KR101656175B1 - 황화수소 생산을 억제하는 억제제를 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase, CSE) 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, MST)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다.
상기 억제제는 H₂S 생산을 억제하여 미엘린의 절편화, 타원형 미엘린 생성, 슈반세포의 탈분화와 증식, 및 축색돌기의 퇴화를 억제하므로, 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 및 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

황화수소 생산을 억제하는 억제제를 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating peripheral neurodegenerative diseases comprising an inhibitor of Hydrogen sulfide production}

본 발명은 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase) 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 및 사료 조성물에 관한 것이다.

신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)은 신경세포가 퇴화하고, 기능을 잃고, 그리고 종종 사멸하는 경우의 증상들과 관련된다. 이들은 주로 진행성이기 때문에, 신경퇴행성 질환의 결과는 종종 대단히 파괴적이다. 신경퇴행성 질환을 가진 환자들은 인지(cognitive) 또는 운동(motor) 능력에 있어서의 극심한 퇴화를 겪을 수 있다. 결과적으로, 그들의 삶의 질 및 삶에 대한 기대는 현저히 감소될 수 있다.

한편, 일산화 질소(NO), 일산화 탄소 및 황화수소(H₂S)는 다양한 생리적인 기능을 수행하는 기체 시그날링 분자이다. 상기 분자 중 H₂S는 가장 최근에 발견된 gasotransmitter이고(Am. J. Hypertens., 2002, 15, 103A), 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase, CSE), 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, MST)에 의해 생산된다. CBS 및 CSE는 L-시스테인 또는 호모시스테인으로부터 H₂S를 생산하고, MST는 L-시스테인 및 a-케토글루타레이트로부터 시스테인 아미노트랜스퍼라제(cysteine aminotransferase, CAT)와 함께 H₂S를 생산한다(Annu. Rev. Biochem., 1983, 52, 187-222; J. Biochem., 2009, 146, 623-626; Antioxid. Redox Signal., 2009, 11, 703-714). 최근 MST는 D-아미노산 옥시다제와 함께 D-cysteine으로부터 H₂S를 생산하는 것이 알려졌다.

상기 효소는 심장, 맥관구조(vasculature), 뇌, 신장, 간, 폐, 및 췌장 등과 같은 인간 조직에 존재하고, 신체에서 생리학적인 역할을 한다. 특히, 중추신경계(CNS)에서 H₂S는 해마의 장기강화(LTP)를 유도하고, H₂S 또는 관련 효소의 부적절한 수준은 다양한 질병, 예를 들면, 알츠하이머, 인지 능력 손상, 다운 증후군의 알츠하이머형 치매, 에틸말론산 뇌병증(ethylmalonic encephalopathy), 및 신경병증 통증을 야기시킨다. 또한, H₂S는 필수적인 생리학적 중간체 및 세포의 시그날링 물질로써 작용한다. 그러나, 말초신경계(PNS)에서 H₂S 및 관련 효소의 생리학적 또는 병리학적 기능은 여전히 밝혀지지 않았다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 CSE 또는 MST의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제는 월러변성 동안 H₂S 생산을 억제하여 미엘린의 절편화, 타원형 미엘린 생성, 슈반세포의 탈분화와 증식, 및 축색돌기의 퇴화를 억제함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase) 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 시스타티오닌 γ-리아제 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 시스타티오닌 γ-리아제 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase, CSE) 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, MST)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase, CSE)"는 시스타티오닌을 시스테인과 α-케토부티레이트로 전환하는 효소를 의미하며, 황화수소(H₂S) 생산과 관련되어 있다.

본 발명의 용어 "3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, MST)"는 3-머캅토피루베이트로부터 H₂S를 생산하는 효소를 의미한다.

상기 CSE 또는 MST의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제는 H₂S 생산을 억제시켜 미엘린의 절편화, 타원형 미엘린 생성, 슈반세포의 탈분화와 증식, 및 축색돌기의 퇴화를 억제하므로, 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 및 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "발현을 억제하는 억제제"란 상기 CSE 또는 MST의 발현을 감소시키는 물질을 통칭하는 의미로 사용되며, 보다 구체적으로는 CSE 또는 MST의 발현을 전사 수준 또는 단백질 수준에서 감소시키는 모든 물질을 포함할 수 있다. 상기 CSE 또는 MST의 발현을 억제하는 물질은 CCSE 또는 MST을 표적으로 하여 CSE 또는 MST의 발현을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한없이 사용 가능하다. 구체적으로, 상기 CSE 또는 MST의 발현 억제제는 CSE 또는 MST 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 microRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 CSE 또는 MST의 발현을 억제하면 손상된 신경세포에서 월러변성 동안 H₂S의 생산이 억제되어 미엘린의 절편화, 타원형 미엘린 생성, 슈반세포의 탈분화 및 증식, 축색돌기의 퇴화가 억제되므로, 상기 CSE 또는 MST 발현 억제제는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 억제제는 β-시아노-L-알라닌(β-cyano-L-alanine, BCA, 화학식 1), DL-프로파글라이신(DL-proparglycine, PAG, 화학식 2), 하이드록실아민(hydroxylamine, HA, 화학식 3), 및 N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide, NEM, 화학식 4)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 BCA, PGA, HA, 및 NEM은 각각 상기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물을 의미한다. 본 발명의 조성물은 이의 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물 및 수화물을 모두 포함하고, 가능한 모든 입체이성체도 포함할 수 있다. 또한 상기 BCA, PGA, HA, 또는 NEM의 용매화물, 수화물 및 입체이성체는 통상적인 방법들을 사용하여 상기 화학식 1 내지 5로 표시되는 화합물로부터 제조할 수 있다.

상기 억제제는 공지된 합성 방법으로 합성하여 사용할 수도 있고, 식물에서 분리 및 정제하여 사용할 수도 있으며, 또는 상업적으로 판매되는 것을 입수하여 사용할 수도 있다.

상기 약학적으로 허용가능한 염은 상기 BCA, PGA, HA, 및 NEM의 원하는 생물학적 및/또는 생리학적 활성을 보유하고 있고, 원하지 않는 독물학적 효과는 최소한으로 나타내는 모든 염을 의미한다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 히드로브롬산, 인산, 질산, 황산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 메탄 술폰산, p-톨루엔 술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

상기 BCA, PGA, HA, 및 NEM의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, BCA, PGA, HA, 및 NEM에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 CSE 또는 MST의 발현 억제제인 BCA, PGA, HA, 및 NEM은 손상된 좌골신경 절편에서 줄무늬 소실을 억제함을 확인하여(도 3a 및 3b), 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 용어 "활성을 억제하는 억제제"는 상기 CSE 또는 MST 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 통칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로 CSE 또는 MST 유전자로부터 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 상기 항체의 단편들도 본 발명의 항체에 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체 및 인간 항체 등도 포함하며, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. 상기 항체는 CSE 또는 MST 유전자로부터 발현되는 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "말초신경계 퇴행성 질환"은 말초신경계의 신경세포가 퇴화하고, 기능을 잃는 경우 나타나는 증상들과 관련된 질환을 의미한다. 상기 질환을 가진 환자들은 인지 또는 운동 능력에 있어서 극심한 퇴화를 겪을 수 있다.

본 발명에서 말초신경계 퇴행성 질환은 구체적으로 길리엄-바레 증후군, 샤르코-마리-투스 병, 당뇨병성 신경병증, 먼쪽척수근위축증, 안면신경마비, 중증근무력증, 말초신경손상, 영양성 신경병증, 수근관증후군, 및 기타 유전성 신경병증로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 신경퇴행을 억제시키거나 발생을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 신경퇴행에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

상세하게는, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 BCA, PGA, HA, NEM 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염은 각각 1일 0.0001 내지 1000mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여할 수 있다.

상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 당뇨병 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 개체란 말초신경계 퇴행성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 H₂S 생산 효소인 CSE는 손상된 말초 신경, 특히 슈반 세포에서 상향조절되지만, 말초 신경 축색돌기에서는 상향조절되지 않음을 확인하였다(도 1).

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 H₂S 생산과 관련된 효소인 CSE 또는 MST의 발현 또는 활성을 억제하면 H₂S 생산이 억제되고(도 3c), 손상된 좌골신경의 줄무늬 소실이 억제됨을 확인하여(도 3a 및 3b), H₂S 생산을 억제하면 신경퇴행을 억제할 수 있음을 확인하였다. 이를 통해, CSE 또는 MST의 발현 억제제인 BCA, PGA, HA, 및 NEM은 H₂S 생산을 억제하여 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 나아가 NEM은 다른 H₂S 생산 억제제보다 CSE 및 MST 발현을 현저하게 억제함을 확인하여(도 3d 및 3e), 다른 억제제보다 효과적으로 H₂S 생산을 억제하여 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 및 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 PAG, HA, 또는 NEM은 3DIV 동안 배양된 손상된 신경에서 타원형 미엘린이 형성되는 것을 억제하며(도 4a 및 4b), 3DIV 동안 배양된 손상된 신경(3DIV) 및 Cys 처리군(3DIV/Cys)과 비교하여 정상적인 염기성 단백질(MBP; 미엘린초 마커) 염색을 나타내고, 미엘린초 절편화를 억제함을 확인하였다(도 4c). 또한, PAG, HA, 또는 NEM을 처리한 절편은 정상적인 필라멘트 구조를 가지고(도 4d), 축색돌기 퇴화가 억제됨을 확인하였다(도 4e 내지 4g). 또한, NEM을 처리한 경우 축색원형질의 세로줄이 보호됨을 확인하여, NEM이 축색돌기의 세포골격을 보호함을 알 수 있었다(도 6a 및 6b). 이를 통해, 월러변성 동안 발생하는 타원형 미엘린 생성 및 축색돌기 퇴화에 H₂S 시그날링이 필요하며, 이의 억제를 통해 타원형 미엘린 생성 및 축색돌기 퇴화를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 H₂S 생산 억제제인 HA 또는 NEM을 처리한 경우 슈반 세포 탈분화 마커 단백질의 발현이 현저하게 억제됨을 확인한바(도 7 및 8), CSE 또는 MST의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제는 H₂S 생산을 억제하여 슈반세포 탈분화를 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다. 또한, NEM을 처리하여 H₂S의 생산이 억제되면 좌골신경 절편에서 Krox20의 핵내 이동이 대조군과 유사하게 유지됨을 공초점 이미지를 통해 확인하여(도 9a, 9b 및 10), H₂S 시그날링은 월러변성 동안 발생하는 신경이 제거된 슈반 세포의 전사적 조절과 관련이 있음을 알 수 있었다. 또한, 손상된 슈반 세포에서 Ki67(세포 증식 마커)염색을 통해 NEM을 처리한 경우 그렇지 않은 경우에 비해 세포분열이 활발하지 않음을 확인하여(도 11), NEM을 처리하여 H₂S 생산을 억제하면 손상된 슈반 세포의 증식이 억제됨을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 H₂S 생산을 억제하면 슈반 세포의 미엘린 절편화가 억제될 뿐만 아니라 in vivo에서 말초 신경 손상 후 축색돌기 퇴화가 억제됨을 알 수 있었다. 즉, H₂S 생산과 관련된 효소인 CSE 또는 MST의 발현 또는 활성을 억제하여 H₂S 생산을 억제하면 월러변성이 억제됨을 확인한바, CSE 또는 MST의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제는 말초신경계 퇴행성 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 말초신경계 퇴행성 질환의 치료방법을 제공한다.

상기 개체, 투여, 말초신경계 퇴행성 질환, 및 치료는 전술한 바와 같다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 CSE 및 MST로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 CSE, MST, 단백질의 발현을 억제하는 억제제, 활성을 억제하는 억제제, 말초신경계 퇴행성 질환, 및 예방은 전술한 바와 같다.

구체적으로, 상기 억제제는 BCA, PGA, HA, 및 NEM으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 BCA, PGA, HA, 및 NEM은 전술한 바와 같다.

상기 생리학적으로 허용가능한 염은 생리학적으로 허용되고 생물체에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않으면서, 투여되는 화합물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있는 통상적으로 사용되는 것을 의미한다.

본 발명의 용어 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 말초신경계 퇴행성 질환이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 관절염 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다.

구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 퀘르세틴 및 루틴 혼합물, 또는 이소퀘르세틴, 퀘르세틴 및 루틴 혼합물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.

상기 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데,담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

상기 억제제는 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 바람직하게는 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물으로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ∼ 0.03 g 이다.

상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 식품 조성물은 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 상기 억제제를 식품 조성물의 총중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 CSE 및 MST로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

상기 CSE, MST, 단백질의 발현을 억제하는 억제제, 활성을 억제하는 억제제, 말초신경계 퇴행성 질환, 예방 및 개선은 전술한 바와 같다.

구체적으로, 상기 억제제는 BCA, PGA, HA, 및 NEM으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 BCA, PGA, HA, NEM 및 생리학적으로 허용가능한 염은 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분으로, 상기 억제제를 유효성분으로 포함하는 사료는 당업계의 공지된 다양한 형태의 사료로 제조가능하며, 바람직하게는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에 포함되는 상기 억제제는 사료의 사용목적 및 사용조건에 따라 달라질 수 있으며, 일 예로 가축 사료 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 구체적으로는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.

시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase, CSE), 또는 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, MST)의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제는 H₂S 생산을 억제하여 미엘린의 절편화, 타원형 미엘린 생성, 슈반세포의 탈분화 및 증식, 및 축색돌기의 퇴화를 억제하므로, 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 및 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 손상된 좌골신경 슈반 세포에서 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase, CSE)가 상향조절됨을 확인한 도이다(Con, 손상되지 않은 대조군 신경).
(a)는 신경손상 전 후 좌골신경에서 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase, CSE) 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, MST)의 mRNA 발현 변화를 보여주는 도이다(n = 마우스 4 마리).
(b)는 정량 RT-PCR을 통해 손상된 부분의 CSE 및 MST의 mRNA 발현 강도를 대조군과 비교하여 나타낸 도이다(n = 3, *p < 0.001)
(c)는 웨스턴 블럿을 통해 절단 후 마우스 좌골신경의 단백질 용해물을 분석한 결과를 보여주는 도이다(n = 마우스 4 마리).
(d)는 정량 웨스턴 블럿을 통해 측정한 CSE 및 MST의 밴드 강도를 나타낸 도이다(n = 3, **p < 0.001).
(e)는 In vivo에서 좌골신경 단면을 면역염색한 결과를 보여주는 도이다[CSE(빨강), 중간 크기의 신경미세섬유(NF)(녹색), S100(녹색)]. 스케일 바 = 50 μm
도 2는 신경 손상 후 3일 째에 티징된 신경 섬유를 GFAP(녹색, 미성숙 슈반 세포 마커) 및 CSE(빨강색)으로 면역염색한 결과를 나타내는 사진이다(Con, 손상되지 않은 대조군 신경; 3d, 신경 손상 후 3일째의 신경).
도 3은 슈반 세포에서 N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide, NEM)의 H₂S 생산억제 효과를 보여주는 도이다(Con, 손상되지 않은 대조군 신경; 3DIV 또는(-), 손상된 좌골신경을 약물을 처리하지 않고 생체외에서 3일 동안 배양).
(a)는 ex vivo에서 월러변성 동안의 좌골신경 줄무늬의 소실에 대한 약물 10종의 효과를 나타낸 표이다. +++는 2μm 길이의 좌골 절편에서 측정된 줄무늬의 수가 10개를 초과한 것을 의미한다. 또한, ++, + 및 -는 줄무늬 수가 각각 10 ≥ ++ > 5, 5 ≥ + > 0, 및 0을 의미한다.
L-시스테인(L-cysteine, Cys; 200 μM), S-아데노실-L-메싸이온(S-adenosyl-L-methione, SAM; 2 mM), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine, NAC; 50 μM), 글루타티온(glutathione, GSH; 500 μM), 디클로페낙(diclofenac, 500 μM), β-시아노-L-알라닌(β-cyano-L-alanine, BCA; 2 mM), DL-프로파글라이신(DL-proparglycine, PAG; 2 mM), 하이드록실아민(hydroxylamine, HA; 1 mM), 아미노-옥시아세테이트(amino-oxyacetate, AOA; 5 mM), 및 NEM(1 mM)
(b)는 약물 처리 또는 무처리하여 생체외에서 3일(3DIV) 동안 배양한 좌골신경 절편을 입체 현미경을 사용하여 찍은 사진이다.
(c)는 좌골신경 절편 파쇄액(homogenate)의 상층액을 37℃에서 1시간 동안 배양하여 측정한 H₂S 생산량을 나타낸 도이다(n = 4, **p < 0.001).
(d)는 절단 후 마우스 좌골신경 절편의 단백질 용해물을 사용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과 PAG, HA, 또는 NEM의 효과를 확인한 도이다.
(e)는 정량 위스턴 블럿을 통해 측정한 상대적인 CSE 밴드 강도를 나타낸 도이다(n = 3, **p < 0.001).
(f)는 NEM(1 mM)을 처리하여 배양한 절편의 신경 섬유를 면역염색한 결과를 나타낸 사진이다[CSE(빨강) 및 S100(녹색)]. 스케일 바 = 100 μm
도 4는 신경퇴화와 H₂S 시그날링의 관련성을 나타낸 도이다(Con, 손상되지 않은 대조군 신경; 3DIV 또는(-), 손상된 좌골신경을 약물을 처리하지 않고 생체외에서 3일 동안 배양).
(a)는 좌골신경 절편을 H₂S 시그날링과 관련된 PAG, HA, 또는 NEM을 처리하여 3DIV 동안 배양한 사진이다. 스케일 바 = 50 μm
(b)는 차등간섭위상차(differential interference contrast, DIC) 현미경을 사용하여 200 μm 길이의 신경섬유에서 계수된 타원형 미엘린의 수를 나타낸 그래프이다(n = 10, **p < 0.001).
(c)는 PAG, HA 또는 NEM이 미엘린초 절편화를 억제함을 보여주는 좌골신경 박절편의 사진이다. 스케일 바 = 50 μm
(d)는 PAG, HA, 또는 NEM을 처리하여 좌골신경 절편을 3DIV 동안 배양한 후 신경미세섬유(NF)를 빨강색으로 염색한 사진이다. 스케일 바 = 50 μm
(e)는 300 X 300 μm 면적에서 계수한 50 μm보다 긴 정상 NF의 수를 나타내는 그래프이다(n = 8, **p < 0.001).
(f)는 NEM을 처리하여 좌골신경을 3DIV 동안 배양한 후, 좌골신경의 단백질 용해물을 사용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 도이다(n = 4 mice).
(g)는 웨스턴 블럿을 통해 분석한 NF의 상대적인 강도를 나타내는 그래프이다(n = 3, **p < 0.001).
도 5는 Cys, PAG, HA, 또는 NEM를 처리하여 배양된 절편의 좌골신경섬유를 3DIV 동안 배양한 후 면역염색한 결과를 보여주는 사진이다[염기성 단백질(MBP), 녹색].(Con, 손상되지 않은 대조군 신경; 3DIV 또는(-), 손상된 좌골신경을 약물을 처리하지 않고 생체외에서 3일 동안 배양)
도 6은 NEM을 처리하여 3일 동안 배양한 좌골신경의 형태학적 변화를 나타낸 도이다(Con, 손상되지 않은 대조군 신경; 3DIV 또는(-), 손상된 좌골신경을 약물을 처리하지 않고 생체외에서 3일 동안 배양).
(a)는 NEM을 처리하여 3일 동안 배양한 좌골신경에서 NEM의 의한 축색돌기의 세포골격 구조 보호 효과를 나타내는 사진이다.
(b)는 300 X 300 μm 면적에서 계수한 50 μm 이상의 길이를 가진 축색돌기의 수를 나타내는 그래프이다(n = 5).
도 7은 H₂S 시그날링이 슈반 세포 탈분화를 통제함을 보여주는 도이다(Con, 손상되지 않은 대조군 신경; 3DIV 또는(-), 손상된 좌골신경을 약물을 처리하지 않고 생체외에서 3일 동안 배양).
(a)는 좌골신경 절편을 3DIV 동안 배양한 후 슈반 세포 탈분화 마커 LAMP1, p75NTR, phosphor-p44/42 MAPK(pERK1/2), 및 c-Jun의 발현 수준을 웨스턴 블럿을 통해 확인한 도이다(n = 4 mice).
(b)는 PAG, HA, 또는 NEM을 처리한 경우 일반 배지에서 배양된 절편과 비교한 p75NTR, p-ERK1/2, 또는 c-Jun의 상대적인 강도를 보여주는 도이다(n = 4, **p <
0.001).
(c)는 S100(녹색) 및 LAMP1(빨강색)의 면역염색을 통해 HA 또는 NEM을 처리한 경우 LAMP1 의 발현이 억제됨을 확인한 사진이다.
(d)는 S100(녹색) 및 p75NTR(빨강색)의 면역염색을 통해 HA 또는 NEM을 처리한 경우 p75NTR의 발현이 억제됨을 확인한 사진이다.
도 8은 HA 또는 NEM을 좌골신경에 3DIV 동안 처리한 경우 LAMP1(a) 및 p75NTR(b)의 상대적인 강도가 감소됨을 보여주는 그래프이다(Con, 손상되지 않은 대조군 신경; 3DIV 또는(-), 손상된 좌골신경을 약물을 처리하지 않고 생체외에서 3일 동안 배양).
도 9는 H₂S 시그날링이 슈반세포 탈분화를 전사적으로 조절하는데 필수적임을 in vitro에서 확인한 도이다(Con, 손상되지 않은 대조군 신경; 3DIV 또는(-), 손상된 좌골신경을 약물을 처리하지 않고 생체외에서 3일 동안 배양).
(a)는 NEM을 처리하여 좌골신경을 3DIV 동안 배양한 후 p75NTR(녹색), Krox20(빨강색), 및 DAPI(파란색)를 면역염색한 결과를 보여주는 사진이다. 스케일 바 = 50 μm
(b)는 200 DAPI 양성 핵 안에서 Krox20 면역반응성을 가진 세포의 수를 대조군과 비교한 그래프이다(n = 5, **p < 0.001).
도 10은 NEM을 처리하여 배양된 절편의 신경섬유를 DAPI(파란색), Krox20(빨강색) 및 p75NTR(녹색)으로 면역염색한 결과를 보여주는 사진이다(Con, 손상되지 않은 대조군 신경; 3DIV 또는(-), 손상된 좌골신경을 약물을 처리하지 않고 생체외에서 3일 동안 배양). 스케일 바 = 50 μm
도 11은 H₂S 시그날링이 슈반 세포 증식을 조절함을 보여주는 도이다(Con, 손상되지 않은 대조군 신경; 3DIV 또는(-), 손상된 좌골신경을 약물을 처리하지 않고 생체외에서 3일 동안 배양).
(a)는 좌골신경 절편의 횡단면을 Ki67(빨강색; 세포증식 마커), S100(녹색), 및 DAPI(파란색)으로 면역염색한 결과를 보여주는 사진이다. 스케일 바 = 50 μm
(b)는 좌골신경 절편의 종단면을 DAPI(파란색), Ki67(녹색), 및 L1(빨강색, 미성숙 세포 마커)로 면역염색한 결과를 보여주는 사진이다. 스케일 바 = 50 μm
(c)는(a)의 결과를 정량분석하여 얻은 200 DAPI 양성 및 Ki67 양성 세포의 평균을 나타내는 그래프이다(n=4, **p < 0.001).
도 7은 H₂S 시그날링과 신경 퇴화와의 관련성을 in vivo에서 확인한 도이다(Con, 손상되지 않은 대조군 신경; 3DIV 또는(-), 손상된 좌골신경을 약물을 처리하지 않고 생체외에서 3일 동안 배양).
(a)는 in vivo에서 병변 부위에 3일 동안 NEM(1 mM, 10 mM 및 100 mM)을 처리한 후 차등간섭위상차 현미경으로 측정한 신경섬유의 타원형 미엘린 수를 나타내는 그래프이다(n = 7, **p < 0.001).
(b)는 NEM 농도 의존적으로 NF 수가 증가함을 보여주는 그래프이다(n = 9, **p < 0.001).
(c)는 좌골신경 손상 후 3일 동안 in vivo에서 병변 부위에 NEM을 투여한 결과를 보여주는 사진이다. 스케일 바 = 10 μm
(d)는 1 mm X 1 mm 면적의 전자현미경 사진에서 계수한 유수신경섬유의 수를 나타내는 그래프이다(n = 4, **p< 0.001).
(e)는 in vivo에서 마우스의 정상 좌골신경에 Cys(20 μM, 200 μM, 1 mM, 및 10 mM) 또는 대조군(PBS)을 3일동안 투여한 후 좌골신경의 횡단면을 S100(녹색) 및 p75NTR(빨강색)로 면역염색한 사진이다.
(f)는 좌골신경 횡단면의 300 X 300 μm 면적에서 계수한 p75NTR 양성 세포의 수를 나타낸 그래프이다(n = 4, **p < 0.001).
도 13은 NEM을 처리한 슈반세포에서 축색돌기 퇴화가 억제됨을 확인한 도이다(Con, 손상되지 않은 대조군 신경; 3d, 좌골신경 손상 후 3일째의 신경).
(a)는 좌골신경 손상 후 3일 동안 in vivo에서 병변 부위에 NEM을 투여한 결과를 보여주는 좌골신경 종단면의 사진이다. 스케일 바 = 50 μm
(b)는 NEM에 의해 보호된 100 μm 이상의 길이를 가진 축색돌기의 수를 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예 및 제를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실험예 1. 재료

면역조직화학 및 웨스턴 블럿에서 사용한 1차 항체(primary antibodies)는 p-ERK1/2(Cell Signaling, Beverly, MA, USA), CSE(Proteintech, Chicago, IL, USA), MST(Atlas Antibodies, Stockholm, Sweden), Ki67(Abcam, Burlingame, CA, USA), c-Jun(BD Biosciences, San Jose, CA, USA), L1(Millipore, Billerica, MA, USA), 및 Krox20(Covance, Dedham, MA, USA)을 타겟하였다. LAMP1, p75 neurotrophin receptor(NTR), 및 MBP 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, Alexa Fluor 488 및 594가 결합된 2차 항체(secondary antibodies)는 Life Technologies(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 다른 항체 및 시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

실험예 2. 실험동물 및 수술절차

C57B/6 mice(7 주령, 수컷)는 Samtako(Osan, Korea)에서 구입하였다. 모든 동물은 동물연구에 관한 경희대학교 위원회의 승인(KHUASP(SE)-13-027)하에 대한의학회에서 출간된 동물 실험 가이드라인을 따라 사용되었다. 펜토바르비탈 나트륨(pentobarbital sodium) 50 mg/kg을 복강 내 주사하여 마우스 마취시켰고, 넓적다리에서 좌골신경(sciatic nerve)을 노출시켰다. 실험동물을 신경절단 후 3일째에 희생시켰고, 횡단된 말초신경 분절을 제거하였다.

실험예 3. 절편 배양( explant culture )

좌골신경 절편 배양을 기존 방법(Thomson et al. 1993)에 따라 준비하였다. 마우스에서 좌골신경을 분리한 후, 신경을 둘러싼 연결 조직을 입체현미경(stereomicroscope)을 사용하여 분리하였다. 좌골신경을 3-4 mm 길이의 절편 3개 또는 4개로 나눈 후, 절편을 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 10% 열에 불활성화된 소태아혈청, 및 2 mM L-글루타민을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Thermo, Waltham, MA, USA)를 사용하여, 5% CO₂를 함유한 가습된 대기조건에서 37℃로 배양하였다.

실험예 4. in ex vivo 에서 좌골신경의 H ₂ S 생산량 측정 방법

좌골신경 절편에서 H₂S 생산량을 측정하였다. 먼저, 1% 아세트산아연(zinc acetate) 및 단백질 억제제(Roche, Mannheim, Germany)를 함유한 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, Thermo) 300 μL에 절편 20 mg을 균질화하였다. 상기 균질 현탁액에 50% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 75 μl을 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 다음 균질 현탁액을 4℃에서 10분 동안 10,000 g로 원심분리한 후 마이크로원심분리기 튜브로 옮겼다. 상기 상층액에 20 mM N,N-디메틸-p-페닐렌디아민 설페이트(N,N-dimethyl-p-phenylenediamine sulfate)를 함유한 1.2 M HCl 13.3 μL 및 30 mM FeCl₃을 함유한 1.2 M HCl 13.3 μL을 첨가하였다. 30분 후 분관광도계(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 670 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험예 5. 역전사 중합효소 연쇄반응( Reverse transcription - polymerase chain reaction , RT - PCR )

신경 축색 절단 후 3일째에 좌골신경에서 구아니딘 티오시안네이트-페놀-클로로포름 추출 방법을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 3 마리 마우스로부터 각 샘플을 채취한 후, 총 RNA를 SuperScript II(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 cDNA로 전환하였고, PCR로 상기 cDNA를 증폭하였다. 사용한 PCR 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.

프라이머		서열번호	서열(5'→3')
rat CBS	forward	1	ATGCTGCAGAAAGGCTTCAT
	reverse	2	CAACACCAAACACCATCAGC
rat CSE	forward	3	CGCACAAATTGTCCACAAAC
	reverse	4	TGAGCATGCTGCAGAGTACC
rat MST	forward	5	CCGAGCTCTGGTATCTGCTC
	reverse	6	TCTTGATGAAGGAGGGATCG
rat CAT	forward	7	GCTAGTACTTGGGACAACA
	reverse	8	CTAGGTCTCCAATGCAAAG
rat glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase	forward	9	CTACATGGTCTACATGTTCCAGTATG
	reverse	10	AGTTGTCATGGATGACCTTGG

PCR은 94℃(30초), 60℃(30초), 및 72℃(30초)로 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase의 경우 25 사이클; CBS, CSE, MST, 및 CAT의 경우 25-33 사이클 수행하였다. 증폭된 생산물을 1.5% 아가로스 젤 전기영동(GelRed; Biotium, Hayward, CA, USA)을 통해 시각화하였다.

실험예 6. 신경섬유 티징( teasing )

In vivo 또는 ex vivo에서 분리된 좌골신경을 4% 파라포름알데하이드(PFA)에서 1일 동인 4℃로 배양한 후, 인산완충식염수(PBS)에서 1일 동인 4℃로 배양하였다. 입체현미경을 사용하여 신경초(nerve sheath)를 제거한 후 신경을 3-4 mm 길이의 작은 분절로 잘랐다. fine forceps을 사용하여 신경 분절을 분리한 후 슬라이드에 고정하였다. 상기 슬라이드를 1시간 동안 25℃에서 건조한 후 면역조직화화 분석을 수행하였다.

실험예 7. 면역조직화학 분석 방법

좌골신경 샘플을 밤새도록 4℃에서 4% PFA에 담군 후, 30% 설탕을 함유한 0.1 M 인산 완충액(PB)에 3일 동안 담궜다. 그 다음 신경을 OCT(optimal cutting temperature compound)에 넣고 즉시 드라이아이스를 사용하여 냉동하였다. 상기 조직에서 냉동된 부분(16 μm)을 동결절편(cryosection)으로 만들어 슬라이드(Fisher Scientific, Houston, TX, USA)에 놓은 후, 염색을 위해 샘플 슬라이드를 10분 동안 4% PFA로 고정시켰다. 상기 샘플을 PBS로 3번 세척 후, 0.3% Triton X-100을 포함함 PBS를 처리하여 샘플의 투과성을 증가시켰고, 4℃에서 10% 소혈청알부민을 밤새도록 처리하여 블럭시켰다. 상기 슬라이드를 1차 항체와 함께 25℃에서 1시간 동안 배양하였고, PBS로 3번 세척 후, 적절한 2차 항체와 함께 25℃에서 2시간 동안 배양하여 PBS로 3번 세척하였다. 면역형광 신호를 공초점 레이저 주사현미경(LSM700; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 분석하였다.

실험예 8. 타원형 미엘린 측정

타원형 미엘린 인덱스는 차등간섭위상차(differential interference contrast, DIC)가 장착된 Zeiss Axioimager 정립 현미경을 사용하여 200 μm길이의 신경 섬유에서 계수된 타원형 미엘린의 수를 나타낸다.

실험예 9. 웨스턴 블럿 분석

축색 절단 후 3일째의 손상 부위 및 대조군에서 수득한 좌골신경을 방사성 면역침전 분석(Radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 버퍼[50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4), 150 mmol/L NaCl, 0.5% deoxycholic acid, 0.5% Triton X-100, 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mmol/L sodium o-vanadate, 및 19 protease inhibitor cocktail tablet(Roche Molecular Biochemicals, Nutley, NJ, USA)]에 균질화하여, 4℃에서 15분 동안 14,000 g로 원심분리한 후 상청액을 수득하였다.

10% SDS(sodium dodecyl sulfate) 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 사용하여 단백질 추출물을 전개한 후, PVDF(polyvinylidene difluoride) 막(Millipore, Bedford, MA, USA)으로 전기이동시켰다. TBS(Tris-buffered saline)에 Tween 20을 0.05%로 혼합한 용액(TBST)에 무지방 우유를 추가로 5% 혼합하여 제조한 용액을 4℃에서 밤새도록 막에 처리하여 블록킹한 후, 막을 25℃에서 1시간 동안 적절한 1차 항체와 함께 배양하였다. 상기 막을 TBST로 세척한 후, 고추냉이(horseradish) 유래 퍼옥시다제가 결합된 anti-goat, anti-mouse, 또는 anti-rabbit IgG 2차 항체와 함께 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 고추냉이 유래 퍼옥시다제를 화학 발광 시스템(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England)을 사용하여 시각화하였다.

실험예 10. 박절편 분석 및 전자현미경

좌골신경을 경비골 분기에 가깝게 5 mm로 절단하였다. 절단 부위에서 2 mm 길이의 좌골신경 조각을 절제한 후 2% PFA로 고정시켰다. 그 다음 2.5% glutaraldehyde를 함유한 0.1 M PB를 4℃에서 밤새도록 처리하였다. 샘플을 PB로 세척 후 2% 사산화오스뮴으로 120분 동안 고정시켰고, 에탄올의 농도를 점차적으로 증가시킨 에탄올을 단계적으로 처리하여 탈수시켜 포매제의 혼합물에 삽입하였다. 삽입된 샘플을 65℃에서 48시간 동안 오븐에서 건조시켰고, 상기 삽입된 블록을 다듬었다. 초박편제작기(Leica, EM UC7, Germany)를 사용하여 1 μm 박절편을 수득하였고, 광학현미경(Carl Zeiss) 관측을 위해 톨루이딘 블루로 상기 박절편을 염색하였다. 200 메쉬 구리 격자판 위의 80 nm 두께의 절편을 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트로 염색한 후, 80 kV의 가속전압을 가진 Hitachi H-7650 전자 현미경(Hitachi High-Technology Co., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

실험예 11. In vivo 치료

In vivo에서 NEM의 말초신경계 퇴행성 질환의 치료 효과를 확인하기 위해, 축색 절단 후 좌골신경 말초의 손상 부위를 1 mM N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide, NEM)(10 μL)를 함유한 겔폼으로 채워진 폴리염화비닐 관(10 mm)에 삽입하였다. 그 후 관을 근처 근육과 신경초에 봉합하여 고정하였다. 관 삽입 3일 후, NEM을 처리 또는 처리하지 않은 좌골신경을 제거하였다.

상기 좌골신경을 겸자(forcep)에 놓고 L-시스테인(Cys)(20 μM, 200 μM, 1 mM, 및 10 mM) 또는 vehicle(PBS)을 주입하였고, 이때 L-시스테인을 시각화하기 위해 Fast Green(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 함께 주입하였다. 상기 주입 시 신경 발작을 최소화하기 위해 미세한 모세관 현미주사 바늘(capillary microinjection needle)을 사용하였고, 25 μL Hamilton(Hamilton, Reno, NV, USA) 주사기에 부착된 Narishige puller(Narishige, Tokyo, Japan)를 사용하여 바늘을 뽑았다.

모든 데이터를 평균±평균의 표준오차(Standard error of the mean, SEM)로 나타내었다. 또한, 데이터를 Bonferroni post hoc tests를 사용하여 통계적으로 분석하였고, 4번 반복 실험 후 **p < 0.001 수준에서 차이가 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.

실시예 1. 손상된 신경 슈반 세포에서 시스타티오닌 γ-리아제( cystathionine γ- lyase , CSE )의 in vivo 상향조절 확인

손상된 신경에서 H₂S의 in vivo 효과를 확인하기 위해, 좌골신경 절단 후 H₂S 생산과 관련된 효소인 시스타티오닌 β-씬타제(cystathionine β-synthase, CBS), 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase, CSE), 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, MST), 및 시스테인 아미노트랜스퍼라제(cysteine aminotransferase, CAT)의 mRNA 발현을 RT-PCR을 통해 측정하였다.

그 결과, CBS의 mRNA는 좌골신경에서 발현되지 않은 반면, MST 및 CAT의 mRNA는 정상 좌골신경(대조군) 및 절단 후 3일째의 손상된 신경에서 동일하게 발현됨을 확인하였다(도 1a 및 1b). 그러나, CSE의 mRNA는 대조군과 비교하여 절단 후 3일째 손상된 신경에서 발현이 증가하여 상향조절되었음 확인하였다(도 1a 및 1b). 또한, 절단 후 3일째 손상된 신경에서 CSE는 상향조절되지만, MST는 대조군과 차이가 없음을 정량 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다(도 1c 및 1d).

아울러, 말초의 구조(슈반 세포 및 뉴런의 축색돌기)가 CSE 상향조절과 관련되어 있음을 확인하기 위해, CSE 및 특이적 세포 마커[S100, 슈반 세포; 신경미세섬유(NF), 축색돌기] 항체를 사용하여 좌골신경 단면을 면역염색하였다.

그 결과 공초점 이미지에서 CSE 양성 신호는 S100 양성 신호와 동일한 양상을 보이지만 NF 양성 신호와는 다른 양상을 나타냄을 확인하였다(도 1e). 또한, 좌골신경 섬유의 고배율 이미지에서 CSE 양성 신호는 슈반 세포의 세포질에 분포되어 있고, 절단 후 3일째의 슈반 세포에서 미성숙 슈반 세포 마커인 신경교의 섬유성 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)이 발현됨을 확인한 반면, 정상 슈반 세포에서는 CSE가 발현되지 않음을 확인하였다(도 2a).

이를 통해, H₂S 생산 효소인 CSE는 손상된 말초 신경, 특히 슈반 세포에서 상향조절되지만, 말초 신경 축색돌기에서는 상향조절되지 않음을 알 수 있었다.

실시예 2. N- 에틸말레이미드의 월러변성 ( Wallerian degeneration , WD ) 동안 H ₂ S 생산 억제 효과

ex vivo에서 좌골신경 절편을 사용하여, H₂S와 월러변성 사이의 연관성을 측정하였다. 한편, 생체외에서 3일(3DIV) 동안 배양하는 경우 정상 좌골신경의 줄무늬가 월러변성 동안 사라지므로, 상기 줄무늬를 신경퇴행의 마커로 사용할 수 있다.

먼저, 상기 퇴행 패턴을 이용하여 ex vivo의 절편 배양에서 줄무늬의 소실을 억제 또는 활성시키는 10종의 약물을 스크리닝하였다(도 3a). H₂S 생산 증폭제로서 L-시스테인(L-cysteine, Cys; 200 μM), S-아데노실-L-메싸이온(S-adenosyl-L-methione, SAM; 2 mM), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine, NAC; 50 lM), 글루타티온(glutathione, GSH; 500 μM), 및 디클로페낙(diclofenac, 500 μM)을 처리하였고, H₂S 생산 억제제로서, β-시아노-L-알라닌(β-cyano-L-alanine, BCA; 2 mM), DL-프로파글라이신(DL-proparglycine, PAG; 2 mM), 하이드록실아민(hydroxylamine, HA; 1 mM), 아미노-옥시아세테이트(amino-oxyacetate, AOA; 5 mM), 및 NEM(1 mM)을 처리하였다.

그 결과, H₂S 생산 억제제는 절편 배양에서 신경 퇴화를 억제함을 확인하였다(도 3a 및 3b). 또한, 신경 퇴화에 대한 AOA(CBS 억제제)의 효과는 BCA(CSE 억제제), PAG(CSE 억제제), HA(CBS 및 CSE 억제제), 및 NEM(모든 시스테인 펩티다제 억제제)보다 작음을 확인하여, CBS 억제제보다 CSE 억제제가 절편에서 줄무늬 소실 억제 효과가 더욱 큰 것을 알 수 있었다.

이를 통해, CSE 또는 MST의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제는 손상된 좌골신경의 퇴화를 억제함을 확인한바, 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, CSE 또는 MST의 발현 억제제인 BCA, PGA, HA, 및 NEM은 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, H₂S 가스가 월러변성 동안 좌골신경에서 생산되는지 여부를 확인하기 위해, 메틸렌 블루 분석법을 통해 좌골신경 절편에서 H₂S 생산량을 측정하였다. 그 결과, 생체외에서 3일(3DIV) 동안 배양한 경우 H₂S 생산량은 대조군과 비교하여 약물 미처리군(73.2 ± 2.1 μM) 및 Cys 처리군(64.8 ± 1.5 μM)에서 증가하지만, NEM 처리군(25.4 ±.1 μM)에서는 약물 미처리군에 비해 억제됨을 확인하였다(도 3c).

이를 통해, 월러변성 동안 손상된 좌골신경 절편에서 H₂S 가스가 증가하고, 이러한 H₂S 생산은 월러변성과 관련이 있음을 알 수 있었다. 따라서 H₂S 생산과 관련된 효소인 CSE 또는 MST의 발현 또는 활성을 억제하면 말초신경계 퇴행성 질환을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 월러변성 동안 PAG, HA, 및 NEM 각각의 CSE 발현 억제 효과를 웨스턴 블럿을 통해 측정한 결과, NEM이 가장 효과적으로 손상된 좌골신경에서 CSE 발현을 억제함을 확인하였다(도 3d). 또한, 모든 시스테인 펩티다제의 억제제인 NEM은 MST 발현을 억제하지만, PAG 및 HA는 MST 발현을 억제하지 못함을 확인하였다(도 3d). 아울러, 정량 데이터(도 3e) 및 공초점 이미지(도 3f)를 통해 월러변성 동안 PAG 및 HA보다 NEM이 CSE 발현을 가장 크게 억제함을 확인하였다.

이를 통해, NEM은 다른 H₂S 생산 억제제보다 CSE 및 MST 발현을 현저하게 억제함을 확인한바, 다른 억제제보다 효과적으로 H₂S 생산을 억제하여 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 및 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3. 신경퇴화와 H ₂ S 시그날링(signaling)의 관련성 확인

월러변성 동안 말초 신경은 축색돌기 재생 환경을 조성하기 위해 미엘린 절편화 및 축색돌기 퇴화가 일어나므로, H₂S가 미엘린 절편화와 관련 있는지 확인하기 위해, ex vivo에서 좌골신경의 미엘린 절편화와 관련된 형태학적 변화를 약물 처리 유무에 따라 분석하였다. 또한, 월러변성 동안 말초 신경에서 H₂S의 변화 측정 시 MST에 의해 생산되는 기초 대사산물인 H₂S에 의한 효과를 배제하기 위해 약물 중 NEM을 사용하였다.

그 결과, PAG, HA, 또는 NEM은 대조군 및 Cys와 비교하여 3DIV 동안 배양된 손상된 신경에서 타원형 미엘린이 형성되는 것을 저해함을 확인하였다(도 4a 및 4b). 또한, 도 5에서 염기성 단백질(MBP; 미엘린초 마커)이 대조군에서는 정상이지만, 3DIV 동안 배양된 손상된 신경(3DIV) 및 Cys 처리군(3DIV/Cys)의 좌골신경 섬유에서는 MBP 면역반응력이 감소하고, 타원형 또는 다발 구조가 증가함을 확인하였다. 그러나, PAG, HA, 또는 NEM 처리군은 상기 3DIV 및 3DIV/Cys와 비교하여 정상적인 MBP 염색을 나타내었다. 또한, 신경 절편의 박절편 분석을 통해 NEM은 미엘린초 절편화를 억제함을 확인하였다(도 4c).

이를 통해, 월러변성 동안 발생하는 미엘린 절편화에 H₂S가 필요함을 알 수 있었다.

또한, 월러변성 동안 발생하는 축색돌기 퇴화와 H₂S 생산과의 관련성을 분석하기 위해, NF 또는 축색돌기 마커로 좌골신경을 염색하였다 그 결과, 3DIV에는 일반적인 필라멘트 구조를 가지지 못하지만, PAG, HA, 또는 NEM을 처리한 절편은 정상적인 필라멘트 구조를 가짐을 확인하였다(도 4d). 또한, 정상 NF 수(도 4e) 및 웨스턴 블럿 분석(도 4f 및 4g)을 통해 PAG, HA 및 NEM이 축색돌기 퇴화 억제 효과를 가짐을 확인하였다. 또한, 좌골신경의 전자현미경 분석을 통해 NEM을 처리한 경우 축색원형질의 세로줄이 보호됨을 확인하여, NEM이 축색돌기의 세포골격을 보호함을 알 수 있었다(도 6a 및 6b).

이를 통해, 월러변성 동안 발생하는 타원형 미엘린 생성 및 축색돌기 퇴화에 H₂S 시그날링이 필요함을 알 수 있었다.

실시예 4. 슈반 세포 탈분화 및 증식과 H ₂ S 시그날링의 관련성 확인

H₂S가 월러변성 동안 발생하는 슈반 세포 탈분화와 관련 있는지 확인하기 위해, 슈반 세포 탈분화 마커 LAMP1, p75NTR, phosphor-p44/42 MAPK(pERK1/2), 및 c-Jun을 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

그 결과, 3DIV에 좌골신경 절편에서 상기 마커 단백질의 발현이 매우 증가하나, H₂S 생산 억제제인 HA 또는 NEM을 처리한 경우 상기 마커 단백질의 발현이 현저하게 억제됨을 확인하였다(도 7a 및 7b). 또한, LAMP1 또는 p75NTR의 면역염색과 정량분석을 통해서도 HA 또는 NEM을 처리한 경우 LAMP1 또는 p75NTR의 발현이 억제됨을 확인하였다(도 7c, 7d, 8a 및 8b).

이를 통해, H₂S 생산 억제제인 HA 또는 NEM을 처리한 경우 상기 슈반 세포 탈분화 마커 단백질의 발현이 현저하게 억제됨을 확인한바, CSE 또는 MST의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제는 H₂S 생산을 억제하여 슈반세포 탈분화를 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다.

아울러, 말초 신경의 미엘린 형성에 관련된 전자인자인 Krox20을 측정하여, 슈반 세포의 신경이 제거된 상태를 전사조절하는 것과 H₂S 시그날링과의 관련성을 분석하였다. 슈반 세포 탈분화 동안 Krox20의 발현이 하향조절되므로, 미엘린 형성에 대한 마커로서 Krox20을 사용하여 신경이 제거된 상태에서 슈반 세포의 미엘린 형성 조건을 확인하였다.

그 결과, 비록 Krox20의 면역반응성이 NEM이 처리된 슈반 세포의 세포질에서 확인되지 않을지라도, NEM을 처리하여 H₂S의 생산이 억제되면 좌골신경 절편에서 Krox20의 핵내 이동이 대조군과 유사하게 유지됨을 공초점 이미지를 통해 확인하였다(도 9a, 9b 및 10).

이를 통해, H₂S 시그날링은 월러변성 동안 발생하는 신경이 제거된 슈반 세포의 전사적 조절과 관련이 있음을 알 수 있었다.

월러변성 동안 슈반 세포의 증식은 효과적인 신경 재생에 중요한 역할을 하므로, NEM이 슈반 세포 증식을 억제하는지 확인하기 위해 Ki67(세포 증식 마커)를 면역염색하였다.

그 결과, Ki67 염색을 통해 NEM을 처리한 경우 그렇지 않은 경우에 비해 세포분열이 활발하지 않음을 확인하였다(도 11).

이를 통해, NEM을 처리하여 H₂S 생산을 억제하면 손상된 슈반 세포의 증식이 억제됨을 알 수 있었다.

실시예 5. in vivo에서 월러변성의 억제와 H ₂ S 시그날링의 관련성 확인

in vivo에서 월러변성에 대한 H₂S 시그날링의 효과를 확인하기 위해, in vivo에서 3일 동안 NEM(1 mM, 10 mM, 및 100 mM) 또는 대조군(PBS)을 처리한 좌골신경에서 타원형 미엘린의 수를 계수하였다.

그 결과, 축색 절단 3일 후 손상된 좌골신경에서 타원형 미엘린 수가 증가하지만, 처리한 NEM 농도에 따라 타원형 미엘린 수가 감소함을 확인하였다(도 12a). 또한, NEM을 처리하지 않은 경우 손상 3일째 NF가 심각하게 퇴화한 반면, NEM을 처리한 경우 NF의 퇴화가 현저하게 억제됨을 확인하였고(도 12b), 전자 현미경 사진을 통해 NEM에 의해 슈반세포에서 탈미엘린화가 억제됨을 확인하였다(도 12c 및 12d). 또한, 좌골신경의 박절편 분석을 통해 in vivo에서 NEM에 의해 축색돌기 퇴화가 억제됨을 확인하였다(도 13a 및 13b).

이를 통해, H₂S 생산을 억제하면 슈반 세포의 미엘린 절편화가 억제될 뿐만 아니라 in vivo에서 말초 신경 손상 후 축색돌기 퇴화가 억제됨을 알 수 있었다. 즉, H₂S 생산과 관련된 효소인 CSE 또는 MST의 발현 또는 활성을 억제하여 H₂S 생산을 억제하면 월러변성이 억제됨을 확인한바, CSE 또는 MST의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제는 말초신경계 퇴행성 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

아울러, 슈반 세포 탈분화를 유도하는 데에 필요한 H₂S 생산량이 충분한지 확인하기 위해 in vivo에서 3일 동안 Cys(20 μM, 200 μM, 1 mM, 및 10 mM) 또는 대조군(PBS)을 처리한 후 샘플 횡단면을 S100 및 p75NTR로 면역염색하였다.

그 결과 좌골신경은 처리된 Cys 농도에 따라 p75NTR 양성 슈반 세포가 증가함을 확인하였다(도 12e 및 12f).

이를 통해, in vivo에서 좌골신경의 슈반 세포 탈분화를 유도하는 데에 필요한 H₂S 생산량이 충분함을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating peripheral neurodegenerative diseases comprising an inhibitor of Hydrogen sulfide production <130> KPA141184KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat CBS forward <400> 1 atgctgcaga aaggcttcat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat CBS reverse <400> 2 caacaccaaa caccatcagc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat CSE forward <400> 3 cgcacaaatt gtccacaaac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat CSE reverse <400> 4 tgagcatgct gcagagtacc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat MST forward <400> 5 ccgagctctg gtatctgctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat MST reverse <400> 6 tcttgatgaa ggagggatcg 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat CAT forward <400> 7 gctagtactt gggacaaca 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat CAT reverse <400> 8 ctaggtctcc aatgcaaag 19 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase forward <400> 9 ctacatggtc tacatgttcc agtatg 26 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase reverse <400> 10 agttgtcatg gatgaccttg g 21

Claims (9)

1. 삭제
2. 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase) 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 억제제는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 microRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 약학적 조성물.
   
3. 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase) 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 억제제는 β-시아노-L-알라닌(β-cyano-L-alanine), DL-프로파글라이신(DL-proparglycine), 하이드록실아민(hydroxylamine), 및 N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 것인, 약학적 조성물.
   
4. 삭제
5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 말초 신경계 퇴행성 질환은 길리엄-바레 증후군, 샤르코-마리-투스 병, 당뇨병성 신경병증, 먼쪽척수근위축증, 안면신경마비, 중증근무력증, 말초신경손상, 영양성 신경병증, 수근관증후군, 및 기타 유전성 신경병증로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
   
6. 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase) 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
   상기 억제제는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 microRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 식품조성물.
   
7. 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase) 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
   상기 억제제는 β-시아노-L-알라닌(β-cyano-L-alanine), DL-프로파글라이신(DL-proparglycine), 하이드록실아민(hydroxylamine), 및 N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염인 것인, 식품 조성물.
   
8. 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase) 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물로서,
   상기 억제제는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 microRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 사료조성물.
   
9. 시스타티오닌 γ-리아제(cystathionine γ-lyase) 및 3-머캅토피루베이트 설퍼트랜스퍼라제(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 말초신경계 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물로서,
   상기 억제제는 β-시아노-L-알라닌(β-cyano-L-alanine), DL-프로파글라이신(DL-proparglycine), 하이드록실아민(hydroxylamine), 및 N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염인 것인, 사료 조성물.

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