KR101719015B1

KR101719015B1 - 프루네틴을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101719015B1
Application number: KR1020120081024A
Authority: KR
Inventors: 안효진; 안태규; 최호영
Original assignee: 상지대학교산학협력단
Priority date: 2012-07-25
Filing date: 2012-07-25
Publication date: 2017-03-23
Also published as: WO2014017741A1; KR20140019074A

Abstract

본 발명은 프루네틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 프루네틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 체중을 감소시키고, 체내 지방량을 감소시키며, 혈장 내 글루코즈 및 총 콜레스테롤 수준을 감소시키고, 체내 (간 및 내장 지방 조직) 지방 축적량을 감소키며, 특히 지방대사 및 지방세포형성에 관여하는 유전자 발현을 감소시킴으로써 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

프루네틴을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating obesity or metabolic disease comprising prunetin as an active ingredient}

본 발명은 프루네틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

비만은 유전적, 대사적, 환경적, 그리고 행동학적인 복잡한 요인의 상호작용에 의해 발생하는 생물학적 현상으로서, 일반적으로 체중과다로 인식되고 있다. 의학적으로는 BMI(body mass index)가 30 이상(즉, 표준체중의 30% 이상)인 경우이거나 BMI가 27 이상인 경우 비만으로 분류한다. 또한, 기타 순환기계 질환인 당뇨병(특히 제2형 당뇨병), 고혈압, 고지혈증 등이 연관되어 있는 경우를 비만으로 분류하고 있다. 특히 비만은 고혈압, 제2형 당뇨병, 암, 담낭질환, 고지혈증, 동맥경화 등과 같은 각종 성인병을 일으키는 중요한 요인으로 알려져 있다. 현재까지 알려진 비만의 원인은 유전적인 소인이 70% 이상으로 알려져 있고 그 외 환경요인으로 고지방식의 섭취나 운동부족 등이 알려져 있지만 최근, 섭취한 에너지량과 소비하는 에너지량의 불균형이 비만의 원인이라는 견해가 대두되고 있다. 즉, 그동안 유전적 소인이 많이 변화하지 않았음에도 발생율은 급속히 증가한 것으로 미루어 유전적 원인으로만 보기는 어렵다는 것이며 따라서 에너지 균형을 파괴하는 유전적, 환경적 복합 요인이 비만의 중요 인자라는 인식이 확산되고 있다.

지방세포에 저장된 지방은 체내의 중요한 에너지원으로 사용된다. 그러나, 비만이 진행됨에 따라서 지방세포는 수적으로 증가할 뿐만 아니라 과다한 지방세포의 분화에 의한 다량의 중성지방 합성은 지방세포의 크기증가를 포함한 형태적 변화와 여러 유전자 발현의 변화를 동반한다. 지방세포의 크기증가는 잉여 에너지를 중성지방의 형태로 합성 및 저장함으로써 유도된다. 한편, 지방의 저장에 따라 지방세포의 크기증가는 그 직경이 약 20배까지 늘어날 수 있으며 그 결과 세포 용적은 수천 배까지 증가되는 것으로 알려져 있다. 이러한, 지방세포의 크기는 일반적으로 식사 조절로 가능하지만 새로운 전구지방세포가 지방세포로 분화되는 과정은 식사조절로는 효과가 없기 때문에 비만의 근본적 치료 또는 억제를 제어하기 위해서는 지방세포의 분화과정을 조절하는 것이 중요하다. 지방세포 분화는 인슐린이나 인슐린 성장인자-I (insulin like growth factor-1), 성장호르몬 등의 자극에 의하여 촉진되며 이 과정에 CCAAT 인핸서 결합 단백질(CCAAT enhancer-binding protein (C/EBP)) 패밀리, 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) gamma)등의 전사인자들의 증가가 관찰된다. 이들, 전사인자들은 지방세포 조절인자와 더불어 지방세포의 분화를 촉진시키며 지방산 결합단백질인 aP2 나 지방산 생합성효소 (fatty acid synthase)과 같은 효소들의 발현량이 증가한다. 한편, 지방간의 진행에도 과다한 중성지방의 축적이 관여되고 있음이 보고되어 있다 [J. Clin. Invest., 98, 1575 ~ 1584 (1996)].

현재 비만 치료제로는 지방의 소화흡수를 억제하는 제니칼(Orlistat), 식욕을 억제하는 플루옥세틴(fluoxetine), 펜디메트라진, 그리고 대사촉진제인 에페드린 등과 같은 치료제가 있다. 그러나 상기한 바와 같은 종래의 치료제들은 심장질환, 호흡기질환, 신경계질환 등의 부작용과 함께 그 효능의 지속성도 낮아, 더욱 개선된 비만치료제의 개발이 필요하다.

한편, 프루네틴(prunetin)은 O-메틸화된 이소플라본 화합물의 일종으로서, 플라보노이드계 화합물이다. 왕벚나무(Prunus yedoensis)로부터 분리될 수 있다. 프루네틴의 생물학적 활성과 관련하여 항염증 활성이 있다는 보고가 있기는 하나, 다른 활성에 대하여는 전혀 알려진 바가 없다.

본 발명자들은 프루네틴 화합물이 고지질에 의한 지방간, 제2형 당뇨, 고지혈증, 심혈관질환, 동맥경화증 등의 지질관련 대사성 질환에도 우수한 치료효과가 있어, 본 발명에 따른 생약추출 혼합물을 비만, 지질관련 대사성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 프루네틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 프루네틴을 함유하는 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 체중 감소, 체내 지방 감소, 혈장 내 글루코즈 및 총 콜레스테롤 수준 감소, 체내 (간 및 내장 지방 조직) 지방 축적 감소, 지방대사 및 지방세포형성에 관여하는 유전자 발현을 감소시킴으로써 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는, 프루네틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 프루네틴을 함유하는 비만 또는 지질관련 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 프루네틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 체중을 감소시키고, 체내 지방량을 감소시키며, 혈장 내 글루코즈 및 총 콜레스테롤 수준을 감소시키고, 체내 (간 및 내장 지방 조직) 지방 축적량을 감소키며, 특히 지방대사 및 지방세포형성에 관여하는 유전자 발현을 감소시킴으로써 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 실험대상 동물군의 체중 증가량, 지방-패드 중량, FER(Food intake for the Experimental Period, 실험기간 동안의 사료 섭취) 및 간중량 측정 결과를 도시한 것이다.
도 2는 실험대상 동물군의 혈장 중 글루코즈 및 콜레스테롤의 함량을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 3은 H&E 염색한 마우스의 간 및 내장 지방세포 조직의 이미지로서, A, D의 경우 100배율로 본 것이고, B 및 D는 400배율로 본 것이다.
도 4는 간 조직, 정소상체 지방 조직의 Real-time PCR 분석결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 프루네틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1의 프루네틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

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본 발명의 일 실시양태에서, 상기 대사성 질환은 지질관련 대사성 질환이고, 보다 구체적으로 상기 대사성 질환은 예를 들면 고지질에 의한 지방간, 제2형 당뇨, 고지혈증, 심혈관 질환 및 동맥경화증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 질환일 수 있다.

상기 프루네틴이 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용되는 경우, 유효성분인 프루네틴에 관하여 존재하는 염 중에서 비만 또는 대사성 질환 예방 또는 치료제로서 사용되는 경우 허용되는 염을 선택할 수 있다.

상기 염으로는, 이로 제한되는 것은 아니나, 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 사용될 수 있다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 화합물들을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 화합물들은 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염의 형태로 만들어 사용할 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속 염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 1일 1 내지 200mg/kg으로, 바람직하게는 10 내지 100mg/kg으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 비만 또는 대사성 질환 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한 본 발명의 약학적 조성물은 식용 천연물 추출물로부터 분리된 성분 또는 이의 유도체를 유효성분으로 하기 때문에 독성을 가지지 않으며, 인체에 무해하다.

본 발명에서 용어, "개체"란 항비만 활성을 통해 예방 또는 치료할 수 있는 질환이 이미 발병되었거나, 발병될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 1의 프루네틴을 함유하는 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다:

[화학식 1]

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본 발명의 건강기능식품은, 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염 형태의 성분을 포함하되, 적절한 식품보조첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 비만, 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선을 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 화학식 1의 화합물은 원료 조성물 중 1 ~ 10 중량%, 바람직하게는 5 ~ 10중량%의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강식품 조성물은 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 프루네틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 프루네틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 체중을 감소시키고, 체내 지방량을 감소시키며, 혈장 내 글루코즈 및 총 콜레스테롤 수준을 감소시키고, 체내 (간 및 내장 지방 조직) 지방 축적량을 감소키며, 특히 지방대사 및 지방세포형성에 관여하는 유전자 발현을 감소시킴으로써 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 하기 실험예 및 제조예를 통하여 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 이는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것이지, 본 발명의 권리범위를 이로 한정하려는 의도는 아니다.

[실험방법]

(1) 시약의 준비

디메틸 술폭사이드(DMSO)는 WAKO Pure Chemical Industries, Ltd.(오사카, 일본)에서, 다른 시약들은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, 미국)에서 구입하여 사용하였다.

(2) 프루네틴의 제조

프루네틴은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, 미국)에서 구입한 것을 사용하였다. 프루네틴을 DMSO에 용해시키고(100μM) 4℃에 보관하였다. 복강 내 주사(intra-peritoneal injection)를 위하여, DMSO에 용해시킨 프루네틴을 증류수로 각각 5μM 또는 10μM로 희석하였다.

(3) 실험동물의 준비

15~17g의 수컷 C57BL/6J 마우스 4주령을 대한 바이오링크(대전, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다. 모든 동물은 실험 동물 사용과 관리에 대한 가이드라인 및 해설서의 규정에 따랐다. 마우스는 10주간 자유롭게 음식과 탭 워터에 접근할 수 있도록 하였고, 22℃±2℃의 일정한 온도 조건에서 12시간 명/암 주기를 반복하여 사육되었으며 습도는 55±10%로 하였다. 마우스를 랜덤하게 4그룹으로 나누어 1그룹을 10마리로 하였다. 각각 정상 식이 그룹(N), 고-열량 식이 그룹(HF), 각각 5μM 또는 10μM의 프루네틴을 투여받는 고-열량 식이 그룹(P5, P10)의 네 그룹으로 하였다. 매주 체중과 식이 섭취량을 기록하였다. 실험 기간 만료일에 동물을 12시간 동안 단식시켰다. 다음 날 마우스를 케타민:롬푼(5:3)으로 마취하고 심장천자로 혈액 샘플을 수집하였다. 그 후 내장 지방-패드(visceral fat-pad) 및 간 조직을 채취하여 세척하고 칭량한 후 바로 -80℃에 저장하였다.

(4) 통계학적 분석

하기 실험 예에서 모든 측정치는 10마리 마우스의 평균값 ± SEM으로 나타냈다. Real-time PCR 데이터는 각 그룹 당 10마리 마우스로부터의 RNA 샘플을 3중 분석한 결과의 ± SEM으로서 나타냈다. 데이터는 Duncan's multiple range test 또는 Dunnett's test로 분산 one-way 분석법(ANOVA)을 사용하여 분석하였다. 통계학적 분석에는 SPSS 통계분석 소프트웨어(Version 19.0)을 사용하였다.

[실험예 1] 체중, 지방중량, 간 중량 측정

마우스를 랜덤하게 4그룹으로 나누어 1그룹을 10마리로 하였다. 각각 정상 식이 그룹(N), 고-열량 식이 그룹(HF), 각각 5μM 또는 10μM의 프루네틴을 투여받는 고-열량 식이 그룹(P5, P10)의 네 그룹으로 하였다. 매주 체중과 식이 섭취량을 기록하였다. 실험 기간 만료일에 동물을 12시간 동안 단식시켰다. 다음 날 마우스를 케타민:롬푼(5:3)으로 마취하고 심장천자로 혈액 샘플을 수집하였다. 그 후 내장 지방-패드(visceral fat-pad) 및 간 조직을 채취하여 세척하고 칭량한 후 바로 -80℃에 저장하였다.

상기 실험 결과, 고-열량 식이 그룹(HF) 그룹의 경우 대조군에 비하여 총 체중이 크게 증가하였다 (11.12%, p＜0.01). 체중 증가량도 HF 그룹의 경우 대조군에 비하여 증가한 것으로 나타났다 (17%, p＜0.05). HF 그룹에 비하여, 프루네틴을 주사한 그룹 P5 및 P10의 경우 총 체중 및 체중 증가량은 각각 9.44% 및 11.09%에 불과하였다 (도 1A 및 도 1B 참조). 각 부위별 지방-패드 중량변화 측정결과는 다음 표 1에 나타낸 바와 같다:

	중량 감소율(%)
	P5	P10
정소상체(부고환, epididymal)	-47.72	-50.31
후복막(reproperitoneal)	-46.79	-51.11
장간막(mesenteric)	-16.80	-36.45
총 지방-패드	-42.28	-58.21

상기 표 1의 결과에서 알 수 있는 바와 같이 프루네틴을 투여한 그룹의 경우 지방의 중량이 현저히 감소하는 것으로 나타났다 (도 1C 참조). 사료효율(food efficiency) 비는 HF 그룹에 비하여 P5 및 P10 그룹의 경우 더 낮은 것으로 보인다 (도 1D 참조). 또한 프루네틴은 간 중량 증가량을 낮추는 것으로 나타났는데, P5 그룹의 경우 -8.19%였고, P10 그룹의 경우 -12.17%였다 (도 1E 참조).

[실험예 2] 혈청 지방 분석

글루코즈의 혈청 농도, 및 TC는 시판 키트(Biovision Research Products, Inc., CA, 미국)를 사용하여 효소학적 방법에 따라 측정하였다.

프루네틴을 투여한 경우 혈장 중 글루코즈 및 총 콜레스테롤의 수준을 현저히 낮추어 주는 것으로 나타났다. P5 그룹의 경우 혈장 글루코즈 농도가 17.21% 감소하였고, P10 그룹의 경우 19.14% 감소하였다 (도 2A 참조). 총 콜레스테롤 수준도 프루네틴을 투여한 그룹의 경우 HF 그룹에 비하여 더 낮아지는 것으로 나타났다 (도 2B 참조).

[실험예 3] 조직학적 분석

각 그룹에서 대표적인 마우스로부터 채취된 간 및 내장 지방-패드를 10% 완충 포르말린(buffered formalin)으로 고정시키고, 파라핀에 함침시킨 후 각각 8μm 또는 4μm의 두께로 커팅하였다. 그 후 지방 소적(fat droplet)의 조직학적 관찰을 위해 섹션들을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 영상은 SZX10 현미경(Olympus, 도쿄, 일본)으로 촬영하였다.

간 및 내장 지방 조직을 H&E 염색한 영상은 도 3에 나타낸 바와 같다. 도 3A를 보면, HF 그룹의 간 조직 중 지방 소적이 중심정맥(cental vein) 주변 간 세포내에 작은 액포로 보인다는 점을 알 수 있다. 프루네틴 투여 그룹의 간 조직은 대조군의 간 조직과 유사한 것으로 나타났다. 도 3C를 보면, HF 그룹의 경우 P5 및 P10 그룹에 비하여 지방세포가 현저하게 확대된 것을 알 수 있다. 도 3B 및 도 3D를 보면 간 및 내장 지방 조직에 지방 축적이 P5 및 P10 그룹에 비하여 HF 그룹에서 현저하게 일어난 것임을 알 수 있다. 조직학적 분석 실험을 통해 지방 축적 정도가 프루네틴의 투여 농도에 의존적임을 또한 알 수 있었다.

[실험예 4] Real-time PCR 분석

간 조직, 지방 조직 및 3T3-L1 세포 각각을 균질화하고 총 RNA를 Easy-Blue　 시약(Intronbiotechnology Inc., 경기도, 대한민국)을 이용하여 각각 분리하였다. 총 RNA를 Epoch　 마이크로-볼륨 분광광도계 시스템(BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, 미국)을 사용하여 정량하였다. 간, 내장 지방 조직 및 3T3-L1 세포로부터의 총 RNA를 고성능 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, 미국)를 사용하여 cDNA로 변환시켰다. 써모사이클러(thermocycler, Gene Amp　 PCR system 9700, Applied Biosystems)로 역전사를 수행하였고, 개시는 25℃에서 10분간, 그 후 인큐베이션은 50℃에서 90분간, 85℃에서 추가 5분간 수행하였다. 합성된 후, cDNA를 -20℃에 저장하였다. Real-time PCR 분석은 Step One Plus　 Real-time PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)으로 분석하였다. SYBR　 그린 마스터 믹스 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 및 프라이머가 PCR 분석에 사용되었다(Santa Cruz, CA, 미국). 반응은 각각 다음과 같은 조건으로 진행되었다: 초기 변성은 95℃에서 10분간,, 95℃에서 5초간 40 사이클, 60℃에서 45초간; 및 최종 멜팅 커브는 조직의 경우, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분, 95℃에서 15초간, 세포의 경우 35 반복 열 사이클(94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초)후 5분간 초기 변성. 상대 감지 시작 주기(comparative Threshold cycle, Ct) 방법 (Applied Biosystems)을 사용하여 유전자 발현을 측정하였고, 각 측정치는 GAPDH의 값으로 노멀라이즈하였다.

프루네틴 투여가 지방 대사 및 지방세포형성에 관여하는 유전자의 시그널링에 미치는 영향을 알아보기 위하여 간 및 내장 지방 조직 중 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP(sterol regulatory element binding protein)와 같은 유전자의 발현 수준을 측정하였다. 간 조직에서 콜레스테롤 항상성 및 지방세포 형성에 중요한 전사 인자인 SREBP, LXR(liver X receptor), HMG-CoA(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA)의 발현이 HF 그룹에 비하여 프루네틴 투여 그룹의 경우 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 또한 간 조직에서 이러한 전사인자들의 발현은 모두 농도-의존적으로 감소하였다 (도 4A 참조). 도 4B 및 도 4C는 내장 지방 조직에서 지방세포형성관련 몇 가지 유전자의 발현을 보여주고 있다. PPARγ, C/EBPα SREBP, LXR, LPL, 아디포넥틴, aP2 및 렙틴과 같은 지방세포형성 인자의 mRNA 수준이 HF 그룹에 비하여 현저히 낮아진 것으로 나타났다. 특히 내장 지방 조직에서는 이러한 인자들의 발현이 모두 프루네틴 농도-의존적으로 감소하였다.

제조예 1. 산제의 제조

프루네틴 10mg

수크로즈 100mg

탈크 10mg

상기 성분들을 분말화하여 혼합한 후 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제조예 2. 정제의 제조

프루네틴 10mg

전분 100mg

수크로즈 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

통상의 정제의 제조방법에 따라 상기 성분들을 혼합한 후 이를 타정하여 정제를 제조한다.

제조예 3. 캅셀제의 제조

프루네틴 10mg

결정성 셀룰로오즈 3mg

락토오즈 15mg

스테아린산 마그네슘 1mg

통상의 캅셀제의 제조방법에 따라 상기 성분들을 혼합한 후 젤라틴 캡슐에 충진하여 캅셀제를 제조한다.

제조예 4. 과립제의 제조

프루네틴 10mg

대두 추출물 50mg

포도당 200mg

전분 500mg

상기 성분들을 혼합한 후 30% 에탄올 100mL를 첨가하여 60℃에서 건조시켜 과립을 형성한 후 포에 충진하여 과립제를 제조한다.

제조예 5. 환제의 제조

프루네틴 20mg

유당 1,500mg

글리세린 1,500mg

전분 980mg

상기 성분들을 혼합한 후 통상의 환제의 제조방법에 따라 1환 당 4g이 되도록 제조한다.

제조예 6. 주사제의 제조

프루네틴 10mg

만니톨 180mg

주사용 멸균 증류수 2,970mg

Na2HPO4?12H2O 30mg

통상의 주사제 제조방법에 따라 1 앰플당 (2mL)가 되도록 상기 성분을 혼합하여 제조한다.

제조예 7. 액제의 제조

프루네틴 10mg

이성화당 10,000mg

만니톨 5,000mg

정제수 적량

통상의 액제 제조방법에 따라 정제수에 상기 성분을 용해시키고, 적절한 향을 가한 다음 병에 충진하여 멸균시켜 제조한다.

제조예 8. 선식의 제조

현미 10 내지 50중량부, 보리 1 내지 30중량부, 율무 1 내지 30중량부 및 검정콩 1 내지 10중량부를 충분히 건조시킨 후 혼합하여 분쇄기로 분말화하였다. 여기에 프루네틴 0.1 내지 1중량부를 넣고 혼합한 후 일정량씩 분포하여 포장백에 진공포장하는 방법으로 선식을 제조한다.

Claims

하기 화학식 1의 프루네틴 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 비만, 지방간 또는 제2형 당뇨의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]

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하기 화학식 1의 프루네틴을 함유하는 비만, 지방간 또는 제2형 당뇨의 예방 또는 개선용 건강기능식품:
[화학식 1]

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