WO2012043838A1 - Ｃ型肝炎ウイルスの感染抑制剤 - Google Patents

Ｃ型肝炎ウイルスの感染抑制剤 Download PDF

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WO2012043838A1
WO2012043838A1 PCT/JP2011/072682 JP2011072682W WO2012043838A1 WO 2012043838 A1 WO2012043838 A1 WO 2012043838A1 JP 2011072682 W JP2011072682 W JP 2011072682W WO 2012043838 A1 WO2012043838 A1 WO 2012043838A1
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WO
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hepatitis
cells
infectivity
hcv
agonist
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Application number
PCT/JP2011/072682
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English (en)
French (fr)
Inventor
誠 土方
阿部　雄一
脇田　隆字
一彰 茶山
Original Assignee
国立大学法人京都大学
国立感染症研究所長が代表する日本国
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to an infection inhibitor for hepatitis C virus, a preventive and / or therapeutic agent for a disease caused by hepatitis C virus (particularly, hepatitis C), and a treatment method. More specifically, the present invention relates to an infection inhibitor of hepatitis C virus, hepatitis C virus using a PGI 2 agonist, a Cox1 inhibitor, a thromboxane A 2 synthase inhibitor or a thromboxane A 2 antagonist. The present invention relates to a preventive and / or therapeutic drug for a disease that causes it (particularly hepatitis C), a therapeutic method, and the like.
  • HCV Hepatitis C virus
  • HCV is an RNA virus having an envelope, and is classified into the genus Hepacivirus of the Flaviviridae family. Even with the same hepatitis virus, the DNA virus, hepatitis B virus (HBV), is excluded by the immune mechanism and ends with an acute infection, even if it is infected, except in immature newborns and infants. On the other hand, the mechanism of HCV avoidance of the host immune mechanism is still unclear, and persistent infection is often established even when an adult with an advanced immune mechanism is infected. Symptoms of HCV-infected persons usually begin with hepatitis and progress to persistent hepatitis and often progress to chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. When hepatocellular carcinoma has progressed, even if the affected area is removed by surgery, persistent infection continues in the non-cancerous area, so the risk of recurrence of hepatocellular carcinoma is high.
  • HBV hepatitis B virus
  • PGI 2 an agonist of prostaglandin I 2
  • PGI 2 has a pharmacological action such as a platelet aggregation inhibitory action, a vasodilator action, and a gastric acid secretion inhibitory action.
  • a pharmacological action such as a platelet aggregation inhibitory action, a vasodilator action, and a gastric acid secretion inhibitory action.
  • there are therapeutic effects such as arteriosclerosis, thromboembolism, ischemic heart disease, gastric ulcer and skin ulcer (Patent Document 1 and Patent Document 2).
  • Drugs with indications for ulcers associated with chronic arterial occlusion, improvement of pain and cold feeling, primary pulmonary hypertension, pulmonary arterial hypertension and the like, which contain a PGI 2 agonist as an active ingredient, have already been sold.
  • Patent Document 3 describes that beraprost, a derivative of PGI 2 , is also effective in improving liver functions such as viral liver damage and liver cancer.
  • a naphthalene derivative having a specific structure which is a PGI 2 agonist has a platelet aggregation inhibitory action, a vasodilatory action, and an antihypertensive action. Therefore, it is effective for arterial occlusion, cerebrovascular disorder, gastric ulcer and the like.
  • Patent Document 5 describes that since a PGI 2 agonist has a tissue fibrosis inhibitory effect, it is effective for the treatment or prevention of liver diseases associated with fibrosis.
  • Cyclooxygenase (hereinafter sometimes referred to as Cox) is also called prostaglandin endoperoxide synthase.
  • Cox catalyzes the synthesis of prostaglandin endoperoxide (prostaglandin H 2 ) from arachidonic acid in the arachidonic acid cascade, and is one of the prompt enzymes for biosynthesis of prostaglandins and thromboxanes.
  • Cox has two types of isozymes, type 1 and type 2.
  • Cox inhibitors such as aspirin, indomethacin, lopion and ferden are known as non-steroidal anti-inflammatory drugs.
  • Cox inhibitors especially Cox1 inhibitors, have on C-type viruses.
  • Patent Document 3 administration of beraprost sodium to rats in which hepatic injury was induced by carbon tetrachloride or D-galactosamine resulted in a decrease in serum glutamate-oxaloacetate transaminase concentration (ie, inflammation).
  • PGI 2 agonists for the prevention or treatment of viral hepatitis, particularly hepatitis C.
  • Patent Document 4 only shows that a specific naphthalene derivative has an inhibitory action on platelet aggregation and an effect on arterial blood pressure. Such an action and treatment or prevention of liver diseases such as hepatitis, liver failure, and cirrhosis There is no description showing how these are related. That is, although Patent Document 4 describes that a specific naphthalene derivative is effective for the treatment or prevention of hepatitis, liver failure, cirrhosis, etc., it is merely a description without a rational basis.
  • Patent Document 5 shows that a specific test compound has an action of suppressing liver fibrosis.
  • liver fibrosis is a phenomenon that appears in liver tissue after hepatitis has continued and progressed for a long time, and is not a symptom directly caused by hepatitis C. Therefore, patent document 5 does not show at all whether the said specific compound is effective in the prevention and / or treatment of hepatitis C.
  • the present invention is different from symptomatic treatment that merely suppresses various inflammations caused by infection with hepatitis C virus, so that infection by hepatitis C virus itself is effectively suppressed to prevent inflammation.
  • An object of the present invention is to provide a medicine that can be used and is excellent in safety.
  • the present inventors have conducted extensive research and found that the expression of genes involved in the arachidonic acid cascade is related to the infectivity of hepatitis C virus.
  • Treatment of hepatitis C virus-infected cells with an inhibitor of Cox1 involved in the upstream of the gin synthesis system allows the infection of hepatitis C virus without affecting the viability of cells infected with hepatitis C virus. It was confirmed that only ability was suppressed.
  • the present inventors have repeated further research and trial and error, and after that, hepatitis C virus-infected cells are treated with a PGI 2 agonist, thereby affecting the proliferation of the cells. It was confirmed that it was possible to effectively suppress only the infectivity of the virus.
  • the inventors of the present invention significantly reduced the HCV genome replication in HCV particle-producing cells, their release, and the ability to infect HCV produced by suppressing the expression of mRNA encoding PGI 2 synthase (PGIS). It was confirmed that the PGI 2 signaling pathway is related to the entire life cycle of HCV, and that PGI 2 agonists are effective in suppressing infection with HCV virus. Furthermore, the present inventors suppress the infectivity of HCV without affecting the cell proliferation by blocking the thromboxane A 2 (TXA 2 ) signal pathway in addition to the PGI 2 agonist. I found that it was possible. And the present inventors confirmed that the infectivity of HCV was suppressed by PGI 2 agonist and TXA 2 synthase inhibitor using human hepatocyte chimeric mice.
  • PGI 2 signaling pathway is related to the entire life cycle of HCV, and that PGI 2 agonists are effective in suppressing infection with HCV virus.
  • the present inventors suppress the infectivity of HCV without
  • the inventors have completed the present invention as a result of further studies and improvements based on the above knowledge.
  • Item 1 Comprising an agonist of prostaglandin I 2, infection inhibitor of hepatitis C virus.
  • Item 2. Comprising an agonist of prostaglandin I 2, infectivity inactivation agent of hepatitis C virus.
  • Item 3. A method for inactivating the infectivity of hepatitis C virus, comprising a step of treating a sample containing hepatitis C virus with the inactivating agent according to item 2.
  • Item 4. Comprising an agonist of prostaglandin I 2, prophylactic and / or therapeutic agent for diseases caused by the hepatitis C virus.
  • Item 5. Item 5.
  • Item 6. An infection suppressor for hepatitis C virus, comprising an inhibitor of cyclooxygenase 1.
  • Item 7. A prophylactic and / or therapeutic agent for a disease caused by hepatitis C virus, comprising an inhibitor of cyclooxygenase 1.
  • a method for treating hepatitis C comprising a step of administering an agonist of prostaglandin I 2 to a patient in need of treatment for hepatitis C.
  • Item 10 A method for suppressing hepatitis C virus infection, comprising a step of administering a prostaglandin I 2 agonist to a patient infected with hepatitis C virus.
  • Item 11 A method for treating hepatitis C, comprising a step of administering an inhibitor of cyclooxygenase 1 to a patient in need of treatment for hepatitis C.
  • a method for suppressing infection with hepatitis C virus comprising a step of administering an inhibitor of cyclooxygenase 1 to a patient infected with hepatitis C virus.
  • Item 13 A method for inactivating the infectivity of hepatitis C virus, comprising a step of treating a sample containing hepatitis C virus with an inhibitor of cyclooxygenase 1.
  • Item 14 A hepatitis C virus infection inhibitor comprising a thromboxane A 2 synthase inhibitor or a thromboxane A 2 antagonist.
  • a hepatitis C virus infectivity inactivating agent comprising a thromboxane A 2 synthase inhibitor or a thromboxane A 2 antagonist.
  • Item 16 A method for inactivating the infectivity of hepatitis C virus, comprising a step of treating a sample containing hepatitis C virus with the inactivating agent according to item 15.
  • Item 17. A prophylactic and / or therapeutic agent for a disease caused by hepatitis C virus, comprising a thromboxane A 2 synthase inhibitor or a thromboxane A 2 antagonist.
  • Item 19 A method for treating hepatitis C, comprising a step of administering a thromboxane A 2 synthase inhibitor or a thromboxane A 2 antagonist to a patient in need of treatment for hepatitis C.
  • Item 20 A method for suppressing hepatitis C virus infection, comprising a step of administering a thromboxane A 2 synthase inhibitor or a thromboxane A 2 antagonist to a patient infected with hepatitis C virus.
  • treatment with a PGI 2 agonist, Cox1 inhibitor, thromboxane A 2 synthase inhibitor or thromboxane A 2 antagonist effectively suppresses / inhibits the ability to infect hepatitis C virus.
  • hepatitis C it is possible to effectively treat or prevent various diseases caused by (particularly hepatitis C).
  • the infection inhibitor of hepatitis C virus using the PGI 2 agonist, thromboxane A 2 synthase inhibitor or thromboxane A 2 antagonist of the present invention does not show significant cytotoxicity, Is also excellent.
  • the present invention only the infectivity of hepatitis C virus can be effectively reduced without significantly affecting the production of hepatitis C virus-infected cells themselves and virus particles thereby. It can be suppressed / inactivated.
  • FIG. 1 shows the effect of Cox1 inhibitor on JFH1 E2FL RNA copy number in recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 2 shows the effect of Cox1 inhibitor on the number of HCV particles (JFH1 E2FL RNA copy) produced from recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 3 shows the effect of Cox1 inhibitor on the viability of recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 4 shows the influence of the Cox1 inhibitor on the infectivity of HCV. The infectivity shown in the figure means the infectivity per HCV RNA in the culture supernatant.
  • FIG. 5 shows the effect of Cox2 inhibitor on the copy number of JFH1 E2FL RNA in recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 6 shows the effect of Cox2 inhibitor on the number of HCV particles (copy of JFH1 E2FL RNA) produced from recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 7 shows the effect of Cox2 inhibitors on the viability of recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 8 shows the effect of Cox2 inhibitors on the infectivity of HCV. The infectivity shown in the figure means the infectivity per HCV RNA in the culture supernatant.
  • FIG. 9 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on the copy number of JFH1 E2FL RNA in recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 10 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on the number of HCV particles (JFH1 E2FL RNA copy) produced from recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 11 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on the viability of recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 12 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on the infectivity of HCV. The infectivity shown in the figure means the infectivity per HCV RNA in the culture supernatant.
  • FIG. 13 shows the effect of PGI 2 agonist (BYM45778) on the copy number of JFH1 E2FL RNA in recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 14 shows the effect of PGI 2 agonist (BYM45778) on the number of HCV particles (JFH1 E2FL RNA copy) produced from recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 15 shows the survival rate of recombinant HuH-7 cells and the effect of suppressing the infectivity of HCV by a PGI 2 agonist (BYM45778).
  • the infectivity shown in the figure means the infectivity per HCV RNA in the culture supernatant.
  • FIG. 16 shows the results obtained by fractionating culture supernatants of cells treated with ONO1301 and untreated cells by sucrose density gradient ultracentrifugation and examining the amount of JFH1 RNA in each fraction.
  • FIG. 17 shows the results of examining the HCV infectivity of each fraction by fractionating culture supernatants of cells treated with ONO1301 and untreated cells by sucrose density gradient ultracentrifugation.
  • the infectivity shown in the figure means the infectivity per HCV RNA in the culture supernatant.
  • FIG. 18 shows the results of examining the infectivity suppression mechanism in Example 8.
  • the infectivity shown in the figure means the infectivity per HCV RNA in the culture supernatant.
  • FIG. 19 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on the copy number of J6 / JFH1 RNA released from recombinant HuH-7.5 cells.
  • FIG. 1 PGI 2 agonist
  • FIG. 20 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on the copy number of J6 / JFH RNA in recombinant HuH-7.5 cells.
  • FIG. 21 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on cell proliferation of recombinant HuH-7.5 cells.
  • FIG. 22 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on the infectivity of HCV produced from recombinant HuH-7.5 cells. The infectivity shown in the figure means the infectivity per HCV RNA in the culture supernatant.
  • FIG. 23 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on the copy number of J6 / JFH1 RNA released from recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 24 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on the copy number of J6 / JFH1 RNA in recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 25 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on cell proliferation of recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 26 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on the infectivity of HCV produced from recombinant HuH-7 cells. The infectivity shown in the figure means the infectivity per HCV RNA in the culture supernatant.
  • FIG. 27 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on the copy number of JFH1 E2FL RNA released from recombinant HuH-7.5 cells.
  • FIG. 28 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on the copy number of JFH1 E2FL RNA in recombinant HuH-7.5 cells.
  • FIG. 29 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on cell proliferation of recombinant HuH-7.5 cells.
  • FIG. 30 shows the effect of PGI 2 agonist (ONO1301) on the infectivity of HCV produced from recombinant HuH-7.5 cells. The infectivity shown in the figure means the infectivity per HCV RNA in the culture supernatant.
  • FIG. 31 shows that the expression of mRNA encoding PGIS was suppressed by siRNA.
  • FIG. 32 shows the effect on the copy number of JFH1 RNA released from recombinant HuH-7 cells by suppressing the expression of mRNA encoding PGIS.
  • FIG. 33 shows the effect on the copy number of JFH1 RNA in recombinant HuH-7 cells by suppressing the expression of mRNA encoding PGIS.
  • FIG. 34 shows the effect of suppressing the expression of mRNA encoding PGIS on the survival rate in recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 35 shows the influence on the infectivity of HCV produced from recombinant HuH-7 cells by suppressing the expression of mRNA encoding PGIS. The infectivity shown in the figure means the infectivity per HCV RNA in the culture supernatant.
  • Figure 36 shows the effect on JFH1 RNA copy number recombinant Huh7 cells by thromboxane A 2 synthetase inhibitors (Ozagrel).
  • Figure 37 shows the effect on JFH1 RNA copy number released from recombinant Huh7 cells by thromboxane A 2 synthetase inhibitors (Ozagrel).
  • FIG. 38 shows the effect of thromboxane A 2 synthase inhibitor (Ozagrel) on viability of recombinant Huh7 cells.
  • FIG. 39 shows the effect of thromboxane A 2 synthase inhibitor (Ozagrel) on the infectivity of HCV produced from recombinant Huh7 cells.
  • the infectivity shown in the figure means the infectivity per HCV RNA in the culture supernatant.
  • Figure 40 shows that expression of mRNA encoding the thromboxane A 2 synthetase by siRNA is suppressed.
  • FIG. 41 shows the effect of suppressing the expression of mRNA encoding thromboxane A 2 synthase on the copy number of JFH1 RNA in recombinant HuH-7 cells.
  • Figure 42 illustrates thromboxane by hexane A 2 synthetase inhibiting expression of mRNA encoding, the effect on the number of copies of the JFH1 RNA released from recombinant HuH-7 cells.
  • Figure 43 is due to suppression of the expression of mRNA encoding the thromboxane A 2 synthetase, showing the effect on survival of recombinant HuH-7 cells.
  • FIG. 44 shows the influence on the infectivity of HCV produced from recombinant HuH-7 cells by suppressing the expression of mRNA encoding thromboxane A 2 synthase. The infectivity shown in the figure means the infectivity per HCV RNA in the culture supernatant.
  • FIG. 45 shows the therapeutic effects of various IP agonists using HCV-infected human hepatocyte chimeric mice.
  • hepatitis C virus infection inhibitor containing a prostaglandin I 2 agonist, Cox1 inhibitor, thromboxane A 2 synthase inhibitor or thromboxane A 2 antagonist is appropriately described as “invention of the present invention.
  • An infectivity inhibitor of hepatitis C virus including a prostaglandin I 2 agonist, an inhibitor of Cox1, or a thromboxane A 2 synthase inhibitor or a thromboxane A 2 antagonist.
  • Hepatitis C virus which is referred to as “infectivity inactivating agent of the present invention” as appropriate and contains a prostaglandin I 2 agonist, Cox 1 inhibitor, thromboxane A 2 synthase inhibitor or thromboxane A 2 antagonist
  • An agent for preventing and / or treating a disease caused by is referred to as “the pharmaceutical of the present invention” as appropriate.
  • Prostaglandin I 2 is a kind of prostaglandin having a 6,9-epoxide structure, and is also called prostacyclin. It has been conventionally known that PGI 2 exerts a powerful platelet aggregation controlling action, vasodilatory action, and gastric acid secretion inhibiting action by binding to its receptor (IP). However, PGI 2 is chemically unstable and its use as a medicament is very limited. Therefore, various PGI 2 agonists (hereinafter referred to as PGI 2 agonists) that can bind to the PGI 2 receptor have been developed.
  • the PGI 2 agonist operably linked to the IP receptor, a substance showing an action similar to that of PGI 2, for example, a PGI 2 derivative.
  • PGI 2 agonists are also called IP agonists.
  • a compound known as an antagonist of PGI 2 as long as it exhibits agonistic by adjusting the dose, contained in PGI 2 agonist of the present invention.
  • PGI 2 agonist in the present invention can be used without limitation agonist PGI 2 which are agonists and later developed conventionally known PGI 2.
  • Representative PGI 2 agonists that can be used in the present invention include, for example, decaprost, beraprost, ibudilast, ozagrel, isvogrel, iloprost, epoprostenol, ONO-1301, MRE-269, carbaprostacyclin, climprost, ataprost, Examples include cyprosten, naxaprosten, taprosten, pimiprost, phthalazinol, CH-169, CS570, SM109, OP-2507, TRA-418, TY-11223, Octimibate, samixogrel, treprostinBYM45778, and the like.
  • a preferred PGI 2 agonist is an orally administrable PGI 2 agonist, for example, beraprost.
  • Cyclooxygenase 1 is an enzyme involved in a reaction for synthesizing prostaglandin G 2 (PGG 2 ) from arachidonic acid and a reaction for synthesizing prostaglandin H 2 (PGH 2 ) from PGG 2 .
  • the Cox1 inhibitor usable in the present invention is not particularly limited as long as it has a property capable of inhibiting the catalytic action of the reaction by Cox1, and has a known and later-developed Cox1 inhibitory action. Substances can be appropriately selected and used.
  • Cox1 inhibitor examples include salicylic acid inhibitors such as aspirin, etenzamide, and diflunisal, propionic acids such as oxoprofen, oxonine, zactoprofen, flurbiprofen, ketoprofen, ibuprofen, and naproxen.
  • salicylic acid inhibitors such as aspirin, etenzamide, and diflunisal
  • propionic acids such as oxoprofen, oxonine, zactoprofen, flurbiprofen, ketoprofen, ibuprofen, and naproxen.
  • anthranilic acid inhibitors such as mefenamic acid, arylacetic acid inhibitors such as diclofenac, indomethacin, sulindac, mofezolac, nabumetone, oxicam inhibitors such as ampioxicam, meloxicam, piroxicam, lornoxicam, and FR122047, SC -560 and the like.
  • a more preferable Cox1 inhibitor from the viewpoint of low cytotoxicity and excellent safety is one that selectively inhibits the enzyme activity of Cox1, such as ketoprofen and SC-560.
  • preferred Cox1 inhibitors from the viewpoint of high inhibitory effect are indomethacin, aspirin, and oxaprozin.
  • the thromboxane A 2 synthetase inhibitor by inhibiting the enzyme activity to synthesize thromboxane A 2, is a substance having an effect of inhibiting the synthesis of thromboxane A 2.
  • Thromboxane A 2 synthetase inhibitors which can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance having an action to suppress the biosynthesis of thromboxane A 2, known and thromboxane A 2 synthesis to be developed in the future An enzyme inhibitor can be appropriately selected and used.
  • Specific examples of thromboxane A 2 synthase inhibitors include ozagrel.
  • a thromboxane A 2 antagonist is a substance having an action of inhibiting the binding of thromboxane A 2 to its receptor.
  • the thromboxane A 2 antagonists usable in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance having the action of the appropriate thromboxane A 2 antagonists developed known thromboxane A 2 antagonists and the future You can select and use.
  • Specific thromboxane A 2 antagonists include ramatropan and seratrodast.
  • PGI 2 agonists, Cox1 inhibitors, thromboxane A 2 synthase inhibitors, and thromboxane A 2 antagonists exemplified above are all known and are commercially available or synthesized according to known methods. It is possible.
  • PGI 2 agonists, Cox1 inhibitors, thromboxane A 2 synthase inhibitors, and thromboxane A 2 antagonists as listed above may be in the form of pharmaceutically acceptable salts.
  • Pharmaceutically acceptable salts include, for example, salts with alkali metals such as sodium and potassium, salts with alkaline earth metals such as calcium and magnesium, ammonia, methylamine, dimethylamine, cyclopentylamine, benzylamine, Salts with piperidine, monoethanolamine, diethanolamine, monomethylmonoethanolamine, tromethamine, lysine, tetraalkylammonium, tris (hydroxymethyl) aminomethane, salts with mineral acids such as sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, sulphur And salts with organic acids such as acid, lactic acid, tartaric acid, fumaric acid, maleic acid, methanesulfonic acid and benzenesulfonic acid.
  • PGI 2 agonist, Cox1 inhibitor, thromboxane A 2 synthase inhibitor, and thromboxane A 2 antagonist as exemplified above are isomers (geometric isomers, optical isomers), hydrates, solvents Japanese and crystal forms may be used.
  • the PGI 2 agonist, Cox1 inhibitor, thromboxane A 2 synthase inhibitor, and thromboxane A 2 antagonist may be in the form of a prodrug thereof.
  • BPS-314d can be mentioned as an optical isomer
  • NS304 can be mentioned as a prodrug of MRE-269 which is a PGI 2 agonist.
  • the infection suppressant, infectivity inactivating agent, and medicament of the present invention may contain only one kind of PGI 2 agonist, Cox1 inhibitor, thromboxane A 2 synthase inhibitor, or thromboxane A 2 antagonist.
  • two or more kinds of PGI 2 agonists, Cox1 inhibitors, thromboxane A 2 synthase inhibitors, and thromboxane A 2 antagonists may be included in appropriate combinations.
  • an infection suppressant, an infectious agent, or a pharmaceutical comprising a combination of a PGI 2 agonist and a thromboxane A 2 synthase inhibitor or a thromboxane A 2 antagonist is one preferred embodiment.
  • the infection inhibitor of hepatitis C virus of the present invention may contain only a PGI 2 agonist, a Cox 1 inhibitor, a thromboxane A 2 synthase inhibitor, or a thromboxane A 2 antagonist. It can also be combined with a pharmaceutically acceptable carrier, an excipient, other additives, and the like.
  • a carrier or excipient known in the art can be appropriately selected and used.
  • water, ethanol, lactose, microcrystalline cellulose examples thereof include liquid paraffin, hydrogenated oil, beeswax, squalane, stearyl alcohol, ethylene glycol and the like.
  • additives known additives in the art can be appropriately selected and used.
  • disintegrants starch etc.
  • binders hydroxypropylcellulose, low-substituted hydroxypropylcellulose
  • lubricants Sud as talc and glyceryl stearate
  • antioxidants such as parabens
  • preservatives such as parabens
  • coating agents such as gelatin and hydroxypropylcellulose
  • coloring agents such as gelatin and hydroxypropylcellulose
  • flavoring agents such as sodium ellamate
  • surfactants Sorbitan fatty acid ester, etc.
  • plasticizer humectant (glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, hyaluronic acid, etc.) and the like.
  • the infection suppressant, infectivity inactivating agent and medicament of the present invention can be made into various forms.
  • it can be made into dosage forms such as tablets, granules, powders, capsules, liquids, gels, plasters, ointments, creams, patches, aerosols and the like.
  • it is a dosage form suitable for oral administration from the viewpoint of easy handling, and is a tablet, granule or capsule.
  • a PGI 2 agonist or Cox1 inhibitor When a PGI 2 agonist or Cox1 inhibitor is administered to a human by using the infection suppressant, infectivity inactivating agent, and medicament of the present invention, the PGI 2 agonist, Cox1 inhibitor, thromboxane A 2 synthase inhibitor, or thromboxane A
  • the dose of 2 antagonists varies depending on age, weight, symptoms, therapeutic effect, administration method or treatment time.
  • oral administration it can usually be administered once to several times a day in the range of 1 ng to 100 mg per adult per person.
  • parenteral administration it can be administered parenterally once to several times a day in the range of 0.1 ng to 50 mg per adult per person.
  • the infection control agent, infectivity inactivating agent, and medicament of the present invention can suppress the spread of hepatitis C virus by suppressing or inactivating the infectivity of hepatitis C virus. It is useful for the prevention and / or treatment of diseases caused by infection with hepatitis C virus.
  • the disease caused by the hepatitis C virus that can be prevented and / or treated using the infection control agent, infectivity inactivating agent, and medicament of the present invention may be caused by infection with the hepatitis C virus.
  • the disease to be prevented and / or treated by the infection control agent, infectivity inactivating agent and medicament of the present invention is hepatitis C, but in another embodiment prevention and / or treatment.
  • a preferred disease of interest is one or more selected from the group consisting of cryoglobulinemia, membranoproliferative glomerulonephritis, Sjogren's syndrome, malignant B lymphoma and lichen planus.
  • the infection control agent, infectivity inactivating agent, and medicament of the present invention can effectively suppress the spread of infection from cells infected with hepatitis C virus. Therefore, when the infection inhibitor, infectivity inactivating agent, or medicament of the present invention is administered to a patient, the timing of such administration is chronic hepatitis, cirrhosis or liver due to persistent infection after infection with hepatitis C virus. It is preferably done before developing into cell cancer. From the viewpoint of preventing rapid infection, it is also preferable to administer the medicament of the present invention at the onset of acute or fulminant hepatitis due to hepatitis C virus.
  • the infection suppressor and infectivity inactivating agent of the present invention can be used not only for treating humans infected with hepatitis C virus, but also for treating the infection by treating cells or tissues infected with hepatitis C ex vivo. It can also be used to suppress expansion.
  • the method for treating cells, tissues, etc. is not particularly limited, but, for example, a culture medium for cells infected with hepatitis C virus with the infection inhibitor or infectivity inactivating agent (ie, PGI 2 agonist or Cox1 inhibitor) of the present invention. It is possible to carry out by adding and culturing.
  • infectious HCV particles are produced, for example, in a hollow fiber three-dimensional culture system as disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-4802. Cells in which HCV derived from hepatitis C patient blood has been infected.
  • the infection inhibitor or infectivity inactivating agent of the present invention may be administered to an HCV-infected model animal in which a model animal such as a chimeric mouse holding not only cells but also a human liver is infected with hepatitis C virus. Is possible.
  • the concentration or volume of the PGI 2 agonist, Cox1 inhibitor, thromboxane A 2 synthase inhibitor, or thromboxane A 2 antagonist when processing such a sample depends on its purpose, sample type, etc. Can be set as appropriate.
  • Each cell used in the following examples was cultured as follows.
  • EGF Epidermal growth factor
  • TOYOBO Epidermal growth factor
  • penicillin Streptomycin Nacalai Tesque, Kyoto, Japan
  • fetal bovine serum 5% human fetal serum
  • DMSO dimeth Dulbecco supplemented with l sulfoxide
  • the cells were embedded in a gel that had been hardened by warming the plastic petri dish at 37 ° C., and then a HuS-E / 2 medium was further added thereto, and the medium was maintained at 37 ° C., 5% CO 2, saturated steam constant temperature bath. In culture.
  • Test Example 1 Production of infectious HCV particle-producing cells JFH1 E2FL (recombinant HCV in which a Flag tag sequence was introduced into E2 protein of JFH1) expression plasmid or J6 / JFH1 expression plasmid was mixed with competent cells (DH5 ⁇ strain) Cooled on ice water for 30 minutes. Next, it was left to stand in a water bath at 42 ° C. for 2 minutes, and left to stand on ice water for 5 minutes. The cell suspension containing the transformant was mixed with LB medium (10 g of Bacto trypton, 5 g of dry yeast extract, 5 g of NaCl, and 1 g of glucose were added in 1 L, and adjusted to pH 7.2), and then ampicillin-containing LB.
  • LB medium (10 g of Bacto trypton, 5 g of dry yeast extract, 5 g of NaCl, and 1 g of glucose were added in 1 L, and adjusted to pH 7.2
  • JFH1 E2FL plasmid DNA and J6 / JFH1 plasmid DNA were cleaved with Xba1 to form single-stranded DNA, and then extracted by phenol / chloroform extraction.
  • JFH1 E2FL RNA and J6 / JFH1 RNA were synthesized using 2 ⁇ g of linear JFH1 E2FL DNA and J6 / JFH1 DNA separately as templates.
  • Megascript T7 Promega, Tokyo, Japan
  • the synthesized RNA was extracted by a phenol / chloroform extraction method, adjusted to a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ l, and stored at ⁇ 80 ° C.
  • RNA obtained above was introduced into human hepatoma cell-derived cell line HuH-7 or HuH-7.5 cells by electroporation.
  • OPTI-MEM Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
  • electroporation was performed at 250 mA and 950 ⁇ F using Gene Pulser 2 (BIO-RAD, Tokyo, Japan).
  • the cell / RNA mixture was suspended in DMEM medium and cultured in a plastic petri dish.
  • JHH1 E2FL RNA or J6 / JFH1 RNA was replicated in the cells to obtain recombinant HuH-7 cells and HuH-7.5 cells that produced infectious HCV particles.
  • Example 1 Addition of Cox1 inhibitor to infectious HCV-producing HuH-7
  • the infectious HCV particle-producing HuH-7 cells prepared in Test Example 1 were given Cox1 inhibitor FR122047, and the effect thereof was examined.
  • Infectious HCV particle-producing recombinant HuH-7 cells were cultured for 3 days in Dulbecco's modified Eagle medium (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) supplemented with FR1202047 at a concentration of 1.0 ⁇ M, 3.3 ⁇ M or 10 ⁇ M. As shown in the examples below were investigated for the following four items: (1) copy number of the JFH1 E2FL RNA in a cell, (2) copy number of the JFH1 E2FL RNA in culture, survival (3) Cell Rate, (4) infectivity of HCV in the culture supernatant.
  • Example 2 Effect of Cox1 inhibitor on HCV-RNA replication and production RNA present in cells or cultures treated in Example 1 was extracted by the following procedure.
  • the cells were washed with 1 ⁇ PBS ( ⁇ ) (NaCl 8 g / l, Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O 2.9 g / l, KCl 0.2 g / l, KH 2 PO 4 0.2 g / l). Then, it was released from the dish by trypsinization at 37 ° C. for 3 minutes. The released cells were transferred to a 15 ml plastic tube and centrifuged at 1500 rpm for 3 minutes to precipitate. After removing the supernatant, it was dissolved in Sepasol 1 super (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) and used for RNA extraction.
  • the culture solution was transferred into a 30 ml syringe (Terumo, Japan) and filtered through a Disposable Sterile Syringe Filter 22 ⁇ m pore, 20 mm (AGC Techno Glass, Shizuoka, Japan). Further, 20 mM HEPES (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) was added to the filtered culture solution, and then transferred to Amicon Ultra 10k (Millipore, Massachusetts, USA), followed by centrifugation at 3500 rpm for an appropriate time. The concentration rate of the final culture solution was about 100 to 150 times. The concentrated culture solution and the culture solution were dissolved in Sepasol 2 super (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) and used for RNA extraction before RNA extraction. RNA extraction was performed according to the protocol accompanying the product.
  • RT primer HCV 5′UTR reverse transcription reaction (virusRNA ⁇ cDNA); 5′-TGCTCATGGTGCACGGTCTA-3 ′ (SEQ ID NO: 1) HCV 5′UTR F: Primer for Real-time PCR; 5′-CGGGAGAGCCATAGTGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 2) HCV 5′UTR R: Primer for Real-time PCR; 5′-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 3) HCV 5′UTR Probe: Probe for Real-time PCR; 5′-CTGCGGAACCGGTGGATACAC-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
  • Cox1 does not significantly affect the amount of HCV RNA replicated in cells producing infectious HCV, regardless of whether it is intracellular or in culture. became.
  • Example 3 Effect of Cox1 inhibitor on cell viability
  • the viability of cells treated in Example 1 was analyzed by XTT assay using Cell Proliferation kit II (Roche, Basel, Switzerland). The assay was performed according to the protocol supplied with the product. The result is shown in FIG.
  • Example 4 Effect of Cox1 inhibitor on infectivity of HCV Collagen type 1 Rat tail (BD biosciences, California, USA) for collagen coating 8well-chamber glass plate (Nalge Nunc International, New York, USA) 0.02N acetic acid aqueous solution containing / ml was added to each well at 200 ⁇ l / well. After allowing to stand at room temperature for 1 hour, the wells were washed twice with 1 ⁇ PBS ( ⁇ ). Collagen I-coated plates were seeded with HuH7.5 cells suspended in 5% FBS-containing DMEM at 4.0 ⁇ 10 4 / well and incubated overnight.
  • the cells were first washed with PBS, and then fixed by reacting 4 mass% paraform aldehyde at room temperature for 20 minutes. Next, after washing with 1 ⁇ PBS ( ⁇ ), the cells were treated with 0.05 mass% Triton X-100 at room temperature for 15 minutes. After washing with 1 ⁇ PBS ( ⁇ ), the primary antibody is diluted at an arbitrary magnification in a solution in which 10% fetal bovine serum and 1% bovine serum albumin are mixed in 1 ⁇ PBS ( ⁇ ), and the cells are incubated at room temperature. The reaction was performed for 90 minutes. As a primary antibody, anti-HCV antibody-containing patient-derived human serum No. 3 was used.
  • the secondary antibody was diluted at an arbitrary magnification in a solution in which 10% fetal bovine serum and 1% bovine serum albumin were mixed in 1 ⁇ PBS ( ⁇ ). This mixed solution and the sample washed four times were reacted at room temperature for 30 minutes.
  • the secondary antibody used at this time was Alexa 488 anti-human antibody (all manufactured by Invitrogen, California, USA). Further, 4 ', 6-diamidino-2-phenyllinole (DAPI) was used for nuclear staining. Light shielding was performed during the secondary antibody reaction.
  • the sample was washed 4 times with 1 ⁇ PBS ( ⁇ ), and prepared with a mounting agent (0.1% by mass phenylenediamine, 10% by mass polyvinyl alcohol, 100 mM Tris-HCl pH 8.7, 5% by mass Glycerol). Embedded above. The stained sample was observed with a fluorescence microscope BioZero (Keyence, Japan). During the infectivity analysis, 10 images were taken per well. The number of infected cells found in these 10 photographed images was counted and the amount was compared, and the change in infectivity was analyzed between the treated samples. The result is shown in FIG.
  • Comparative Example 1 Effect of Cox2 inhibitor on infectious HCV-producing cells
  • Cox2 inhibitor subjected to the same tests and analysis as in Examples 1 to 4 using COX2 inhibitor 1 (manufactured by Merck) instead of Cox1 inhibitor was added so that the concentration in the culture solution was 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M, or 10 ⁇ M.
  • 5 Results for copy number JFH1 E2FL RNA in cells
  • Figure 6 the results for the number of copies of the JFH1 E2FL RNA in culture
  • FIG. 7 the results for cell viability, culture supernatants of HCV The results regarding infectivity are shown in FIG.
  • Example 5 Effect of PGI 2 agonist on infectious HCV-producing cells I Cox1 instead of inhibitor, using a PGI 2 agonist ONO1301 (Sigma-aldrich Co.), the same tests as in Example 1-4, was examined the effect on the infectious HCV producing cells.
  • ONO1301 was added so that the density
  • the results for cell viability, culture supernatants of HCV The results regarding infectivity are shown in FIG.
  • Example 6 Effect of PGI 2 agonist on infectious HCV producing cells II
  • the test was conducted in the same manner as in Examples 1 to 4 using BYM45778 (manufactured by Sigma-aldrich) instead of ONO1301 as the PGI 2 agonist.
  • BYM45778 was added so that the concentration in the culture solution was 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M, 10 ⁇ M, 25 ⁇ M, or 50 ⁇ M.
  • Example 7 Study on suppression of infectivity of HCV particles
  • culture supernatants of cells treated with ONO1301 and untreated cells were used. Concentrated and fractionated by sucrose density gradient ultracentrifugation. Then, the JFH1 RNA amount and infectivity of each fraction were analyzed. The results showing the RNA amount in each fraction are shown in FIG. 16, and the results showing the infectivity of each fraction are shown in FIG.
  • the virus particle fraction in both samples showed a distribution similar to the fraction showing the buoyant density reported so far.
  • infectivity was significantly reduced in each fraction in the culture supernatant of the cells treated with the PGI 2 agonist. That is, it was found that the production of virus-like particles produced in the culture supernatant by the treatment with ONO1301 was not inhibited, but the infectivity was remarkably reduced.
  • the PGI 2 agonist does not suppress the production of HCV particles from cells infected with HCV but has a function of suppressing the infectivity of the produced HCV particles.
  • Example 8 Examination of Infectivity Inhibition Mechanism Whether the infectious ability suppression effect of HCV particles by PGI 2 agonists confirmed in Examples 5 to 7 works on HCV particle-producing cells and induces changes in the particles themselves Alternatively, it was investigated whether or not this treatment produced factors that inhibit infectivity from cells. That is, HuH7 cells into which JFH1 RNA was not introduced were treated with ONO1301, the culture supernatant was collected, added to the culture supernatant from HCV particle-producing cells containing infectious JFH1 particles, and the infectivity was analyzed. .
  • Example 9 Effect of PGI 2 agonist on infectious HCV-producing cells III
  • Each test performed in Example 5 was performed using Huh7.5 cells into which J6 / JFH1 RNA had been introduced instead of recombinant HuH-7 cells.
  • ONO1301 which is an IP agonist, also suppresses HCV infectivity in a concentration-dependent manner for Huh7.5 cells.
  • FIG. 19 shows the results regarding the copy number of J6 / JFH1 RNA in the culture medium by ONO1301
  • FIG. 20 shows the results regarding the same RNA copy number in the cells
  • FIG. 21 shows the results regarding the cell viability
  • FIG. The results regarding the infectivity of are shown in FIG.
  • Example 10 Effect of PGI 2 agonist on infectious HCV-producing cells IV
  • Huh7 cells introduced with J6 / JFH1 RNA as recombinant HuH-7 cells.
  • ONO1301 which is an IP agonist, suppresses HCV infectivity in a concentration-dependent manner even for Huh7 cells into which J6 / JFH1 RNA has been introduced.
  • FIG. 23 shows the results regarding the copy number of J6 / JFH1 RNA in the culture medium by ONO1301
  • FIG. 24 shows the results regarding the same RNA copy number in the cells
  • FIG. 25 shows the results regarding the cell viability
  • FIG. The results regarding the infectivity of are shown in FIG.
  • Example 11 Effect of PGI 2 agonist on infectious HCV-producing cells V
  • Each test performed in Example 5 was performed using Huh7.5 cells into which JFH1 E2FL RNA had been introduced as recombinant HuH-7 cells.
  • ONO1301 which is an IP agonist, also suppresses HCV infectivity in a concentration-dependent manner against Huh7.5 cells into which JFH1 E2FL RNA has been introduced.
  • FIG. 27 shows the results regarding the copy number of JFH1 E2FL RNA in the culture medium by ONO1301
  • FIG. 28 shows the results regarding the same RNA copy number in the cells
  • FIG. 29 shows the results regarding the cell viability
  • FIG. The results regarding infectivity are shown in FIG.
  • Example 12 Inhibition of mRNA expression of PGI 2 synthase
  • PGIS mRNA encoding PGI 2 synthase
  • SiRNA against PGIS was purchased from Santa cruz.
  • siRNA for control was purchased from Thermoscience. These were introduced simultaneously with the introduction of JFH1 E2FL RNA into Huh7 cells, and after 3 days, the amount of mRNA in the cells and in the culture medium was measured according to the method of Example 2. In addition, according to Examples 3 and 4, the effect on cell growth rate and HCV infectivity was observed.
  • FIG. 31 shows that expression of mRNA encoding PGIS is suppressed by siRNA.
  • FIG. 32 shows the results regarding the copy number of JFH1 E2FL RNA in the culture medium
  • FIG. 33 shows the results regarding the same RNA copy number in the cells
  • FIG. 34 shows the results regarding the cell viability
  • FIG. The results regarding infectivity are shown in FIG. From these results, it was confirmed that by suppressing the expression of mRNA encoding PGIS, all of the replication and release of HCV genome and the ability to infect HCV were significantly increased, and the PGI 2 signal pathway was replicated and released of HCV. And all of the infectivity was confirmed.
  • TXA 2 synthase in Huh7 cells into which JFH1 E2FL RNA was introduced.
  • siRNA for TXAS was purchased from Santa cruz.
  • siRNA for control was purchased from Thermoscience. These were introduced simultaneously with the introduction of JFH1 E2FL RNA into Huh7 cells, and after 3 days, the amount of mRNA in the cells and in the culture medium was measured according to the method of Example 2. In addition, according to Examples 3 and 4, the effect on cell growth rate and HCV infectivity was observed.
  • FIG. 40 shows that the expression of mRNA encoding TXAS is suppressed by siRNA.
  • the results relating to the copy number of JFH1 E2FL RNA in the culture medium are shown in FIG. 41, the results relating to the same RNA copy number in the cells are shown in FIG. 42, the results relating to the viability of the cells are shown in FIG.
  • the results regarding infectivity are shown in FIG. From these results, it was confirmed that the suppression of the expression of TAXS mRNA hardly affected the replication of HCV genome, its release and cell viability, but the HCV infectivity was remarkably suppressed. This result and the results of Example 15, is considered to blockade of TXA 2 signaling pathway is also effective in infectivity inhibition of HCV.
  • Example 15 Examination of Infection Transmission Suppression Effect Using Human Hepatocyte Chimeric Mice ONO1301 (100 ⁇ g / mouse subcutaneous injection twice a day), beraprost sodium (5 ⁇ g / mouse oral administration twice daily) and Ozagrel (150 ⁇ g / mouse oral administration twice daily) were administered separately.
  • drug administration was started from the first week after infection with HCV derived from the patient, and blood HCV titer at 2, 3, and 4 weeks after infection was compared with the untreated group.
  • the administration of all the drugs decreased the blood HCV titer level in the second and third weeks after infection compared to the untreated group (FIG. 45).

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Abstract

Ｃ型肝炎ウイルスによる感染による各種の炎症を単に抑える対症療法とは異なり、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染自体を効果的に抑制して炎症を生じないようにすることが可能であり、且つ、安全性に優れた医薬を提供することを目的とする。 プロスタグランジンＩ２のアゴニストを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染抑制剤を提供する。

Description

Ｃ型肝炎ウイルスの感染抑制剤
　本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの感染抑制剤、Ｃ型肝炎ウイルスが引き起こす疾患（特に、Ｃ型肝炎）の予防及び／又は治療薬、並びに治療方法に関する。より詳細には、本発明は、ＰＧＩ２アゴニスト、Ｃｏｘ１阻害剤、或いはトロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤又はトロンボキサンＡ２拮抗剤を利用したＣ型肝炎ウイルスの感染抑制剤、Ｃ型肝炎ウイルスが引き起こす疾患（特に、Ｃ型肝炎）の予防及び／又は治療薬、並びに治療方法等に関する。
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　Ｖｉｒｕｓ）の感染はその感染患者数の多さ及び肝癌発症の原因となることから、社会的に重要な問題である。
　ＨＣＶは、エンベロープを有するＲＮＡウイルスであり、フラビウイルス科のＨｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ属に分類される。同じ肝炎ウイルスであっても、ＤＮＡウイルスであるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、免疫能の未熟な新生児、乳幼児期以外では、たとえ感染しても免疫機構により排除され急性感染で終わる。これに対して、ＨＣＶの宿主免疫機構回避の機序はいまだ明らかではなく、免疫機構の発達した大人に感染した場合でも、持続感染が成立することが多い。ＨＣＶ感染者の症状は、通常肝炎から始まり、持続感染により、多くの場合、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌へと進展する。肝細胞癌まで進展した場合、手術により患部を摘出しても、非癌部で引き続き持続感染が起こるため、肝細胞癌再発の危険性は高い。
　このようなＣ型肝炎の治療は、１年間にも及ぶインターフェロンとリバビリンを用いた最新の治療法でも著効例は５０～６０％である。よって、社会的な負担の軽減のためにも、さらに有効な治療法の開発が望まれている。
　近年ＨＣＶのプロテアーゼに対する阻害剤が開発され、新たな抗ＨＣＶ治療薬として期待されているが、重度の副作用を伴い、薬剤耐性株の出現も報告されており、その効果も不明な点あるため、解決すべき問題は残されている。
　プロスタグランジンＩ２（以下、ＰＧＩ２と表記する場合もある）のアゴニストは、血小板凝集抑制作用、血管拡張作用、胃酸分泌抑制作用といった薬理作用を有することが従来から知られており、血栓症、動脈硬化症、血栓閉塞症、虚血性心疾患、胃潰瘍、皮膚潰瘍等の治療効果があることが知られている（特許文献１及び特許文献２）。ＰＧＩ２アゴニストを有効成分とする、慢性動脈閉塞症に伴う潰瘍、疼痛及び冷感の改善、原発性肺高血圧症、及び肺動脈高血圧症等を適応症とした医薬は既に販売されている。
　ＰＧＩ２アゴニストと肝臓疾患との関係に関して、特許文献３には、ＰＧＩ２の誘導体であるベラプロストが、ウイルス性肝障害や肝癌などの肝機能の改善にも有効であるとの記載がある。特許文献４には、ＰＧＩ２アゴニストである特定の構造を有するナフタレン誘導体が、血小板凝集阻害作用、血管拡張作用、抗高血圧作用を有し、それゆえ、動脈閉塞症、脳血管障害、胃潰瘍等に加えて、肝炎、肝不全、肝硬変等の治療及び／又は予防に使用できるとの記載がある。特許文献５には、ＰＧＩ２アゴニストは組織線維化抑制作用を有するため、線維化を伴った肝疾患の治療又は予防に有効であることが記載されている。
　シクロオキシゲナーゼ（以下、Ｃｏｘと表記する場合もある）は、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼとも呼ばれる。Ｃｏｘは、アラキドン酸カスケードにおいて、アラキドン酸からプロスタグランジンエンドペルオキシド（プロスタグランジンＨ２）の合成を触媒し、プロスタグランジン類やトロンボキサンの生合成の律即酵素の一つである。Ｃｏｘには、１型と２型の２種類のアイソザイムが存在する。
　アスピリン、インドメタシン、ロピオン、フェルデン等種々のＣｏｘ阻害剤が非ステロイド性抗炎症薬として知られている。しかし、Ｃｏｘ阻害剤、中でもＣｏｘ１の阻害剤がＣ型関連ウイルスに対して如何なる作用を有するのかということについては、殆ど（あるとすれば）報告はない。
特開平８－１０９１６２号公報 特開昭５８－１２４７７８号公報 ＷＯ ９３／０７８７６ ＷＯ ９５／２４９３９ ＷＯ ０２／０８５４１２
　本発明者等は、上述のような従来の知見について検討を行った。特許文献３においては、四塩化炭素又はＤ－ガラクトサミンによって肝障害を誘発させたラットにベラプロストナトリウムを投与することにより、血清中のグルタミン酸－オキザロ酢酸トランスアミナーゼの濃度が低下したこと（即ち、単に炎症の程度が軽減されたこと）等が示されているに過ぎず、ウイルス性の肝炎、特にＣ型肝炎の予防又は治療に対するＰＧＩ２アゴニストの有効性を示す根拠は何も示されていない。
　特許文献４では、特定のナフタレン誘導体が、血小板凝集の阻害作用及び動脈血圧に対する影響を有することが示されるのみで、そのような作用と肝炎、肝不全、肝硬変等の肝疾患の治療又は予防との間に如何なる関連性があるのかを示す記載はない。即ち、特許文献４には、特定のナフタレン誘導体が肝炎、肝不全、肝硬変等の治療又は予防に有効であるとの記載はあるものの、それは合理的根拠の無い単なる記載である。
　特許文献５では、特定の試験化合物によって肝線維化の抑制作用があることが示されている。しかし、肝線維化は、肝炎が長期間にわたり継続し、進行した後に肝組織において現れる現象であって、Ｃ型肝炎によって直接的に生じる症状ではない。よって、特許文献５は、Ｃ型肝炎の予防及び／又は治療に当該特定の化合物が有効であるかどうかは何ら示していない。
　このように、肝炎、その中でもウイルス性のＣ型肝炎の治療又は予防に対するＰＧＩ２アゴニストの有効性は従来、実質的には何の知見も示されていなかった。また、Ｃ型肝炎に伴う炎症を緩和／改善するだけではなく、Ｃ型肝炎ウイルスの根治に繋がる、Ｃ型肝炎ウイルスの感染自体を抑制でき、且つ、安全性に優れたＣ型肝炎の治療薬及び治療方法は知られていなかった。
　このような現状の下、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染による各種の炎症を単に抑える対症療法とは異なり、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染自体を効果的に抑制して炎症を生じないようにすることが可能であり、且つ、安全性に優れた医薬を提供することを目的とする。
　上記のような課題を解決すべく、本発明者らは、鋭意研究を重ね、アラキドン酸カスケードに関与する遺伝子の発現がＣ型肝炎ウイルスの感染性と関連性を有することを見出し、さらにプロスタグランジン合成系の上流に関与するＣｏｘ１の阻害剤でＣ型肝炎ウイルス感染細胞を処理することにより、Ｃ型肝炎ウイルスが感染した細胞の生存率には影響を与えることなく、Ｃ型肝炎ウイルスの感染能力のみが抑制されることを確認した。このような知見を基に本発明者等は、更なる研究及び試行錯誤を繰り返した末、ＰＧＩ２アゴニストでＣ型肝炎ウイルス感染細胞を処理することにより、細胞の増殖性には影響を与えることなく、ウイルスの感染性のみを効果的に抑制することが可能であることを確認した。
　また、本発明者等は、ＰＧＩ２合成酵素（ＰＧＩＳ）をコードするｍＲＮＡの発現を抑制することにより、ＨＣＶ粒子産生細胞におけるＨＣＶゲノムの複製とその放出及び産生されるＨＣＶの感染能が顕著に上昇することを確認し、ＰＧＩ２シグナル経路がＨＣＶの生活環全体と関連性があること、及び、ＰＧＩ２アゴニストがＨＣＶウイルスの感染抑制に効果的であることを再確認した。更に、本発明者等は、ＰＧＩ２アゴニストに加えて、トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）シグナル経路を遮断することによっても、細胞の増殖性には影響を与えることなくＨＣＶの感染能を抑制することが可能であることを見出した。そして、本発明者等は、ヒト肝細胞キメラマウスを用いて、ＰＧＩ２アゴニスト及びＴＸＡ２合成酵素阻害剤に、ＨＣＶの感染能が抑制されることを確認した。
　本発明者等は、以上のような知見に基づき、更なる検討と改良を重ねた結果、本発明を完成した。
　以下に、代表的な本発明を示す。
項１．　プロスタグランジンＩ２のアゴニストを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染抑制剤。
項２．　プロスタグランジンＩ２のアゴニストを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染能不活化剤。
項３．　Ｃ型肝炎ウイルスを含む試料を項２に記載の不活化剤で処理する工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染能を不活性化する方法。
項４．　プロスタグランジンＩ２のアゴニストを含む、Ｃ型肝炎ウイルスによって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療剤。
項５．　Ｃ型肝炎ウイルスによって引き起こされる疾患がＣ型肝炎である、項４に記載の予防及び／又は治療剤。
項６．　シクロオキシゲナーゼ１の阻害剤を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染抑制剤。
項７．　シクロオキシゲナーゼ１の阻害剤を含む、Ｃ型肝炎ウイルスによって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療剤。
項８．　Ｃ型肝炎ウイルスによって引き起こされる疾患がＣ型肝炎である、項７に記載の予防及び／又は治療剤。
項９．　Ｃ型肝炎の治療が必要な患者にプロスタグランジンＩ２のアゴニストを投与する工程を含む、Ｃ型肝炎の治療方法。
項１０．　Ｃ型肝炎ウイルスが感染した患者にプロスタグランジンＩ２のアゴニストを投与する工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染を抑制する方法。
項１１．　Ｃ型肝炎の治療が必要な患者にシクロオキシゲナーゼ１の阻害剤を投与する工程を含む、Ｃ型肝炎の治療方法。
項１２．　Ｃ型肝炎ウイルスが感染した患者にシクロオキシゲナーゼ１の阻害剤を投与する工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染を抑制する方法。
項１３．　Ｃ型肝炎ウイルスを含む試料をシクロオキシゲナーゼ１の阻害剤で処理する工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染能を不活性化する方法。
項１４．　トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤又はトロンボキサンＡ２拮抗剤を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染抑制剤。
項１５．　トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤又はトロンボキサンＡ２拮抗剤を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染能不活化剤。
項１６．　Ｃ型肝炎ウイルスを含む試料を項１５に記載の不活化剤で処理する工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染能を不活化する方法。
項１７．　トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤又はトロンボキサンＡ２拮抗剤を含む、Ｃ型肝炎ウイルスによって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療剤。
項１８．Ｃ型肝炎ウイルスによって引き起こされる疾患がＣ型肝炎である、項１７に記載の予防及び／又は治療剤。
項１９．Ｃ型肝炎の治療が必要な患者にトロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤又はトロンボキサンＡ２拮抗剤を投与する工程を含む、Ｃ型肝炎の治療方法。
項２０．Ｃ型肝炎ウイルスが感染した患者にトロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤又はトロンボキサンＡ２拮抗剤を投与する工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染を抑制する方法。
　本発明によれば、ＰＧＩ２アゴニスト、Ｃｏｘ１阻害剤、或いはトロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤又はトロンボキサンＡ２拮抗剤で処理することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの感染能力を効果的に抑制／不活性化することができる。よって、従来の対症療法とは異なり、本発明を利用することにより、効果的にＣ型肝炎ウイルス感染の拡大を抑制し、Ｃ型肝炎ウイルスの感染による種々の炎症・疾患を抑制することができる。従って、本発明の感染抑制剤、不活化剤、医薬を用いることにより（特に、持続感染が成立して慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌へと発展する前に用いることにより）、Ｃ型肝炎ウイルスによって引き起こされる種々の疾患（特に、Ｃ型肝炎）を効果的に治療又は予防することが可能である。また、本発明のＰＧＩ２アゴニスト或いはトロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤又はトロンボキサンＡ２拮抗剤を利用したＣ型肝炎ウイルスの感染抑制剤は、顕著な細胞毒性は見られないため、安全性にも優れている。更に、本発明を利用することにより、Ｃ型肝炎ウイルスが感染した細胞自体やそれによるウイルス粒子の産生には顕著な影響を与えることなく、Ｃ型肝炎ウイルスの感染能だけを効果的に低減／抑制／不活化することが可能である。
図１は、Ｃｏｘ１阻害剤による組み換えＨｕＨ－７細胞内のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図２は、Ｃｏｘ１阻害剤による組み換えＨｕＨ－７細胞から産生されたＨＣＶ粒子（ＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー）数に対する影響を示す。 図３は、Ｃｏｘ１阻害剤による組み換えＨｕＨ－７細胞の生存率への影響を示す。 図４は、Ｃｏｘ１阻害剤によるＨＣＶの感染能に対する影響を示す。図に示される感染性とは、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ当たりの感染性を意味する。 図５は、Ｃｏｘ２阻害剤による組み換えＨｕＨ－７細胞内のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図６は、Ｃｏｘ２阻害剤による組み換えＨｕＨ－７細胞から産生されたＨＣＶ粒子（ＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー）数に対する影響を示す。 図７は、Ｃｏｘ２阻害剤による組み換えＨｕＨ－７細胞の生存率への影響を示す。 図８は、Ｃｏｘ２阻害剤によるＨＣＶの感染能に対する影響を示す。図に示される感染性とは、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ当たりの感染性を意味する。 図９は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７細胞内のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図１０は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７細胞から産生されたＨＣＶ粒子（ＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー）数に対する影響を示す。 図１１は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７細胞の生存率への影響を示す。 図１２は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）によるＨＣＶの感染能に対する影響を示す。図に示される感染性とは、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ当たりの感染性を意味する。 図１３は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＢＹＭ４５７７８）による組み換えＨｕＨ－７細胞内のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図１４は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＢＹＭ４５７７８）による組み換えＨｕＨ－７細胞から産生されたＨＣＶ粒子（ＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー）数に対する影響を示す。 図１５は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＢＹＭ４５７７８）による組み換えＨｕＨ－７細胞の生存率及びＨＣＶの感染能抑制効果を示す。図に示される感染性とは、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ当たりの感染性を意味する。 図１６は、ＯＮＯ１３０１で処理した細胞と未処理の細胞の培養上清をショ糖密度勾配超遠心法によって分画して、各画分のＪＦＨ１　ＲＮＡ量を調べた結果を示す。 図１７は、ＯＮＯ１３０１で処理した細胞と未処理の細胞の培養上清をショ糖密度勾配超遠心法によって分画して、各画分のＨＣＶ感染能を調べた結果を示す。図に示される感染性とは、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ当たりの感染性を意味する。 図１８は、実施例８において、感染能抑制機構を検討した結果を示す。図に示される感染性とは、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ当たりの感染性を意味する。 図１９は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７．５細胞から放出されるＪ６／ＪＦＨ１　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図２０は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７．５細胞内のＪ６／ＪＦＨ　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図２１は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７．５細胞の細胞増殖する影響を示す。 図２２は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７．５細胞から産生されるＨＣＶの感染能に対する影響を示す。図に示される感染性とは、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ当たりの感染性を意味する。 図２３は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７細胞から放出されるＪ６／ＪＦＨ１　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図２４は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７細胞内のＪ６／ＪＦＨ１　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図２５は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７細胞の細胞増殖に対する影響を示す。 図２６は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７細胞から産生されるＨＣＶの感染能に対するする影響を示す。図に示される感染性とは、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ当たりの感染性を意味する。 図２７は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７．５細胞から放出されるＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図２８は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７．５細胞内のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図２９は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７．５細胞の細胞増殖に対する影響を示す。 図３０は、ＰＧＩ２アゴニスト（ＯＮＯ１３０１）による組み換えＨｕＨ－７．５細胞から産生されるＨＣＶの感染能に対する影響を示す。図に示される感染性とは、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ当たりの感染性を意味する。 図３１は、ｓｉＲＮＡによってＰＧＩＳをコードするｍＲＮＡの発現が抑制されたことを示す。 図３２は、ＰＧＩＳをコードするｍＲＮＡの発現抑制による、組み換えＨｕＨ－７細胞から放出されるＪＦＨ１　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図３３は、ＰＧＩＳをコードするｍＲＮＡの発現抑制による、組み換えＨｕＨ－７細胞中のＪＦＨ１　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図３４は、ＰＧＩＳをコードするｍＲＮＡの発現抑制による、組み換えＨｕＨ－７細胞中の生存率に対する影響を示す。 図３５は、ＰＧＩＳをコードするｍＲＮＡの発現抑制による、組み換えＨｕＨ－７細胞中から産生されるＨＣＶの感染能に対する影響を示す。図に示される感染性とは、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ当たりの感染性を意味する。 図３６は、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤（Ｏｚａｇｒｅｌ）による組換えＨｕｈ７細胞中のＪＦＨ１　ＲＮＡコピー数に対する影響を示す。 図３７は、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤（Ｏｚａｇｒｅｌ）による組換えＨｕｈ７細胞から放出されるＪＦＨ１　ＲＮＡコピー数に対する影響を示す。 図３８は、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤（Ｏｚａｇｒｅｌ）による組換えＨｕｈ７細胞の生存率に対する影響を示す。 図３９は、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤（Ｏｚａｇｒｅｌ）による組換えＨｕｈ７細胞から産生されるＨＣＶの感染能に対する影響を示す。図に示される感染性とは、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ当たりの感染性を意味する。 図４０は、ｓｉＲＮＡによってトロンボキサンＡ２合成酵素をコードするｍＲＮＡの発現が抑制されたことを示す。 図４１は、トロンボキサンＡ２合成酵素をコードするｍＲＮＡの発現抑制による、組み換えＨｕＨ－７細胞内のＪＦＨ１　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図４２は、トロンボキサンＡ２合成酵素をコードするｍＲＮＡの発現抑制による、組み換えＨｕＨ－７細胞から放出されるＪＦＨ１　ＲＮＡのコピー数に対する影響を示す。 図４３は、トロンボキサンＡ２合成酵素をコードするｍＲＮＡの発現抑制による、組み換えＨｕＨ－７細胞の生存率に対する影響を示す。 図４４は、トロンボキサンＡ２合成酵素をコードするｍＲＮＡの発現抑制による、組み換えＨｕＨ－７細胞から産生されるＨＣＶの感染能に対する影響を示す。図に示される感染性とは、培養上清中のＨＣＶ　ＲＮＡ当たりの感染性を意味する。 図４５は、ＨＣＶ感染したヒト肝細胞キメラマウスを用いた各種ＩＰアゴニストによる治療効果を示す。
　本明細書においては、プロスタグランジンＩ２のアゴニスト、Ｃｏｘ１阻害剤、或いはトロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤又はトロンボキサンＡ２拮抗剤を含むＣ型肝炎ウイルスの感染抑制剤を適宜「本発明の感染抑制剤」と表記し、プロスタグランジンＩ２のアゴニスト、Ｃｏｘ１の阻害剤、或いはトロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤又はトロンボキサンＡ２拮抗剤を含むＣ型肝炎ウイルスの感染能不活化剤を適宜「本発明の感染能不活化剤」と表記し、プロスタグランジンＩ２のアゴニスト、Ｃｏｘ１の阻害剤、或いはトロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤又はトロンボキサンＡ２拮抗剤を含むＣ型肝炎ウイルスによって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療剤を適宜「本発明の医薬」と表記する。
　プロスタグランジンＩ２とは、６，９－エポキシド構造を有するプロスタグランジンの一種であり、プロスタサイクリンとも呼ばれる。ＰＧＩ２は、その受容体（ＩＰ）に結合することで強力な血小板凝集制御作用、血管拡張作用、及び胃酸分泌抑制作用を発揮することが従来から知られている。しかし、ＰＧＩ２は化学的に不安定であり、その医薬としての利用は非常に制限されている。そのため、ＰＧＩ２の受容体に結合することができる種々のＰＧＩ２のアゴニスト（以下、ＰＧＩ２アゴニストと表記する）が開発されている。
　本発明において、ＰＧＩ２アゴニストとは、ＩＰ受容体に作動的に結合し、ＰＧＩ２と同様の作用を示す物質であり、例えば、ＰＧＩ２誘導体である。ＰＧＩ２アゴニストは、ＩＰアゴニストとも呼ばれる。また、ＰＧＩ２のアンタゴニストとして知られる化合物であっても、投与量を調整することによってアゴニスト作用を示すものであれば、本発明のＰＧＩ２アゴニストに含まれる。
　本発明におけるＰＧＩ２アゴニストとしては、従来から公知のＰＧＩ２のアゴニスト及び今後開発されるＰＧＩ２のアゴニストを制限なく使用することができる。本発明に使用可能な代表的なＰＧＩ２アゴニストとしては、例えば、シカプロスト、ベラプロスト、イブジラスト、オザグレル、イスボグレル、イロプロスト、エポプロステノール、ＯＮＯ－１３０１、ＭＲＥ－２６９、カルバプロスタサイクリン、クリンプロスト、アタプロスト、シプロステン、ナクサプロステン、タプロステン、ピミルプロスト、フタラジノール、ＣＨ－１６９、ＣＳ５７０、ＳＭ１０９、ＯＰ－２５０７、ＴＲＡ－４１８、ＴＹ－１１２２３、Ｏｃｔｉｍｉｂａｔｅ、ｓａｍｉｘｏｇｒｅｌ、ｔｒｅｐｒｏｓｔｉｎｉｌＢＹＭ４５７７８等を挙げることができる。これらの中でも好ましいＰＧＩ２アゴニストは、経口投与可能なＰＧＩ２アゴニストであり、例えば、ベラプロストである。
　シクロオキシゲナーゼ１（Ｃｏｘ１）とは、アラキドン酸からプロスタグランジンＧ２（ＰＧＧ２）を合成する反応及びＰＧＧ２からプロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）を合成する反応に関与する酵素である。本発明において使用可能なＣｏｘ１阻害剤は、Ｃｏｘ１による、前記反応の触媒作用を阻害することが可能な性質を有する物であれば特に制限されず、公知の及び今後開発されるＣｏｘ１阻害作用を有する物質を適宜選択して使用することが可能である。
　本発明に使用可能なＣｏｘ１阻害剤としては、例えば、アスピリン、エテンザミド、ジフルニサル等のサリチル酸系阻害剤、オキソプロフェン、オキソニン、ザクトプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、イブプロフェン、ナプロキセン等のプロピオン酸系阻害剤、メフェナム酸等のアントラニル酸系阻害剤、ジクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、モフェゾラク、ナブメトン等のアリール酢酸系阻害剤、アンピオキシカム、メロキシカム、ピロキシカム、ロルノキシカム等のオキシカム系阻害剤、並びに、ＦＲ１２２０４７、ＳＣ－５６０等を挙げることができる。
　細胞毒性が低く、安全性に優れているという観点からより好ましいＣｏｘ１阻害剤は、Ｃｏｘ１の酵素活性を選択的に阻害するものであり、例えば、ケトプロフェン、ＳＣ－５６０である。また、阻害効果が高いという観点から好ましいＣｏｘ１阻害剤は、インドメタシン、アスピリン、オキサプロジンである。
　トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤とは、トロンボキサンＡ２を合成する酵素活性を阻害することにより、トロンボキサンＡ２の合成を阻害する作用を有する物質である。本発明において使用可能なトロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤は、トロンボキサンＡ２の生合成を抑制する作用を有する物質であれば特に制限されず、公知の及び今後開発されるトロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤を適宜選択して使用することが可能である。具体的なトロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤としては、オザグレルを挙げることができる。
　トロンボキサンＡ２拮抗剤とは、トロンボキサンＡ２がその受容体に結合することを阻害する作用を有する物質である。本発明において使用可能なトロンボキサンＡ２拮抗剤とは、前記の作用を有する物質であれば特に制限されず、公知のトロンボキサンＡ２拮抗剤及び今後開発されるトロンボキサンＡ２拮抗剤を適宜選択して使用することができる。具体的なトロンボキサンＡ２拮抗剤としてはラマトロパン及びセラトロダストを挙げることができる。
　上記に例示したＰＧＩ２アゴニスト、Ｃｏｘ１阻害剤、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤、及びトロンボキサンＡ２拮抗剤はいずれも公知であり、商業的に入手可能であるか、公知の手法に従って合成することが可能である。
　上記に列挙したようなＰＧＩ２アゴニスト、Ｃｏｘ１阻害剤、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤、及びトロンボキサンＡ２拮抗剤は、薬学的に許容し得る塩の形態であっても良い。薬学的に許容し得る塩とは、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩、アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、シクロペンチルアミン、ベンジルアミン、ピペリジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノメチルモノエタノールアミン、トロメタミン、リジン、テトラアルキルアンモニウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどとの塩、硫酸、塩酸、リン酸などの鉱酸との塩、酢酸、シュウ酸、乳酸、酒石酸、フマール酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などである。例えば、ＰＧＩ２アゴニストであるベラプロストの場合、ナトリウム塩としてベラプロストナトリウムを挙げることができ、このナトリウム塩は薬効的により好ましい。
　上記に例示するようなＰＧＩ２アゴニスト、Ｃｏｘ１阻害剤、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤、及びトロンボキサンＡ２拮抗剤は、その異性体（幾何異性体、光学異性体）、水和物、溶媒和物、結晶形であってもよい。また、ＰＧＩ２アゴニスト、Ｃｏｘ１阻害剤、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤、及びトロンボキサンＡ２拮抗剤は、そのプロドラッグの形態であってもよい。例えば、ＰＧＩ２アゴニストであるベラプロストナトリウムの場合、光学異性体としてＢＰＳ－３１４ｄを挙げることができ、ＰＧＩ２アゴニストであるＭＲＥ－２６９のプロドラッグとしてＮＳ３０４を挙げることができる。
　本発明の感染抑制剤、感染能不活化剤、及び医薬は、１種類のＰＧＩ２アゴニスト、Ｃｏｘ１阻害剤、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤、又はトロンボキサンＡ２拮抗剤のみを含んでいてもよく、２種類以上のＰＧＩ２アゴニスト、Ｃｏｘ１阻害剤、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤、及びトロンボキサンＡ２拮抗剤を適宜組み合わせて含んでいてもよい。例えば、ＰＧＩ２アゴニストとトロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤又はトロンボキサンＡ２拮抗剤とを併用した感染抑制剤、感染不能化剤、或いは医薬は、１つの好ましい実施形態である。また、本発明のＣ型肝炎ウイルスの感染抑制剤は、ＰＧＩ２アゴニスト、Ｃｏｘ１阻害剤、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤、又はトロンボキサンＡ２拮抗剤のみを含んでいてもよく、必要に応じて薬学的に許容される担体、腑形剤、その他の添加剤等と組み合わせることも可能である。
　薬学的に許容される担体又は賦形剤としては、当該技術分野に公知の担体又は腑形剤を適宜選択して使用することができるが、例えば、水、エタノール、乳糖、微晶性セルロース、流動パラフィン、硬化油、蜜蝋、スクワラン、ステアリルアルコール、エチレングリコール等を挙げることができる。添加剤としては当該技術分野において公知の添加剤を適宜選択して使用することができるが、例えば、崩壊剤（デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース）、滑沢剤（タルク、ステアリン酸グリセリンなど）、抗酸化剤、保存剤（パラベン等）、コーティング剤（ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、着色料、矯味矯臭剤、美白剤（エラグ酸ナトリウムなど）、界面活性剤（ソルビタン脂肪酸エステルなど）、可塑剤、保湿剤（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヒヤルロン酸など）等を挙げることができる。
　本発明の感染抑制剤、感染能不活化剤及び医薬は、種々の形態にすることがでる。例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、硬膏剤、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、エアゾール剤などの剤形とすることができる。好ましくは、取り扱いが容易であるという観点から経口投与に適した剤形であり、錠剤、顆粒剤、カプセル剤である。
　本発明の感染抑制剤、感染能不活化剤及び医薬によりＰＧＩ２アゴニスト又はＣｏｘ１阻害剤をヒトに投与する場合、ＰＧＩ２アゴニスト、Ｃｏｘ１阻害剤、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤、又はトロンボキサンＡ２拮抗剤の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法又は処理時間等により異なる。例えば、経口投与の場合は、通常、成人一人当たり、一回につき、１ｎｇから１００ｍｇの範囲で一日一回から数回投与することができる。非経口投与の場合は、成人一人当たり、一回につき、０．１ｎｇから５０ｍｇの範囲で一日一回から数回非経口投与することができる。
　本発明の感染制御剤、感染能不活化剤、及び医薬は、Ｃ型肝炎ウイルスの感染能を抑制又は不活化することにより、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染の拡大を抑制することが可能であるため、Ｃ型肝炎ウイルスが感染することによって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療に有用である。本発明の感染制御剤、感染能不活化剤、及び医薬を用いて予防及び／又は治療することが可能なＣ型肝炎ウイルスによって引き起こされる疾患は、Ｃ型肝炎ウイルスの感染に起因するものであれば特に制限されないが、例えば、Ｃ型肝炎、クリオグロブリン血症、膜性増殖性糸球体腎炎、シェーグレン症候群、悪性Ｂリンパ腫、扁平苔癬等を挙げることができる。好適な一実施形態において、本発明の感染制御剤、感染能不活化剤、及び医薬によって予防及び／又は治療される疾患は、Ｃ型肝炎であるが、他の実施形態において予防及び／又は治療対象となる好ましい疾患は、クリオグロブリン血症、膜性増殖性糸球体腎炎、シェーグレン症候群、悪性Ｂリンパ腫及び扁平苔癬から成る群より選択される一種以上である。
　本発明の感染制御剤、感染能不活化剤、及び医薬は、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した細胞からの感染が拡大することを効果的に抑制することが可能である。従って、本発明の感染抑制剤、感染能不活化剤、又は医薬が患者に投与される場合、そのような投与のタイミングは、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染後、持続感染によって慢性肝炎、肝硬変又は肝細胞癌へと発展する前に行われることが好ましい。また、急速な感染を防ぐという観点から、Ｃ型肝炎ウイルスによる急性あるいは劇症肝炎発症時に本発明の医薬等を投与することも好ましい。
　本発明の感染抑制剤及び感染能不活化剤は、Ｃ型肝炎ウイルスに感染したヒトの治療だけでなく、Ｃ型肝炎に感染した細胞や組織等をｅｘ　ｖｉｖｏで処理することにより、その感染の拡大を抑制するために使用することも可能である。細胞や組織等の処理方法は、特に制限されないが、例えば、本発明の感染抑制剤又は感染能不活化剤（即ち、ＰＧＩ２アゴニスト又はＣｏｘ１阻害剤）をＣ型肝炎ウイルスが感染した細胞の培地中に添加して培養することにより実施することが可能である。このような処理に供されるＣ型肝炎ウイルスが感染した細胞の培養系としては、たとえば、特開２０１０－４８０２号公報に開示されるような中空糸立体培養系において、感染性ＨＣＶ粒子を産生することが可能な細胞にＣ型肝炎患者血由来のＨＣＶを感染させたものが挙げられる。
　また、細胞だけでなくヒト肝臓を保持するキメラマウス等のモデル動物にＣ型肝炎ウイルスを感染させたＨＣＶ感染モデル動物に対して本発明の感染抑制剤又は感染能不活化剤を投与することも可能である。
　そのような試料を処理するための場合のＰＧＩ２アゴニスト、Ｃｏｘ１阻害剤、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害剤、又はトロンボキサンＡ２拮抗剤の濃度又は容量は、その目的や試料の種類等に応じて適宜設定することができる。
　下記の実施例で使用した各細胞は、次のように培養した。
　Ａ．ヒト肝癌細胞由来培養細胞株Ｈｕｈ７細胞及びＨｕｈ７．５細胞
１０％のウシ胎児血清、０．１ ｍｇ／ｍｌのペニシリン・ストレプトマイシン(ナカライテスク、京都、日本)、300 μｇ／ｍｌのＬ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ナカライテスク、京都、日本）、１ｍＭのＭＥＭＮｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、アメリカ合衆国）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ナカライテスク、京都、日本）中、３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気恒温漕中で培養した。
　Ｂ．ヒト肝細胞由来培養細胞株ＨｕＳ－Ｅ／２
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５μｇ／ｍｌのＬ－ｐｒｏｌｉｎｅ、４２０ｎｇ／ｍｌのｉｎｓｕｌｉｎ、５０ｎＭのｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、４４ｍＭのＮａＨＣＯ３、１．２７ｍｇ／ｍｌのｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ、３８μｇ／ｍｌのＡｓｃｏｒｂａｔｅ、５μｇ／ｍｌのＬｅｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、１０ｎｇ／ｍｌのＰｒｏｌａｃｔｉｎｅ、２１．６ｎｇ／ｍｌのＧｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ（以上Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、セントルイス、アメリカ合衆国）、５ｎｇ／ｍｌのＥｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）（ＴＯＹＯＢＯ、大阪、日本）、０．１ｍｇ／ｍｌのペニシリン・ストレプトマイシン（ナカライテスク、京都、日本）、５％のウシ胎児血清、５％のヒト胎児血清、１％のＤｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）、２５０μｇ／ｍｌのＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、セントルイス、アメリカ合衆国）、３００μｇ／ｍｌのＬ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、２０ｎｇ／ｍｌ　Ｓｅｌｅｎｉｕｍ（以上ナカライテスク、京都、日本より購入）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ナカライテスク、京都、日本）中で、３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気恒温漕中で培養した。
　ＨｕＳ－Ｅ／２細胞を２次元培養する場合は、１００ｍｍのｃｏｌｌａｇｅｎ－ｃｏａｔｅｄ培養用シャーレ（ＡＧＣ　テクノガラス、静岡、日本）を使用した。３次元培養する際には、上記ＨｕＳ－Ｅ／２用培地をメビオールゲル（池田理化、東京、日本）と混合し、メビオールゲル溶液を作成した。次に、メビオールゲル溶液とＨｕＳ－Ｅ／２細胞とを懸濁させた細胞懸濁液を、氷水上で冷却した１０ｃｍ　プラスチックシャーレ上に均等な厚さになるようにまいた。そして、プラスチックシャーレを３７℃で温めることで固まったゲル中に細胞を包埋させた後、その上から更にＨｕＳ－Ｅ／２　用培地を加え、３７℃、５％　ＣＯ２、飽和水蒸気恒温漕中で培養した。
　試験例１：感染性ＨＣＶ粒子産生細胞の作製
　ＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ（ＪＦＨ１のＥ２タンパク質にＦｌａｇタグ配列を導入した組換え体ＨＣＶ）発現プラスミド又はＪ６／ＪＦＨ１発現プラスミドをコンピテントセル（ＤＨ５α株）と混合し、氷水上で３０分間冷却した。次に４２℃のウォーターバス中で２分間静置し、氷水上で５分間静置させた。そして、形質転換体を含んだ細胞懸濁液をＬＢ培地（１Ｌ中にＢａｃｔｏ　ｔｒｙｐｔｏｎ　１０ｇ、乾燥酵母エキス　５ｇ、ＮａＣｌ　５ｇ、グルコース　１ｇを加え、ｐＨ７．２に調整）と混合した後、アンピシリン含有ＬＢ－ａｇａｒ　プレート（１Ｌ中にＢａｃｔｏ　ｔｒｙｐｔｏｎ　１０ｇ、乾燥酵母エキス　５ｇ、ＮａＣｌ　１０ｇ、グルコース　１ｇ、アガロース粉末　１５ｇ、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　５０μｇ／ｍｌを調整し、１０ｃｍプラスチックシャーレ中で固定）上に捲き、一晩３７℃の恒温漕に静置した。翌日、ＬＢ－ａｇａｒプレート上に形成されたコロニーを滅菌済み２００μｌチップで採取し、コロニーが付着したそのチップを５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地中に投入し、一晩３７℃で振とう培養した。大腸菌からのプラスミドＤＮＡ精製にはＬａｂｏ　ｐａｓｓ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　（Ｃｏｓｍｏ　ｇｅｎｅｔｅｃｈ、ソウル、韓国）を使用した。プラスミドＤＮＡ精製は、製品付随のプロトコルに従って行った。
　得られたＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　プラスミドＤＮＡ及びＪ６／ＪＦＨ１プラスミドＤＮＡをＸｂａ１によって切断し、一本鎖ＤＮＡにした後、フェノール・クロロホルム抽出法により抽出した。次いで、直鎖状のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬＤＮＡ及びＪ６／ＪＦＨ１ＤＮＡ２μｇを各々別個に鋳型としてＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡ及びＪ６／ＪＦＨ１　ＲＮＡを合成した。ＲＮＡ合成にはＭｅｇａｓｃｒｉｐｔ　Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ、東京、日本）を使用し、付随のプロトコルに従って行った。合成されたＲＮＡをフェノール・クロロホルム抽出法により抽出し１μｇ／μｌに濃度を調整して－８０℃で保存した。
　上記で得られたＲＮＡを電気穿孔法でヒト肝癌細胞由来細胞株ＨｕＨ－７又はＨｕＨ－７．５細胞に導入した。まず、４００μｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、アメリカ合衆国）中に１．０×１０７個のＨｕＨ－７細胞又はＨｕＨ－７．５細胞と１０μｇのＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡ又は１０μｇのＪ６／ＪＦＨ１　ＲＮＡを混合し、その混合液を４　ｍｍ　ｇａｐ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｃｕｖｅｔｔｅｓ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ、カリフォルニア、アメリカ合衆国）に加えた。そしてＧｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ２（ＢＩＯ－ＲＡＤ、東京、日本）を使用して、２５０ｍＡ、９５０μＦで電気穿孔を行った。電気穿孔後、細胞・ＲＮＡ混合液はＤＭＥＭ培地に懸濁し、プラスチックシャーレ中で培養した。このようにしてＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡ又はＪ６／ＪＦＨ１　ＲＮＡを細胞内で複製し、感染性のあるＨＣＶ粒子を産生する組み換え型ＨｕＨ－７細胞及びＨｕＨ－７．５細胞を取得した。
実施例１：感染性ＨＣＶ産生ＨｕＨ－７へのＣｏｘ１阻害剤の添加
　試験例１で作製した感染性ＨＣＶ粒子産生ＨｕＨ－７細胞にＣｏｘ１阻害剤であるＦＲ１２２０４７を与え、その影響を検討した。
　ＦＲ１２２０４７を１．０μＭ、３．３μＭ又は１０μＭの濃度で添加したダルベッコ変法イーグル培地（ナカライテスク、京都、日本）で感染性ＨＣＶ粒子産生組み換えＨｕＨ－７細胞を３日間培養した。以下の実施例に示すように、次の４項目について調べた：（１）細胞中のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数、（２）培養液中のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数、（３）細胞の生存率、（４）培養上清中ＨＣＶの感染能。
実施例２：Ｃｏｘ１阻害剤によるＨＣＶ－ＲＮＡ複製及び産生への影響
実施例１で処理をした細胞又は培養液に存在するＲＮＡを、次の手順で抽出した。細胞を１×ＰＢＳ（－）（ＮａＣｌ　８ｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ　２．９　ｇ／ｌ、ＫＣｌ　０．２　ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　０．２　ｇ／ｌ）で洗浄し、３７℃で３分間のトリプシン処理をしてディッシュから遊離させた。遊離した細胞を１５ｍｌプラスチックチューブに移して１５００　ｒｐｍで３分間遠心し、沈澱させた。上澄み液を除去した後、Ｓｅｐａｓｏｌ　１　ｓｕｐｅｒ（ナカライテスク、京都、日本）で溶解しＲＮＡ抽出に使用した。
　培養液は３０ｍｌのシリンジ（テルモ、日本）中に移してＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ　Ｓｔｅｒｉｌｅ　Ｓｙｒｉｎｇｅ　Ｆｉｌｔｅｒ　２２μｍ　ｐｏｒｅ、２０ｍｍ（ＡＧＣ　テクノグラス、静岡、日本）により濾過した。更に濾過した培養液に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ナカライテスク、京都、日本）を添加した後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１０ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ、アメリカ合衆国）へと移して３５００ｒｐｍで適当な時間遠心を行った。最終的な培養液の濃縮倍率は１００～１５０倍程度であった。この濃縮培養液及び培養液は、ＲＮＡ抽出の前にあらかじめＳｅｐａｓｏｌ　２　ｓｕｐｅｒ（ナカライテスク、京都、日本）で溶解しＲＮＡ抽出に使用した。ＲＮＡ抽出は、製品付随のプロトコルに従って行った。
　抽出したＲＮＡを鋳型として、Ｔａｑｍａｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア、アメリカ合衆国）を用いて逆転写反応をおこなった。用いたプライマーの配列を以下に（ＲＴ　ｐｒｉｍｅｒ　ＨＣＶ５’ＵＴＲ）に示す。
ＨＣＶ　５’ＵＴＲ　ＲＴ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：　逆転写反応（ｖｉｒｕｓＲＮＡ→ｃＤＮＡ）；　
５’－ＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１）
ＨＣＶ　５’ＵＴＲ　Ｆ：　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ用ｐｒｉｍｅｒ；　５’－ＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＨＣＶ　５’ＵＴＲ　Ｒ：　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ用ｐｒｉｍｅｒ；　５’－ＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧ－３’（配列番号３）
ＨＣＶ　５’ＵＴＲ　Ｐｒｏｂｅ：　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ用ｐｒｏｂｅ；　５’－ＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣ－３’（配列番号４）
　次に、逆転写産物を鋳型として、Ｔｈｕｎｄｅｒ　Ｂｉｒｄ（ＴＯＹＯＢＯ、大阪、日本）を用いて定量的ＰＣＲを行った。用いたプライマー、プローブの配列はＨＣＶ　５’ＵＴＲ及びＨＣＶ　５’ＵＴＲ　Ｐｒｏｂｅである。逆転写反応及び定量的ＰＣＲは、それぞれＧｅｎｏＡｍｐ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア、アメリカ合衆国）、７５００　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア、アメリカ合衆国）を用いておこなった。このようにして測定した組み換えＨｕＨ－７細胞中及びその培養液中のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数を各々図１及び２に示す。尚、Ｃｏｘ－１阻害剤で処理していない細胞又は培養液からＲＮＡ抽出をした結果をコントロールとして示す。
　図１及び２から分かるように、細胞内と培養液中とに関係なく、Ｃｏｘ１は、感染性ＨＣＶを産生する細胞において複製されるＨＣＶのＲＮＡの量に顕著な影響を与えないことが明らかとなった。
実施例３：Ｃｏｘ１阻害剤による細胞の生存率への影響
　実施例１で処理した細胞の生存率をＣｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ II （Ｒｏｃｈｅ、バーゼル、スイス）を用い、ＸＴＴアッセイにより解析した。アッセイは製品付属のプロトコルに従って行った。その結果を図３に示す。
　図３に示されるように、添加したＣｏｘ１阻害剤の濃度に関係なく、Ｃｏｘ１阻害剤による組み換え細胞の生存率に対する顕著な影響は見られなかった。
実施例４：Ｃｏｘ１阻害剤によるＨＣＶの感染能への影響
　８ｗｅｌｌ－ｃｈａｍｂｅｒ　ｇｌａｓｓ　ｐｌａｔｅ（Ｎａｌｇｅ　Ｎｕｎｃ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニューヨーク、アメリカ合衆国）をコラーゲンコートするため、Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅ　１　Ｒａｔ　ｔａｉｌ（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア、アメリカ合衆国）を５０μｇ／ｍｌ含む０．０２Ｎ酢酸水溶液を、２００μｌ／ｗｅｌｌずつウェルに加えた。室温で１時間静置させた後、１×ＰＢＳ（－）で２回ウェルを洗浄した。Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｉコートしたプレートに、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中に懸濁したＨｕＨ７．５細胞を４．０ｘ１０４／ｗｅｌｌとなるようにまき、一晩インキュベートした。翌日５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを除去し、ＨＣＶ粒子を含んだ濃縮上清を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ加えて６時間３７℃でインキュベートした。６時間後濃縮上清を除去し、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで一度ｗｅｌｌを洗浄した。洗浄後再び２００μｌ／ｗｅｌｌの５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを加え、一晩３７℃でインキュベートしたサンプルを染色した。
　免疫染色は、細胞をまずＰＢＳで洗浄し、その後４質量％　ｐａｒａｆｏｒｍ　ａｌｄｅｈｙｄｅを室温で２０分間反応させて固定した。次に１×ＰＢＳ（－）で洗浄後、０．０５質量％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００により室温で１５分間細胞を処理した。そして１×ＰＢＳ（－）で洗浄後、１×ＰＢＳ（－）中に１０％牛胎児血清、１％牛血清アルブミンを混合した溶液に１次抗体を任意の倍率で希釈し、細胞と室温で９０分反応させた。一次抗体としては、抗ＨＣＶ抗体含有患者由来ヒト血清Ｎｏ．３を使用した。次いで、１×ＰＢＳ（－）中に１０％牛胎児血清、１％牛血清アルブミンを混合した溶液に二次抗体を任意の倍率で希釈した。この混合液と、４回洗浄したサンプルとを室温で３０分反応させた。その際使用した二次抗体はＡｌｅｘａ４８８　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ抗体（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、カリフォルニア、アメリカ合衆国）である。また、核の染色に４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を使用した。２次抗体反応の際には、遮光を行った。反応後サンプルを１×ＰＢＳ（－）で４回洗浄し、マウント剤（０．１質量％フェニレンジアミン、１０質量％ポリビニルアルコール、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．７、５質量％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を用いてプレパラート上で包埋した。染色したサンプルは、蛍光顕微鏡ＢｉｏＺｅｒｏ（キーエンス、日本）により観察を行った。感染性解析の際、１ウェル辺り１０回の撮影を行なった。それら１０枚の撮影像中に認められた感染細胞数を数え、その量を比較すること処理したサンプル間において感染性の変化を解析した。その結果を図４に示す。
　図４に示される結果から、Ｃｏｘ１阻害剤により、濃度依存的にＨＣＶの感染能が抑制されることが明らかとなった。
比較例１：Ｃｏｘ２阻害剤による感染性ＨＣＶ産生細胞への影響
　Ｃｏｘ１阻害剤に代えて、ＣＯＸ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１（メルク社製）を用いて実施例１～４と同様の試験及び解析を行ったＣｏｘ２阻害剤は、培養液中の濃度が０．１μＭ、１μＭ又は１０μＭとなるように添加された。細胞中のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に関する結果を図５に、培養液中のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に関する結果を図６に、細胞の生存率に関する結果を図７に、培養上清中ＨＣＶの感染能に関する結果を図８に示す。
　図５～８に示される結果から明らかなように、ＨＣＶの感染能を含む全ての試験項目に関して、Ｃｏｘ２阻害剤は感染性ＨＣＶ産生ＨｕＨ－７細胞に対して有意な影響を示さないことが明らかとなった。
実施例５：ＰＧＩ２アゴニストによる感染性ＨＣＶ産生細胞への影響Ｉ
　Ｃｏｘ１阻害剤に代えて、ＰＧＩ２アゴニストであるＯＮＯ１３０１（Sigma-aldrich社製)を用いて、実施例１～４と同様の試験を行い、その感染性ＨＣＶ産生細胞への影響を検討した。ＯＮＯ１３０１は、培養液中の濃度が１μＭ、３．３μＭ、１０μＭ、３３μＭ又は１００μＭとなるように添加された。細胞中のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に関する結果を図９に、培養液中のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に関する結果を図１０に、細胞の生存率に関する結果を図１１に、培養上清中ＨＣＶの感染能に関する結果を図１２に示す。
　図９～１１に示される結果より、Ｃｏｘ１阻害剤と同様に、ＰＧＩ２アゴニストも感染性ＨＣＶ産生細胞におけるＲＮＡ複製や生存率には有意な影響を有さないことが明らかとなった。一方で、図１２に示される結果から、当該細胞が産生するＨＣＶの感染能力に対する効果については、Ｃｏｘ１阻害剤と同様に、ＰＧＩ２アゴニストは濃度依存的に感染能抑制効果を有することが明らかである。尚、ＰＧＩ２アゴニストを添加しないコントロールの場合は、産生されるＨＣＶが感染能を有することから、ＨＣＶによる感染能の抑制は、添加されたＰＧＩ２アゴニストによって奏された効果であることが分かる。この抑制効果は細胞毒性の認められない濃度（１００μＭ）において３日間処理した場合、非処理細胞に比較して感染性を約９０％低下させることがわかった。
実施例６：ＰＧＩ２アゴニストによる感染性ＨＣＶ産生細胞への影響II
　ＰＧＩ２アゴニストとして、ＯＮＯ１３０１に代えてＢＹＭ４５７７８（Sigma-aldrich社製）を用いて実施例１～４と同様に試験を行った。ＢＹＭ４５７７８は、培養液中の濃度が０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、２５μＭ又は５０μＭとなるように添加された。
　その結果、ＢＹＭ４５７７８の場合もＯＮＯ１３０１と同様の結果となった。即ち、感染性ＨＣＶのＲＮＡ複製や生存率に対しては有意な影響を示さないが、産生されたＨＣＶ粒子の感染能が濃度依存的に抑制されることが確認された。細胞中のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に関する結果を図１３に、培養液中のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に関する結果を図１４に、細胞の生存率に関する結果及びＨＣＶの感染能に関する結果を図１５に示す。
実施例７：ＨＣＶ粒子の感染能抑制についての検討
　培養上清中のウイルス様粒子と感染性との関連をさらに詳細に検討するため、ＯＮＯ１３０１で処理した細胞と未処理の細胞の培養上清を濃縮し、これをショ糖密度勾配超遠心法によって分画した。そして、各画分のＪＦＨ１　ＲＮＡ量と感染性について解析した。各画分におけるＲＮＡ量を示す結果を図１６に示し、各画分の感染性を示す結果を図１７に示す。
　図１６に示される結果から、両方のサンプルにおいてウイルス粒子画分は、これまで報告されている浮遊密度を示す画分と同様の分布を示した。一方で、図１７に示される結果からＰＧＩ２アゴニストで処理した細胞の培養上清では各画分において感染性が著しく低下していた。即ち、ＯＮＯ１３０１の処理によって培養上清中に産生されているウイルス様粒子の産生は阻害されていないが、その感染性が著しく低下していることがわかった。
　以上の結果からＰＧＩ２アゴニストは、ＨＣＶが感染した細胞からのＨＣＶ粒子の産生を抑制するのではなく、産生されたＨＣＶ粒子の感染性を抑制する働きを有することが強く示唆された。
実施例８：感染能抑制機構の検討
実施例５～７で確認された、ＰＧＩ２アゴニストによるＨＣＶ粒子の感染能抑制効果が、ＨＣＶ粒子産生細胞に働き、粒子自体に変化を誘導しているのか、あるいはこの処理により細胞から感染性を阻害する因子が産生されるのかを検討した。即ち、ＪＦＨ１　ＲＮＡを導入していないＨｕＨ７細胞をＯＮＯ１３０１で処理し、その培養上清を回収し、感染性ＪＦＨ１粒子を含むＨＣＶ粒子産生細胞からの培養上清に加えて、その感染性を解析した。
　その結果、ＯＮＯ１３０１処理したＨｕＨ７細胞の培養上清を感染性粒子含有培養上清に混合させても全くＪＦＨ１感染性粒子の感染性には影響が認められなかった。この結果を図１８に示す。この結果からＰＧＩ２アゴニストはＪＦＨ１感染性粒子産生細胞に直接働きかけ、構造を変化させることによって粒子の感染能を抑制することが示唆された。
　実施例９　ＰＧＩ２アゴニストによる感染性ＨＣＶ産生細胞への影響ＩＩＩ
　実施例５で実施した各試験を、組み換えＨｕＨ－７細胞に代えて、Ｊ６／ＪＦＨ１　ＲＮＡを導入したＨｕｈ７．５細胞を用いて実施した。その結果、Ｈｕｈ７．５細胞に対しても、ＩＰアゴニストであるＯＮＯ１３０１は、濃度依存的にＨＣＶ感染能を抑制することが確認された。ＯＮＯ１３０１による培養液中のＪ６／ＪＦＨ１　ＲＮＡのコピー数に関する結果を図１９に、細胞中の同ＲＮＡコピー数に関する結果を図２０に、細胞の生存率に関する結果を図２１に、培養上清中ＨＣＶの感染能に関する結果を図２２に示す。
実施例１０　ＰＧＩ２アゴニストによる感染性ＨＣＶ産生細胞への影響ＩＶ
　実施例５で実施した各試験を、組み換えＨｕＨ－７細胞として、Ｊ６／ＪＦＨ１　ＲＮＡを導入したＨｕｈ７細胞を用いて実施した。その結果、Ｊ６／ＪＦＨ１　ＲＮＡを導入したＨｕｈ７細胞に対しても、ＩＰアゴニストであるＯＮＯ１３０１は、濃度依存的にＨＣＶ感染能を抑制することが確認された。ＯＮＯ１３０１による培養液中のＪ６／ＪＦＨ１　ＲＮＡのコピー数に関する結果を図２３に、細胞中の同ＲＮＡコピー数に関する結果を図２４に、細胞の生存率に関する結果を図２５に、培養上清中ＨＣＶの感染能に関する結果を図２６に示す。
実施例１１　ＰＧＩ２アゴニストによる感染性ＨＣＶ産生細胞への影響Ｖ
　実施例５で実施した各試験を、組み換えＨｕＨ－７細胞として、ＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡを導入したＨｕｈ７．５細胞を用いて実施した。その結果、ＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡを導入したＨｕｈ７．５細胞に対しても、ＩＰアゴニストであるＯＮＯ１３０１は、濃度依存的にＨＣＶ感染能を抑制することが確認された。ＯＮＯ１３０１による培養液中のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に関する結果を図２７に、細胞中の同ＲＮＡコピー数に関する結果を図２８に、細胞の生存率に関する結果を図２９に、培養上清中ＨＣＶの感染能に関する結果を図３０に示す。
　実施例１２　ＰＧＩ２合成酵素のｍＲＮＡ発現抑制
　ＨＣＶ生活環におけるＰＧＩ２の役割を解析するためにＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡを導入したＨｕｈ７細胞におけるＰＧＩ２合成酵素（ＰＧＩＳ）をコードするｍＲＮＡの発現をｓｉＲＮＡにより抑制した。ＰＧＩＳに対するｓｉＲＮＡは、Ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社から購入した。また、コントロール用のｓｉＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。これらをＨｕｈ７細胞へＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡを導入する際に同時に導入し、３日後に実施例２の方法に準じて細胞中及び培養液中のｍＲＮＡの量を測定した。また、実施例３及び４に従って、細胞の成育率及びＨＣＶの感染能に対する影響を観た。
　図３１は、ｓｉＲＮＡによってＰＧＩＳをコードするｍＲＮＡの発現が抑制されていることを示す。そして、培養液中のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に関する結果を図３２に、細胞中の同ＲＮＡコピー数に関する結果を図３３に、細胞の生存率に関する結果を図３４に、培養上清中ＨＣＶの感染能に関する結果を図３５に示す。これらの結果から、ＰＧＩＳをコードするｍＲＮＡの発現を抑制することにより、ＨＣＶゲノムの複製、放出及びＨＣＶ感染能の全てが顕著に上昇することが確認され、ＰＧＩ２シグナル経路がＨＣＶの複製、放出及び感染能の全てに関連していることが確認された。
　実施例１３　ＯｚａｇｒｅｌによるＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡを導入したＨｕｈ７細胞への影響
　実施例２～４に記載の方法に従って、ＴＸＡ２合成酵素阻害作用を有するＯｚａｇｒｅｌ（Ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社製、カリフォルニア、アメリカ合衆国）によるＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡを導入したＨｕｈ７細胞のＨＣＶの複製、放出、感染性に対する影響を調べた。その結果、細胞中で複製されるＨＣＶのＲＮＡ（図３６）、その細胞外への放出（図３７）、及び細胞増殖（図３８）には顕著な影響を及ぼさなかったが、濃度依存的にＨＣＶの感染性を抑制することが確認された（図３９）。この結果からＨＣＶの感染性抑制にはＴＸＡ２シグナル経路の遮断が重要であることが示唆された。
　実施例１４　ＴＸＡ２合成酵素をコードするｍＲＮＡの発現抑制
　ＴＸＡ２シグナル経路とＨＣＶ粒子の感染性との関連性を更に検討するために、ＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡを導入したＨｕｈ７細胞におけるＴＸＡ２合成酵素（ＴＸＡＳ）をコードするｍＲＮＡの発現をｓｉＲＮＡにより抑制した。ＴＸＡＳに対するｓｉＲＮＡは、Ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社から購入した。また、コントロール用のｓｉＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。これらをＨｕｈ７細胞にＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡを導入する際に同時に導入し、３日後に実施例２の方法に準じて細胞中及び培養液中のｍＲＮＡの量を測定した。また、実施例３及び４に従って、細胞の成育率及びＨＣＶの感染能に対する影響を観た。
　図４０は、ｓｉＲＮＡによってＴＸＡＳをコードするｍＲＮＡの発現が抑制されていることを示す。そして、培養液中のＪＦＨ１Ｅ２ＦＬ　ＲＮＡのコピー数に関する結果を図４１に、細胞中の同ＲＮＡコピー数に関する結果を図４２に、細胞の生存率に関する結果を図４３に、培養上清中ＨＣＶの感染能に関する結果を図４４に示す。これらの結果から、ＴＡＸＳのｍＲＮＡの発現抑制によって、ＨＣＶゲノムの複製、その放出及び細胞生存率は殆ど影響を受けないが、ＨＣＶ感染性は顕著に抑制されることが確認された。この結果と実施例１５の結果から、ＴＸＡ２シグナル経路の遮断もＨＣＶの感染能抑制に有効であると考えられる。
　実施例１５　ヒト肝細胞キメラマウスを用いた感染伝播抑制効果の検討
　患者由来ＨＣＶに感染したヒト肝細胞キメラマウスにＯＮＯ１３０１（１００ μｇ／ｍｏｕｓｅ 皮下注射を１日２回）、ベラプロストナトリウム（５ μｇ／ｍｏｕｓｅ 経口投与を１日２回）、及びＯｚａｇｒｅｌ（１５０ μｇ／ｍｏｕｓｅ 経口投与を１日２回）を別個に投与した。感染初期の感染伝播に対する抑制効果を検討する目的で、患者由来ＨＣＶ感染後１週間目から薬剤投与を開始し、感染後２、３、４週間目の血中ＨＣＶｔｉｔｅｒを未処理群と比較した。その結果、全ての薬剤投与によって、感染後２、 ３週間目の血中ＨＣＶｔｉｔｅｒ量が未処理群と比較して減少していた(図４５)。この結果からＩＰアゴニストおよびＴＸＡ２合成酵素阻害剤投与によって、感染後初期におけるマウス体内でのＨＣＶの感染能が抑制され、結果としてその増殖が阻害されると考えられる。感染後４週間目の各薬剤の効果を比較すると、Ｏｚａｇｒｅｌによる伝播抑制効果は、他の薬剤よりも低いことが示された。これは、ＴＸＡＳの阻害のみでは、ＨＣＶの感染性のみが低下するだけで、一方ＩＰアゴニストではＨＣＶの生活環全般に対する抑制効果が発揮されることに起因していると考えられる。

Claims (8)

  1. 　プロスタグランジンＩ２のアゴニストを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染抑制剤。
  2. 　プロスタグランジンＩ２のアゴニストを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染能不活化剤。
  3. 　Ｃ型肝炎ウイルスを含む試料を請求項２に記載の不活化剤で処理する工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの感染能を不活性化する方法。
  4. 　プロスタグランジンＩ２のアゴニストを含む、Ｃ型肝炎ウイルスによって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療剤。
  5. プロスタグランジンＩ２アゴニストがベラプロスト、ＯＮＯ１３０１及び／又はＢＹＭ４５７７８である、請求項１に記載の感染抑制剤。
  6. 　プロスタグランジンＩ２アゴニストがベラプロスト、ＯＮＯ１３０１及び／又はＢＹＭ４５７７８である、請求項２に記載の感染能不活化剤。
  7. 　プロスタグランジンＩ２アゴニストがベラプロスト、ＯＮＯ１３０１及び／又はＢＹＭ４５７７８である、請求項４に記載の予防及び／又は治療剤。
  8. 　Ｃ型肝炎ウイルスによって引き起こされる疾患がＣ型肝炎である、請求項４又は７に記載の予防及び／又は治療剤。
    　
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