KR20150136668A - 새싹 추출물을 유효성분으로 함유하는 항당뇨 또는 항비만 활성 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 및 비만 개선용 건강기능식품 및 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 및 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 새싹 추출물을 부작용이 없는 항당뇨 또는 항비만 효과가 있는 식품 또는 약품소재로서의 개발을 가능케 하리라 기대된다.

Description

새싹 추출물을 유효성분으로 함유하는 항당뇨 또는 항비만 활성 조성물{Composition for antidiabetic or antiobesity activity comprising sprout extract as effective component}

본 발명은 새싹 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 항당뇨 또는 항비만 활성 조성물에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 및 비만 개선용 건강기능식품 및 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 및 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

대사성 질환의 대표적인 당뇨병은 비만과 함께 단일질환으로는 가장 많은 의료비를 사용하고 있으며 그 수는 기하급수적으로 증가하고 있는 실정이다. 당뇨병은 췌장 β세포에서 인슐린의 절대량 부족으로 야기되는 제1형과 말초조직에서 발생하는 인슐린 저항성에 의해 정상적인 생리 기능을 수행하지 못하는 제2형으로 나눌 수 있다. 무절제한 단백질과 지방 섭취 등 잘못된 생활습관으로 야기되는 당뇨가 주로 제2형 당뇨병에 해당하며, 성인뿐만 아니라 청소년들에서도 발병하고 있는 추세여서 치료제 개발을 위한 다양한 노력들이 심화되고 있다(Park CM, et al., Kor. J. Pharmacogn . 2012;43(4):308~31593). 제2형 당뇨병의 주요 병인인 비만, 특히 복부 비만이 인슐린 저항성을 일으키는 원인으로 관심을 받고 있으며 복부 비만과 인슐린 저항성 그리고 만성 염증상태가 서로 연관되어 있다는 것이 알려졌다. 따라서 비만으로 인한 만성 염증을 경감시키고 인슐린 저항성 개선을 통한 혈당 조절을 타겟으로 제2형 당뇨를 치료하는데 주목하고 있다(Kadowaki T et al., J Clin Invest. 2006;116(7):1784~92). 새싹은 완전히 성장한 채소와 비교했을 때 폴리페놀과 플라보노이드 성분이 풍부해 항산화, 항염 및 콜레스테롤 억제효과가 있으며 인체 내에서 발생하는 활성산소종에 의한 장기와 조직 손상 및 면역력 저하에 탁월한 예방과 치료 효능이 있다(Khalil, A.W., et al., LWT 2007; 40:937~945). 습관적으로 고칼로리 식품을 섭취하는 당뇨 환자의 경우 효과적인 체중관리를 위해 새싹과 같이 독성이 없는 천연 항산화물질과 항염 효과가 우수한 식이섬유 섭취가 필수적이며, 산화적 스트레스로 인한 췌장 β세포 기능장애 개선에도 도움이 될 수 있을 것으로 생각한다. 일반적으로 당뇨치료는 약물치료와 함께 운동과 식이 요법을 통해서 혈당을 조절한다. 현재 제2형 당뇨 치료제로써 널리 사용되고 있는 메트포민은 글리코겐의 분해율을 감소시켜 혈당치를 낮추고 인슐린 분비도 촉진하지 않으며 약간의 체중감소 효과를 나타낸다. 또한 인슐린 유무와 상관없이 지방산 산화에 영향을 미쳐 혈장 지질 감소에도 좋은 효과를 나타낸다. 하지만 메트포민 치료요법의 주요 부작용은 구토, 복부 불쾌감이나 복부 팽만감 등 소화기계통에서 주로 많이 나타난다. 이와 같은 소화기 계통에서 발생하는 부작용으로 인해 당뇨치료를 중단하는 경우가 상당히 많다고 보고되고 있으며 신장기능이 약하거나 심장질환자 그리고 간기능이 약한 환자에게 사용시 심각한 부작용을 초래할 수 있다(Lee, S. H., et al., Kor . J. Pharmacogn . 2011;41(4):282~288). 따라서 이와 같은 부작용을 최소화하고 장기적으로 복용시 안전하며 인슐린 저항성을 감소시켜 정상적으로 인슐린 분비를 촉진함으로써 비정상적인 혈당 상승 조절을 가능하게 하는 천연자원 식품 소재 개발이 절실하게 요구되고 있다.

한국등록특허 제1246689호에는 식물혼합추출물을 함유하는 항당뇨용 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2005-0071459호에는 인삼잎 알코올 추출물을 함유하는 항당뇨 기능성 식품이 개시되어 있으나, 본 발명의 새싹 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 항당뇨 및 항비만 활성 조성물과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 고지방식이(HFD)와 스트렙토조토신(STZ)로 유도된 제2형 당뇨마우스와 비교하여 새싹 추출물을 투여한 경우 HDL 콜레스테롤(고밀도 콜레스테롤, high density cholesterol) 및 간독성의 지표인 GOT(글루탐산-옥살로아세트산아미노기전달효소, glutamate oxaloacetate transaminase)와 GPT(글루탐산 피루브산 트랜스아미네이스, glutamate pyruvate transaminase) 효소 활성도에는 변화가 없었으나, 공복혈당, 체중, 경구 내당능, 혈중 인슐린 및 렙틴 농도가 유의하게 감소됐고, 혈중 지질농도 변화에서는 총콜레스테롤, 중성지방 및 LDL 콜레스테롤 농도가 유의하게 감소되어 새싹 추출물의 항당뇨 및 항비만 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 및 비만 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 및 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 메밀, 비트, 유채, 브로콜리, 콜라비, 적양무 및 비타민 등의 새싹으로부터 추출한 새싹 열수 추출물을 제2형 당뇨가 유도된 마우스에 투여하여 제2형 당뇨마우스의 체중을 감소시키고 혈중 지질 대사 이상을 조절하면서 인슐린 저항성을 감소시켜 혈당을 개선시키는 것이 관찰되었다. 이러한 새싹 추출물은 부작용이 없는 항당뇨 또는 항비만 효과가 있는 식품 또는 약품소재로서의 개발을 가능케 하리라 기대된다.

도 1은 13주 동안 마우스의 처리에 대한 개괄도이다. 제2형 당뇨마우스는 STD(표준식이, 10% 지방 칼로리), HFD(고지방식이, 60% 지방 칼로리), HFD+SPE(고지방식이 및 새싹 추출물 투여) 및 HFD+MET(고지방식이 및 메트포민 투여)와 같이 4가지 그룹으로 나누었다. 췌장 조직에서 혈청 채취 및 분리는 다양한 분석을 위해 2주마다 수행되었고, 마우스를 희생시키기 1주 전에 수행되었다. ¹⁾STD, 표준식이(10% 지방 칼로리); HFD, 고지방식이(60% 지방 칼로리); SPE, 새싹 추출물; MET, 메트포민; 2)OGTT, 경구 내당능; 3)FBG, 공복혈당; SI&SL, 혈중 인슐린&렙틴; GOT, 글루탐산-옥살로아세트산아미노기전달효소(Glutamate Oxaloacetate Transaminase); GPT, 글루탐산 피루브산 트랜스아미네이스(Glutamate Pyruvate Transaminase); ITT, 인슐린 내성 측정; IHC, 면역조직화학염색법.
도 2는 고지방식이(HFD) 및 스트렙토조토신(STZ)에 의해 유도된 제2형 당뇨마우스의 공복혈당 수준에서 새싹 추출물(SPE)의 효과에 대한 결과이다. MET는 메트포민 투여군을 의미하며, 값은 각 그룹에서 10마리 마우스에 대한 평균±표준편차(mean±SD)를 나타낸다. ^a-c공통의 첨자를 공유하지 않는 같은 열에서 평균은 Duncan의 다중검정(Duncan's multiple range test)에 의해 유의차가 있다(p<0.05).
도 3은 고지방식이(HFD) 및 스트렙토조토신(STZ)에 의해 유도된 제2형 당뇨마우스의 경구 내당능(A) 및 인슐린 내성 측정(B)에서 새싹 추출물의 효과에 대한 결과이다. 값은 각 그룹에서 10마리 마우스에 대한 평균±표준편차(mean±SD)를 나타낸다. ^a-c공통의 첨자를 공유하지 않는 같은 열에서 평균은 Duncan의 다중검정(Duncan's multiple range test)에 의해 유의차가 있다(p<0.05).
도 4는 고지방식이(HFD) 및 스트렙토조토신(STZ)에 의해 유도된 제2형 당뇨마우스의 혈중 인슐린(A) 및 렙틴(B)에 대한 새싹 추출물의 효과를 나타낸 결과이다. ^a-c공통의 첨자를 공유하지 않는 같은 열에서 평균은 Duncan의 다중검정(Duncan's multiple range test)에 의해 유의차가 있다(p<0.05).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 및 비만 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 새싹 추출물을 얻기 위하여 통상적으로 이용되는 열수 추출, 실온 추출, 가온 추출 및 초음파 추출 등의 방법을 이용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 열수 추출일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에서, 상기 열수 추출은 정제수를 가한 후 90~100℃에서 3~7분 동안 가열하여 추출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에서, 상기 새싹 추출물은 폴리페놀과 플라보노이드 성분이 풍부한 새싹으로부터 추출될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메밀, 비트, 유채, 브로콜리, 콜라비, 적양무 및 비타민 중에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에서, 상기 새싹은, 100 중량부 기준으로, 메밀 28~32, 비트 18~22, 유채 18~22, 브로콜리 8~12, 콜라비 8~12, 적양무 3~7 및 비타민 3~7 중량부로 혼합한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 추출물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 추출물 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 냉면육수, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 추출물 100㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 또한, 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 및 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 새싹 추출물은 전술한 바와 같다.

본 발명의 추출물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 재료 및 방법

고지방 식이 및 STZ 에 의한 제2형 당뇨 마우스 모델 제작

4주령 C57BL/6 마우스를 ㈜중앙실험동물(한국)로부터 구매하여 적절한 온도(22±2℃)와 습도(50±5℃)를 유지하며 12시간 주기로 명암을 조절하면서 1주간 적응시켰다. 고지방식이(HFD)군과 표준식이(STD)군의 사료(표 1)는 Research Diet Inc.(미국)에서 구입하여 사용하였으며, 표준식이(STD)군을 제외한 실험군들은 인슐린 저항성을 유도하기 위해 고지방식이(HFD)를 8주간 급여하였다. 고지방식이(HFD) 급여 8주 후 췌장세포의 부분적 손상에 의한 당뇨유발을 위해 스트렙토조토신(STZ)을 0.1M 시트레이트 용액(pH 4.5)에 녹여 체중 ㎏당 75㎎(75㎎/㎏ 체중)을 일회 복강주사 하였다. 스트렙토조토신(STZ) 주사 1주일째 12시간 이상 마우스를 금식시킨 후 혈당 측정 결과 혈당이 200∼250㎎/dl인 마우스만을 비만형 제2형 당뇨병 유발 마우스로 간주하여 추후 실험에 사용하였다. 모든 동물 실험과정은 전주대학교 동물실험윤리 위원회의 승인을 받았다.

표준식이(STD) 및 고지방식이(HFD) 조성

Ingredient	Experimental groups1 )
	STD (g)	HFD (g)
Casein	200	200
L-Cystine	3	3
Corn starch	315	0
Maltodextrin 10	35	125
Sucrose	350	68.8
Cellulose	50	50
Soybean oil	25	25
Lard	20	245
Mineral mix S10026	10	10
Dicalcium phosphate	13	13
Calcium carbonate	5.5	5.5
Potassium citrate	16.5	16.5
Vitamin mix V10001	10	10
Choline bitartrate	2	2
	Gm%	Gm%
Protein	19.2	26.2
Carbohydrate	67.3	26.3
Fat	4.3	34.9
㎉/g	3.85	5.24

¹⁾STD(표준식이, 10% 지방 칼로리); HFD(고지방식이, 60% 지방 칼로리).

열수 추출물 제조

실험에 사용한 새싹(Sprouts)들은 전라북도 진안군 진안읍 애농영농조합(한국)으로부터 공급받았다. 새싹 열수추출에 사용된 새싹들(메밀, Buck wheat; 비트, Beet; 유채, Rape; 브로컬리, Broccoli; 콜라비, Kohlrabi; 적양무, Red young radish; 비타민, Dachai)의 기본 조성비율은 표 2와 같다. 건조된 새싹들은 100g으로 정량하여 증류수 1,000㎖을 주입하고, 5분간 끓인 후 얻어진 추출물을 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과한 다음 동결 건조기(EYELA FDU-2100, 일본)에서 건조하여 분말형태로 회수하였다. 회수한 새싹 추출물(SPE) 9.8g을 -20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

추출물 조성

Ingredient	Experimental extract 1 )
	SPE (g)
Buck wheat	30
Beet	20
Rape	20
Broccoli	10
Kohlrabi	10
Red young radish	5
Dachai	5
Total	100

¹⁾SPE, 새싹 추출물

실험군 선정 및 추출물 투여 계획

식이급여와 투여에 따른 실험분석 개괄도는 도 1과 같다. 비만형 제2형 당뇨병이 유발된 C57BL/6 마우스를 각 실험군 당 10마리씩 나누고 표준식이군(STD, 10% 지방 칼로리), 고지방식이군(HFD, 60% 지방 칼로리), 고지방식이(HFD)와 새싹 추출물 투여군(SPE) 및 고지방식이(HFD)와 메트포민(MET) 투여군으로 나누어 4주간 사육하였다. 새싹 추출물(SPE)과 메트포민(MET)은 300㎎/㎏ 체중으로 100㎕ 씩 매일 오전 9∼10시 사이에 경구투여용 존데를 사용하여 4주 동안 투여하였으며, 표준식이(STD)군과 고지방식이(HFD)군은 동일한 양의 증류수를 경구 투여하였다.

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체중과 식이 섭취량 측정

체중은 실험 시작 일에 최초 측정한 다음 매주 1회 실험종료일까지 4주에 걸쳐 측정하였고 식이 섭취량은 투여기간 동안 주당 2회 측정하였다. 식이 섭취량은 이전 사료 공급량에서 잔량을 감하여 계산하였다.

혈청 및 장기 채취

새싹 추출물(SPE)과 메트포민(MET) 투여는 2주마다 12시간 금식시킨 후, 에테르 마취를 하지 않고 마우스 고정틀 안에 마우스를 삽입한 다음 꼬리로부터 공복혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 3000rpm(4℃)에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였으며 혈청의 생화학적 분석 전까지 -70℃에 보관하였다. 실험동물의 췌장조직은 실험종료일에 공복혈액을 채취한 후 즉시 적출하여 면역조직화학염색에 사용하였다.

공복혈당, 경구 내당능 및 인슐린 내성 측정

공복혈당(fasting blood glucose, FBG) 측정은 2주마다 한 번씩 꼬리정맥에서 채혈하였으며, 채혈 전 12시간 동안 금식시킨 후 혈당측정기(Acuu-Check, Roche Diagnostics Korea Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 각 그룹에 대한 혈당 변화를 관찰하였다.

경구 내당능(oral glucose tolerance test, OGTT) 검사는 실험 종료 3주째 12시간 금식시킨 후 포도당 용액을 체중 ㎏당 1g씩 경구투여한 다음 0, 30, 60, 90, 120분 후 마우스 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다.

인슐린 내성 검사(insulin tolerance test, ITT)는 실험 종료 마지막 주에 12시간 금식시킨 후 인슐린용액을 체중 ㎏당 1unit씩 경구투여한 다음 0, 30, 60, 90, 120분 후 마우스 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다.

혈중 지질 농도 분석

혈청 지질 농도(lipid profile) 분석을 위해 측정용 키트(AM 202-K, AM 203-KTC, AM 157S-K, Asan Pharm. Co., 한국)으로 TC(총 콜레스테롤, total cholesterol), HDL 콜레스테롤(고밀도 콜레스테롤, high density cholesterol), LDL 콜레스테롤(저밀도 콜레스테롤, low density cholesterol) 및 TG(중성지방, triglyceride)을 측정하였다. LDL 콜레스테롤 함량은 Friedewald 등(Ji-hong Lian, et al., Scand. J. Lab. Anim. Sci. 2007;34(1):21~29)의 공식에 의해 [총콜레스테롤-HDL 콜레스테롤-(중성지방/5)]으로 계산하였다.

혈중 GOT 와 GTP 활성 측정

혈청 GOT(글루탐산-옥살로아세트산아미노기전달효소, glutamate oxaloacetate transaminase)와 GTP(글루탐산 피루브산 트랜스아미네이스(glutamate pyruvate transaminase)의 활성은 Reitman과 Freankel(Hahm, S. W., et al., Nuter. Res. 2011;31(6):479~487)의 방법에 따라 측정용 키트(Asan Pharm, Co.)를 사용하여 측정하였다. 혈청중 GOT 및 GTP의 활성도는 표준검량곡선에서 산출하였으며 혈청 1㎖당 IU/ℓ로 나타내었다.

췌장조직의 면역조직학적 관찰

실험종료일에 마우스 췌장을 적출하여 조직절편에서 인슐린세포와 글루카곤(glucagon) 세포를 관찰하고자 HistoMouse^TM-MAX(Invitrogen, 미국)를 사용하여 면역조직화학염색법을 시행하였다(Sunil, C., et al., Food Chem. Toxicol. 2012;50(12):4356~4363). 즉, 적출된 조직을 4% 포르말린 용액에 16~19시간 고정시킨 다음 파라핀 포매과정을 거쳐 마이크로톰을 사용하여 조직을 5㎛ 두께로 절편 하였다. 절편한 조직은 일련의 함수과정을 거친 뒤 3% 과산화수소수가 포함된 메탄올에 30분간 반응시켜 내인성 과산화효소(peroxidase)의 활성을 제거하였다. 일차항체는 토끼 유래 다클론성 항-인슐린 항체(rabbit polyclonal anti-insulin antibody, Santacruz Biotechnology, 미국)과 토끼 유래 다클론성 항-글루카곤 항체(rabbit polyclonal anti-glucagon antibody, Santacruz Biotechnology, 미국)을 각각 1:200으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시키고, 과산화효소(peroxidase)가 결합된 이차항체를 상온에서 10분간 반응시킨 후 DAB(diaminobezidine) 발색시약을 5분 동안 처리하여 조직을 발색시켰다. 헤마톡시린(Hematoxylin)으로 대조염색을 실시한 다음 광학현미경 하에서 관찰하였으며, 전 염색과정 동안 대조군과 실험군들을 동시에 처리하여 염색 정도를 일관성 있게 하였다.

혈중 인슐린과 렙틴 농도 측정

혈청 인슐린 농도와 렙틴 농도는 고감도 마우스 인슐린 ELISA 키트(ultra sensitive mouse insulin ELISA kit, Crysral Chem Inc., 미국)와 마우스 렙틴 Quantikine ELISA 키트(mouse leptin Quantikine ELISA kit, R&D systems, Inc., 미국)를 사용하여 면역분석으로 측정하였다.

통계처리

모든 실험값은 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였고, 통계학적 비교분석은 IBM SPSS 통계 19를 이용하였고 각 실험군간의 비교는 일원배치분산분석(one-way ANOVA, one-way analysis of variance)로 처리하였으며, 실험군들과의 유의차를 알아보기 위한 다중비교방법으로 Duncan의 다중검정(Duncan's multiple range test)을 실시하였다. 검정 유의도는 p 값이 <0.05 수준일 때를 기준으로 하였다.

실시예 1: 체중과 식이 섭취량에 미치는 영향

고지방식이(HFD)와 저농도 STZ의 투여는 인슐린 저항성과 함께 고인슐린증을 일으키는 췌장 β세포의 선택적인 파괴를 유도해 제2형 당뇨병을 유발한다. 본 실시예에서는 이와 같은 방법으로 제2형 당뇨병을 유발시킨 후 4주 동안 새싹 추출을 투여하여 체중 및 식이 섭취량을 관찰하였다(도 1). 제2형 당뇨병 유발 후 실험 개시 전에 실험군의 평균체중을 측정한 결과(표 3), 표준식이(STD)군을 제외한 나머지 실험군의 평균체중(33.067±0.75g)에는 유의적인 차이가 없었다. 실험종료일에 고지방식이(HFD)군(36.31±2.72g)의 체중은 표준식이(STD)군(24.97±1.15g)보다 유의적으로 증가하였으며, 새싹 추출물(SPE)군(34.01±1.19g)과 메트포민(MET) 투여군(32.13±2.11g)은 고지방식이(HFD)군 보다 유의성있는 감소를 보였다. 평균 증체량은 새싹 추출물(SPE) 투여군(-1.38±1.75g)과 메트포민(MET) 투여군(-1.17±2.31g)이 고지방식이(HFD)군(3.04±3.22)에 비해 각각 -54.60%, -138%로 유의적(p<0.05)으로 감소하였다. 식이섭취량은 모든 실험군에서 유의적인 차이가 없으므로 식이 섭취량은 체중 감소와 관계가 없음을 알 수 있다. 비만은 당뇨병 발병에 주요 병인으로 체중감량은 당뇨병 발생을 현저하게 감소시켜 체중과 당뇨병이 밀접하게 관련 있음이 입증되었고, db/db 마우스에서 체중감소는 인슐린 저항성과 혈당조절 효과에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Lian JH, et al., Scand J Anim Sci. 2007;34:21~29).

고지방식이(HFD) 및 스트렙토조토신(STZ)에 의해 유도된 제2형 당뇨마우스에서 체중 및 음식 섭취

	Experimental groups1 )
	STD	HFD	SPE	MET
Initial body weight(g)	22.58±0.95	33.27±1.88	32.63±1.47	33.30±1.69
Final body weight(g)	24.97±1.15a)	36.31±2.72b)	34.01±1.19c)	32.13±2.11d)
Food intake(g/week)	17.62±3.31a)	16.51±2.91a)	16.13±2.47a)	16.15±2.91a)

¹⁾STD, 표준식이 섭취(10% 지방 칼로리); HFD, 고지방식이(HFD) 섭취(60% 지방 칼로리); SPE, 고지방식이(60% 지방 칼로리) 섭취 및 새싹 추출물 투여; MET, 고지방식이(60% 지방 칼로리) 섭취 및 메트포민 투여. ^a-c공통의 첨자를 공유하지 않는 같은 열에서 평균은 Duncan의 다중검정(Duncan's multiple range test)에 의해 유의차가 있다(p<0.05).

실시예 2: 혈당, 경구 내당능 및 인슐린 내성 에 미치는 영향

새싹 추출물을 4주 동안 투여한 제2형 당뇨마우스의 공복혈당변화는 도 2와 같다. 실험 개시 전 표준식이(STD)군(127.10±5.87㎎/dl)을 제외한 실험군간의 혈당(230±12.53㎎/dl)은 차이가 없었으며 표준식이(STD)군의 혈당은 실험기간 동안 거의 일정하게 유지되었으나 고지방식이(HFD)군의 경우 실험기간 동안 지속적인 혈당 상승이 관찰되었다. 특히 실험 종료 4주째 새싹 추출물(SPE) 투여군(234.56±27.53㎎/dl)과 메트포민(MET) 투여군(182.57±30.03㎎/dl)은 고지방식이(HFD)군(328.67±12.47㎎/dl)에 비해 각각 -28.63%, -44.45%로 유의성 있는 혈당감소를 나타냈다.

경구 내당능 결과는 포도당 섭취 후 60분, 90분에서 새싹 추출물(SPE) 투여군과 메트포민(MET) 투여군이 고지방식이(HFD)군보다 유의성 있게 혈당이 감소하였음을 알 수 있으며, 120분에서 새싹 추출물(SPE) 투여군(212.89±33.67㎎/dl)과 메트포민(MET) 투여군(208.86±10.737㎎/dl)은 고지방식이(HFD)군(322.30±10.737㎎/dl)에 비해 각각 -33.94%, -35.19% 유의적으로 혈당이 감소하였다(도 3A). 또한 120분에서 새싹 추출물(SPE) 투여군과 메트포민(MET) 투여군의 혈당은 포도당 투여 전 혈당 수준으로 떨어진 반면 고지방식이(HFD)군은 포도당 투여 전 혈당보다 높았다(도 3A).

인슐린 내성 결과는 인슐린 투여 120분에서 새싹 추출물(SPE) 투여군(181.22±38.53㎎/dl)과 메트포민(MET) 투여군(168.00±29.15㎎/dl)이 고지방식이(HFD)군(241.67±56.93㎎/dl)보다 유의성 있게 혈당이 감소하였음을 알 수 있다(도 3B). 이와 같은 결과를 통해 새싹 추출물은 제2형 당뇨 마우스에서 인슐린 저항성을 감소시키고 혈당 강하의 효과가 있는 것으로 생각된다.

실시예 3: 혈중 지질 농도의 변화와 GOT 와 GPT 활성 측정

새싹 추출물의 혈중 지질 조성에 대한 효과를 살펴본 결과 총콜레스테롤 농도는 고지방식이(HFD)군(287.53±15.13㎎/dl)이 새싹 추출물(SPE) 투여군(208.06±11.96㎎/dl)과 메트포민(MET) 투여군(233.93±14.76㎎/dl)에 비하여 유의적으로 증가하였다(표 4). 중성지방 농도는 새싹 추출물(SPE) 투여(83.95±13.33㎎/dl)과 메트포민(MET) 투여군(105.25±21.44㎎/dl)이 고지방식이(HFD)군(154.29±20.70㎎/dl)보다 각각 -45%, -32% 유의적으로 감소하였으며 표준식이(STD)군(106±21.19㎎/dl)의 지질 농도 수준으로 감소하였다(표 4). HDL 콜레스테롤 농도는 실험군간의 유의적인 차이가 나타나지 않았으며, LDL 콜레스테롤 농도는 고지방식이(HFD)군(174.25±42.45㎎/dl)보다 새싹 추출물(SPE) 투여군(106.50±14.99㎎/dl)과 메트포민(MET) 투여군(139.83±38.37㎎/dl)에서 각각 -38%, -20% 유의적으로 감소하였으며 표준식이(STD)군(68.29±37.02㎎/dl)의 지질 농도와 유의성은 없었다.

고지방식이(HFD) 및 스트렙토조토신(STZ)에 의해 유도된 제2형 당뇨마우스에서 혈중 지질 농도에서 새싹 추출물의 효과

	Experimental groups
Parameters1 )	STD	HFD	SPE	MET
TC(㎎/dl)	186.14±11.94a)2)	287.53±15.13c)	208.06±11.96a)b)	233.93±14.76b)
TG(㎎/dl)	106.±21.19a)	154.29±20.70b)	83.95±13.33a)	105.25±21.44a)
HDL cholesterol (㎎/dl)	96.60±16.84a)	82.63±5.70a)	91.67±6.861a)	89.14±9.15a)
LDL cholesterol (㎎/dl)	68.29±37.02a)	174.25±42.45c)	106.50±14.99a)b)	139.83±38.37b)
GOT(IU/L)	19.40±6.53a)	25.90±10.02a)	21.50±9.22a)	15.71±3.09a)
GPT(IU/L)	4.20±3.67a)	8.10±5.84a)	4.70±5.41a)	3.86±3.23a)

¹⁾LDL 콜레스테롤=[총 콜레스테롤-HDL 콜레스테롤-(중성지방/5)]; TC, 총 콜레스테롤(total cholesterol); TG, 중성지방(triglyceride); HDL 콜레스테롤, 고밀도 콜레스테롤(high density cholesterol); LDL 콜레스테롤, 저밀도 콜레스테롤(low density cholesterol); GOT, 글루탐산-옥살로아세트산아미노기전달효소(Glutamate Oxaloacetate Transaminase); GPT, 글루탐산 피루브산 트랜스아미네이스(Glutamate Pyruvate Transaminase)

²⁾값은 각 그룹에서 10마리 마우스에 대한 평균±표준편차(mean±SD)를 나타낸다.

^a-c공통의 첨자를 공유하지 않는 같은 열에서 평균은 Duncan의 다중검정(Duncan's multiple range test)에 의해 유의차가 있다(p<0.05).

새싹 추출물이 간 독성에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈중 GOT와 GPT 효소 활성도를 검사한 결과 모든 실험군간의 유의성은 나타나지 않았다. 당뇨병으로 인한 인슐린 저항성 및 고인슐린증 상태에서는 지방조직에 있는 유리 지방산의 분해가 증가되어 간에서 지방합성 및 VLDL(very low density lipoprotein)의 생성이 증가되고 지단백 리파아제 활성화가 감소되어 혈중 중성 지방이 증가 될 수 있다. 또한 혈중 중성 지방의 증가로 인해 HDL 콜레스테롤 농도가 감소하고 LDL 콜레스테롤 농도가 증가한다고 알려져 있다(Cowley MA, et al., Neuron 2003;37:649~661). 이와 같이 당뇨로 인한 혈중 지질대사 이상은 당뇨병 치료의 주요 바이오마커이며, 당뇨병 치료에 있어서 이상지질혈증의 정상화는 매우 중요한 부분이라고 할 수 있다. 본 실시예로부터 새싹 추출물이 혈중 총 콜레스테롤, 중성지방 그리고 LDL 콜레스테롤 농도를 유의적으로 감소시켰음을 알 수 있었으며, 이러한 효과는 새싹 추출물이 간에서 포도당 생성을 억제하고 간과 근육에 지방 축적을 감소시킴으로써 혈중지질 대사 이상을 억제시켜, 인슐린 민감성을 개선하고 혈당을 정상화하는데 관여할 것으로 생각된다.

실시예 4: 혈중 인슐린 및 렙틴 농도에 미치는 영향

인슐린 저항성이 비만형 제2형 당뇨와 같은 대사성 증후군의 가장 핵심적인 요인이므로 혈중 인슐린 농도 측정은 인슐린 감수성 및 저항성을 측정할 수 있는 중요한 표식 마커이다. 혈중 인슐린 농도는 표준식이(STD)군(0.1±0.08ng/㎖)보다 고지방식이(HFD)군(0.92±0.06ng/㎖)에서 유의적으로 증가하였고, 새싹 추출물 투여군(0.56±0.19ng/㎖)과 메트포민(MET) 투여군(0.36±0.11ng/㎖)은 고지방식이(HFD)군(0.92±0.06ng/㎖)에 비해 각각 40%와 61% 유의적으로 감소하였다(도 4A). 고지방식이(HFD)군에서 나타나는 지속적인 혈당 증가(도 2)와 함께 현저하게 증가된 혈중 인슐린 농도는 인슐린 저항성과 인슐린 매개 포도당 흡수의 실패를 입증해준다. 이와 대조적으로 새싹 추출물군의 경우 새싹 추출물 투여 종료일에 관찰된 유의적인 혈당 감소(도 2)와 함께 인슐린 민감성을 개선할 수 있는 소재로서 긍적적인 가능성을 시사해준다.

혈중 렙틴 농도는 정상군(0.21±0.14ng/㎖)에 비해 고지방식이(HFD)군(1.99±0.48ng/㎖)에서 유의하게 증가하였으며, 새싹 추출물(SPE) 투여군(1.19±0.22ng/㎖)과 메트포민(MET) 투여군(0.95±0.39ng/㎖)에서 혈중 렙틴의 농도는 고지방식이(HFD)군(1.99±0.48ng/㎖)에 비해 각각 -40%, -52%로 유의하게 감소하였다(도 4B). 렙틴은 지방세포에서 분비되며 혈관뇌장벽(blood-brain barrier)을 통과하여 시상하부에 있는 렙틴 수용체에 결합하여 에너지 균형과 글루코스 대사 조절에 관여하는 호르몬으로서 식욕 감소와 에너지 소비를 증가시키는 역할을 한다(Myers MG, et al., Annu Rev Physiol. 2008;70:537~556). 렙틴을 ob/ob 마우스에 투여했을 때 체지방 감소를 일으켜 비만치료제로서의 가능성을 기대했으나, 많은 연구 결과에서 제2형 당뇨질환 환자와 비만 환자의 경우 혈중 내 높은 농도로 존재한다고 알려졌고, 렙틴 수용체의 하향조절로 인한 렙틴 저항성이 발생되어 체중 감소효과를 기대하기가 어렵다. 일반적으로 ob/ob 마우스에서 체중 감소를 위한 증가된 렙틴 농도 조절의 실패를 렙틴 저항성이라고 정의하는데 렙틴 수용체의 감소는 렙틴 기능의 결함과 불완전한 생리학적 반응을 유도하여 렙틴 저항성 비만과 제2형 당뇨병의 병인에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Zhang S, et al., Molecular Medicine Reports 2013;7:223~228). 따라서 본 실시예에서는 혈중 인슐린 농도와 렙틴 농도와의 상관관계를 명확히 보여 주며 렙틴이 고인슐린증과 인슐린 저항성에 있어서 중요한 역할을 한다는 종래 기술을 뒷받침하고 있다.

Claims (10)

1. 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 및 비만 개선용 건강기능식품.
2. 제1항에 있어서, 상기 새싹 추출물은 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 당뇨 및 비만 개선용 건강기능식품.
3. 제2항에 있어서, 상기 열수 추출은 정제수를 가한 후 90~100℃에서 3~7분 동안 가열하여 추출하는 것을 특징으로 하는 당뇨 및 비만 개선용 건강기능식품.
4. 제1항에 있어서, 상기 새싹은 메밀, 비트, 유채, 브로콜리, 콜라비, 적양무 및 비타민 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 당뇨 및 비만 개선용 건강기능식품.
5. 제1항에 있어서, 상기 새싹은 100 중량부 기준으로, 메밀 28~32, 비트 18~22, 유채 18~22, 브로콜리 8~12, 콜라비 8~12, 적양무 3~7 및 비타민 3~7 중량부인 것을 특징으로 하는 당뇨 및 비만 개선용 건강기능식품.
6. 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 및 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 새싹 추출물은 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 당뇨 및 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 열수 추출은 정제수를 가한 후 90~100℃에서 3~7분 동안 가열하여 추출하는 것을 특징으로 하는 당뇨 및 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
9. 제6항에 있어서, 상기 새싹은 메밀, 비트, 유채, 브로콜리, 콜라비, 적양무 및 비타민 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 당뇨 및 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
10. 제6항에 있어서, 상기 새싹은 100 중량부 기준으로, 메밀 28~32, 비트 18~22, 유채 18~22, 브로콜리 8~12, 콜라비 8~12, 적양무 3~7 및 비타민 3~7 중량부인 것을 특징으로 하는 당뇨 및 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

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