロッキング、抗体反応を行い、ＥＣＬｐｒｉｍｅｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて感光、バンドを検出した。

５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ，１時間（室温）
↓ ＴＢＳ−Ｔにて洗浄
一次抗体／ＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌＴＭｓｏｌｕｔｉｏｎ１（ＴＯＹＯＢＯ），Ｏ／Ｎ（４℃）
↓ ＴＢＳ−Ｔにて洗浄
二次抗体／ＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌＴＭｓｏｌｕｔｉｏｎ２（ＴＯＹＯＢＯ），１時間（室温）
↓ ＴＢＳ−Ｔにて洗浄
検出
※ ＴＢＳ−Ｔ; ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴｒｉｓＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）

Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ：ＲＩＰＡｂｕｆｆｅｒ（ＳＩＧＭＡ）、Ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｅｒｃｏｃｋｔａｉｌ（１／１０００量、ＳＩＧＭＡ）
一次抗体：ａｎｔｉ−ＵＣＰ−１（Ａｂｃａｍ ♯２３８４１），１０００倍希釈
ａｎｔｉ−α−ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ ♯２１４４），１０００倍希釈
二次抗体：ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔＩｇＧ, ＨＲＰｌｉｎｋｅｄ（ＧＥヘルスケア），１０００倍希釈

図３（右図）より、ＵＣＰ−１の発現量は、ロシグリタゾンとＳＩＳ３を組み合わせることにより、顕著に増加した。

（５）ＵＣＰ−１の免疫組織化学的染色
以下のプロトコルに従い、鼠蹊部皮下脂肪について、ＵＣＰ−１の免疫組織化学的染色を行った。組織の固定には、１０％ホルマリン溶液を用いた。抗体はａｎｔｉ−ＵＣＰ−１（ａｂｃａｍ ♯２３８４１）を用いた。
＜プロトコル＞
１）パラフィン切片をキシレンにより脱パラフィン、アルコール，水洗し、ＰＢＳに浸漬
２）ＤａｋｏＴａｒｇｅｔＲｅｔｒｉｅｖａｌｓｏｌｕｔｉｏｎ, ｐＨ９（１０×）でＭＷ処理５分
３）ＰＢＳ洗浄後、１％過酸化水素メタノール，室温３０分
４）1次抗体３００倍，反応時間室温６０分
５）ＰＢＳ洗浄後、Ａｎｔｉ−ＲａｂｂｉｔＥｎｖｉｓｉｏｎ，室温３０分
６）ＰＢＳ洗浄後、ＤＡＢにて発色、ヘマトキシリンで核染色し、脱水、透徹、封入。
※ＰＢＳ洗浄は５分×３回

＜試薬＞
一次抗体：ａｂ２３８４１（ａｂｃａｍ社）
二次抗体：Ｅｎｖｉｓｉｏｎ^ＴＭＫ４００３（ＤＡＫＯ社）
ＤＡＢ：Ｋ３４６８（Ｄａｋｏ社）
ＤａｋｏＴａｒｇｅｔＲｅｔｒｉｅｖａｌｓｏｌｕｔｉｏｎ, ｐＨ９：Ｓ２３６７（ＤＡＫＯ社）

ロシグリタゾンとＳＩＳ３を組み合わせることにより、対照に比較し細胞は小型化し、濃く染色されたことより、ＵＣＰ−１の発現が誘導されたことが認められた（図３）。

実施例３糖代謝及び脂質代謝改善作用
（１）動物およびその飼育
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＳＬＣ、♂、７週齢）に、６０ｋｃａｌ％脂肪含有高脂肪飼料（リサーチダイエット）を自由摂食、水道水を自由飲水させた。１０週間後、平均体重が均等になるように４群に分けた。飼育環境は、室温を２３±２℃、湿度を５５±１０％とし、明期を７〜１９時とした。

（２）Ａｌｚｅｔ浸透圧ポンプの埋め込み手術
ソムノペンチル１／１３希釈溶液を１０ｍＬ／ｋｇ体重にて腹腔内投与した後、鎮痛剤ペンタゾシンを１ｍｇ／ｋｇ体重にて皮下注射した。背部を毛刈り後、以下の剤を充填した浸透圧ポンプＡｌｚｅｔ（ＤＵＲＥＣＴ）を皮下に埋め込むことで、剤を持続投与した。尚、各被験化合物は５０％ＤＭＳＯ／２０％エタノール／３０％水溶液に溶解して用いた。
＜被験化合物＞
第１群：対照群
第２群：ＰＰＡＲγ活性化剤（ロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）（和光純薬）、５ｍｇ／ｋｇ体重／日）＋Ｓｍａｄ３阻害剤（ＳＩＳ３（ＳＩＧＭＡ）、５ｍｇ／ｋｇ体重／日）

（３）経口糖・脂質負荷試験
術後１３日目に、以下の方法で、経口糖・脂質負荷試験を行った。
糖・脂質混合乳剤として、１０％グルコースおよび１０％コーン油を含有する以下の溶液を、超音波処理にて乳化したものを用いた。
＜糖・脂質混合乳剤の組成＞
グルコース１ｇ
コーン油１ｇ
卵黄レシチン０．１ｇ
脂肪酸不含ＢＳＡ０．４ｇ
蒸留水ｔｏｔａｌ１０ｍＬ

＜方法＞
絶食１２時間後、イソフルラン麻酔下にて補綴し、１０ｍＬ／ｋｇ体重量の糖・脂質混合乳剤をゾンデにて経口投与した。０、１５、３０、６０、１２０分後に、イソフルラン麻酔下で眼窩より採血すると共に、血糖値を測定した。血糖値は、簡易血糖値測定器アキュチェックアビバ（ロシュ）および測定用試験紙アキュチェックアビバストリップII（ロシュ）にて測定した。また、採血した血液より１００００ｒｐｍ、４℃、６分間の遠心処理にて血清を分取し、血中インスリン濃度をインスリン測定キット（森永生化学研究所）、血中トリグリセリド濃度をＴＧＥ−テスト（和光純薬）、血中遊離脂肪酸濃度をＮＥＦＡＣ−テスト（和光純薬）にて測定した。
ＡＵＣは、最低測定値を底辺とした曲線下面積として算出した。結果を図４に示す。

図４より、ロシグリタゾンとＳＩＳ３を組み合わせることにより、血糖値、血中インスリン値、中性脂肪（ＴＧ）値、ＮＥＦＡ（脂肪酸）値が顕著に低下し、糖代謝改善作用及び脂質代謝改善作用が認められた。

参考例１Ｓｍａｄ３阻害素材
（１）Ｓｍａｄ３リン酸化に与える影響
ｉ）ＨＥＫ２９３細胞を６ｗｅｌｌｄｉｓｈに３ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、５％ｃｈａｒｃｏａｌ−ｔｒｅａｔｅｄＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で一晩培養した。翌日、下記表１に示す各素材を終濃度０．００２％（ルテオリンは２μＭ）（低濃度サンプル）あるいは終濃度０．０１％（ルテオリンは１０μＭ）（高濃度サンプル）にてそれぞれ添加した無血清ＤＭＥＭに交換した。２時間後、０．０３μｇ／ｍＬＴＧＦβを添加し２０分間インキュベートした細胞について、培地を除去しＰＢＳで洗浄後回収した。

ｉｉ）ウエスタンブロッティング
回収した細胞にＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを加えよくホモジナイズした。氷上に１５分間静置後、超音波にて破砕し、１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した上清をタンパク質溶液として得た。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、一レーンあたりタンパク質２５ｍｇ分、４ｘＳＤＳＳａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を１／４容量含む調製サンプルに対し、９５℃で５分間熱変性をかけたものを用いた。Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ^ＴＭＰＶＤＦＭｅｍｂｒａｎｅ（ＢｉｏＬａｄ）に転写し、以下の手順でブロッキング、抗体反応を行い、ＥＣＬｐｒｉｍｅｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてタンパク質の検出を行った。内部標準として、αｔｕｂｕｌｉｎとＳｍａｄ３について、併せて検出を行った。

５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ，１時間（室温）
↓ ＴＢＳ−Ｔにて洗浄
一次抗体／ＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌ^ＴＭｓｏｌｕｔｉｏｎ１（ＴＯＹＯＢＯ），Ｏ／Ｎ（４℃）
↓ ＴＢＳ−Ｔにて洗浄
二次抗体／ＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌ^ＴＭｓｏｌｕｔｉｏｎ２（ＴＯＹＯＢＯ），１時間（室温）
↓ ＴＢＳ−Ｔにて洗浄
検出
※ ＴＢＳ−Ｔ; ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴｒｉｓＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）

Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ：ＲＩＰＡｂｕｆｆｅｒ（ＳＩＧＭＡ）
Ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｅｒｃｏｃｋｔａｉｌ（１／１０００量、ＳＩＧＭＡ）
ＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＣｏｃｋｔａｉｌ１（１／１００量、ＳＩＧＭＡ）
ＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＣｏｃｋｔａｉｌ２（１／１００量、ＳＩＧＭＡ）

一次抗体：ａｎｔｉ−Ｓｍａｄ３（Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ ♯９５１３），１０００倍希釈
ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏＳｍａｄ３（Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ ♯９５２０）,１０００倍希釈
ａｎｔｉ−α−ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ ♯２１４４）,１０００倍希釈
二次抗体：ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔＩｇＧ, ＨＲＰｌｉｎｋｅｄ（ＧＥヘルスケア）,１０００倍希釈

ｉｉｉ）ａ）〜ｋ）の素材について、ＴＧＦβ刺激応答性のＳｍａｄ３リン酸化亢進が抑制され、高濃度処理群（レーン右側）においてはより顕著な抑制効果が認められた（図５）。

参考例２ＰＰＡＲγ活性化素材
アフリカミドリザル腎細胞株ＣＶ−１をプレートにまき、ＤＭＥＭ（５％チャコール処理ウシ胎児血清）中で１日培養した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＧＡＬ４結合配列を含むレポータープラスミド（ｐＧ５−Ｌｕｃ；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、ヒトＰＰＡＲγ２リガンド結合部位（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑＮＭ＿０１５８６９，ｎｔ７０３−１６０６）をｐＢＩＮＤベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入したｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ−ＬＢＤとを同時にトランスフェクション試薬（ＳｕｐｅｒｆｅｃｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＱＩＡＧＥＮ）を用いて上記細胞に導入した。ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ−ＬＢＤベクターは、細胞に導入するとＰＰＡＲγ２リガンド結合部位とＧＡＬ４結合配列に結合する部位との融合蛋白質を発現する。当該融合蛋白質は、ＰＰＡＲγ２リガンドと結合することにより、その下流のホタルルシフェラーゼ遺伝子の転写を活性化する。よって、ホタルルシフェラーゼ活性を測定することによって、ＰＰＡＲγ２リガンドの結合量を決定することができる。また当該ベクターにはウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれているので、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定することにより、当該ベクターの導入効率を求めることができる。ベクター導入の３時間後、培養液をＤＭＥＭ（５％チャコール処理ウシ胎児血清）に交換し、さらに２時間後、培養液を下記表２に示す素材をそれぞれ記載の終濃度にて添加した無血清ＤＭＥＭ培地に交換した。約１６時間培養後、ＰＢＳにて細胞を洗浄し、ＤｕａｌＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＲｅｐｏｒｔｅｒＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてホタルおよびウミシイタケのルシフェラーゼ活性を測定することにより、ＰＰＡＲγ活性化作用を評価した。尚、ＰＰＡＲγ活性化作用は以下のように定義した。ＰＰＡＲγ活性化作用＝（ｐＧ５ｌｕｃによる蛍ルシフェラーゼ活性）／（ＧＡＬ４−ＰＰＡＲγ−ＬＢＤによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
尚、結果はコントロールにおけるルシフェラーゼ活性を１とし、それに対する相対値で示した。

ｉｉ）図６より、ａ）〜ｎ）の素材は、ＰＰＡＲγを活性化することが示された。

Claims

ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなるＵＣＰ−１発現促進剤であって、
ＰＰＡＲγ活性化剤がロシグリタゾンであり、Ｓｍａｄ３阻害剤がＳＩＳ３である、ＵＣＰ−１発現促進剤。
ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる体脂肪蓄積抑制剤であって、
ＰＰＡＲγ活性化剤がロシグリタゾンであり、Ｓｍａｄ３阻害剤がＳＩＳ３である、体脂肪蓄積抑制剤。
ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる肥満予防又は改善剤であって、
ＰＰＡＲγ活性化剤がロシグリタゾンであり、Ｓｍａｄ３阻害剤がＳＩＳ３である、肥満予防又は改善剤。
ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる糖尿病予防又は改善剤であって、
ＰＰＡＲγ活性化剤がロシグリタゾンであり、Ｓｍａｄ３阻害剤がＳＩＳ３である、糖尿病予防又は改善剤。
ＰＰＡＲγ活性化剤とＳｍａｄ３阻害剤を組み合わせてなる高脂血症予防又は改善剤であって、
ＰＰＡＲγ活性化剤がロシグリタゾンであり、Ｓｍａｄ３阻害剤がＳＩＳ３である、高脂血症予防又は改善剤。