BR112015005284B1

BR112015005284B1 - Combinação de compostos derivados do ácido gálico, composição farmacêutica compreendendo a referida combinação e seus usos no tratamento de câncer

Info

Publication number: BR112015005284B1
Application number: BR112015005284-3A
Authority: BR
Inventors: Susana FIORENTINO; John Fredy Hernandez; Claudia URUEÑA; Diana CASTAÑEDA; Luis Miguel Pombo; Alejandro Sandoval Tito
Original assignee: Pontificia Universidad Javeriana; Fundación Universitaria Juan N. Corpas
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2012-09-11
Publication date: 2022-05-03
Also published as: WO2014041393A1; US20150313925A1; BR112015005284A8; CA2884784A1; CA2884784C; BR112015005284A2; US9931355B2; CO6990150A1

Abstract

COMBINAÇÃO DE COMPOSTOS DERIVADOS DO ÁCIDO GÁLICO PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER. A presente invenção se refere a uma combinação de compostos derivados do ácido gálico com atividade antitumoral e antimetastática, através de um mecanismo que implica na indução de apoptose e morte imunogênica das células tumorais e a consequente ativação da resposta imunológica específica. Adicionalmente, é revelada uma composição que contém uma combinação de derivados do ácido gálico e excipientes farmaceuticamente aceitáveis para a fabricação de medicamentos úteis no tratamento do câncer. Dessa forma, a invenção revela o uso da dita composição como coadjuvante da quimioterapia convencional, diminuindo as doses empregadas dos agentes quimioterápicos no tratamento de câncer.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma combinação e a uma composição farmacêutica com atividade antitumoral, antimetastática e indutora da resposta imunológica para o tratamento de câncer que compreende um ou mais compostos derivados do ácido gálico e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis para a adequação de uma forma farmacêutica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O câncer é a principal causa de morte a nível mundial; de acordo com as estatísticas da OMS em 2004 foram registradas 7,4 milhões de mortes e em 2008, 559.000 mortes a nível mundial por câncer de mama (OMS, 2010). A terapia sistêmica é o principal tratamento para o câncer de mama metastático e inclui a quimioterapia, a terapia hormonal e a terapia direcionada com anticorpos monoclonais; no entanto, atualmente é considerado incurável e estima-se uma média de sobrevivência de 12 meses em mulheres que não receberam tratamento (Cold, S. 1993). A resistência das células tumorais metastáticas ao tratamento quimioterápico deve-se, em parte, ao desenvolvimento de múltiplos mecanismos de resistência a drogas, os quais permitem uma eliminação rápida das drogas e, ainda, protege as células da morte através do desenvolvimento de mecanismos antiapoptóticos ou de sobrevida (Chai, To et al. 2010). Por outro lado, as células tumorais remanescentes migram para os tecidos, onde podem ser destruídas por células da resposta imunológica, sempre e quando a resposta imunológica tenha sido induzida durante as fases iniciais da carcinogênese ou durante a terapia dos tumores que já se instalaram (Fulton, Miller et al. 2006). O tratamento do tumor deveria então compreender a combinação ou a mistura de moléculas que induzam a morte das células tumorais, permitindo, por sua vez, o controle dos mecanismos de resistência e, ainda, que permitam que, durante esta terapia, seja fortalecida a indução de uma resposta imunológica que assegure o controle as células metastáticas que escapam da destruição inicial direta.

[003] Somente 15% dos pacientes que apresentam comprometimento dos nódulos linfoides e que não são tratados com cirurgia apresentam câncer recorrente (Morrison, Schmidt et al. 2008), o que faz pensar que outros mecanismos, entre eles a resposta imunológica, poderiam estar exercendo um papel importante no controle da metástase. Os sítios mais comuns de metástase em câncer de mama são o pulmão, as vértebras, o fígado, a medula óssea, o tecido endócrino e o sistema nervoso central (Fulton, Miller et al. 2006), o qual se reproduz também no modelo murino com células 4T1, considerado altamente metastático. Esse padrão de metástase aumenta em ratos SCID, deficientes em linfócitos T ou B, em ratos "nus", deficientes de linfócitos T (Williams, Alosco et al. 1993) (Visonneau, Cesano et al. 1998) ou, ainda, em ratos NOG, deficientes em células NK e em citocinas (Dewan, Terunuma et al. 2005), o que sustenta ainda mais a participação da resposta imunológica no controle da metástase. De fato, a metástase dos gânglios linfáticos sentinelas em pacientes com câncer de mama está associada a um baixo potencial de maturação e migração das células dendríticas assim como com um baixo infiltrado de linfócitos T CD8, sugerindo que a imunossupressão, possivelmente gerada pelo tumor, favorece a migração metastática (Mansfield, Heikkila et al. 2011).

[004] O conceito das terapias múltiplas tem seus antecedentes no uso dos produtos herbáceos complexos utilizados na medicina tradicional, os quais têm sido apresentados como uma alternativa terapêutica amplamente utilizada (entre 30 e 75% dos pacientes com câncer em nível mundial) para reduzir os efeitos colaterais e a toxicidade orgânica da quimioterapia, para proteger e estimular o sistema imunológico ou para prevenir futuras neoplasias ou a recorrência das mesmas (Richardson 2001). Os produtos herbáceos, constituídos por múltiplas moléculas, apresentam, em geral, um componente ativo identificado, que atua em sinergia com outros metabólitos presentes na combinação da planta e que, dadas suas baixas concentrações, muitas vezes não são identificados. Essa sinergia permite exercer a atividade biológica com um índice de toxicidade que é menor que aquele dos metabólitos isolados.

[005] Dentre os metabólitos com ampla atividade biológica encontra-se o ácido gálico, o qual foi descrito como antioxidante, antialérgico, antimutagênico, anticarcinogênico e anti-inflamatório (Gandhi e Nair 2005). Serrano e Col em 1998 descobriram que o ácido gálico e seus derivados (ésteres metílico, propílico, octilílico e laurilílico) induzem a apoptose em diversas linhagens celulares tumorais dentro das quais são mencionados diferentes tipos de leucemias, linfomas e mielomas (Serrano, Palacios et al. 1998). Adicionalmente, foi relatada atividade importante para os ésteres metílico, propílico e octílico do ácido gálico sobre a linhagem celular tumoral HeLa (Adenocarcinoma de colo do útero humano) (Fiuza, Gomes et al. 2004). Os direcionados a determinar a atividade antitumoral do ácido gálico e seus derivados (ésteres) demonstraram seu efeito citotóxico sobre a linhagem celular tumoral L1210 (Leucemia) e a indução de apoptose determinada por fragmentação do DNA em géis de agarose (Locatelli, Rosso et al. 2008).

[006] Foi mostrado que o ácido tânico (galotanino) é inibidor da formação de tumores em um modelo com DMBA (dimetilbenzantraceno) como promotor tumoral (Mukhtar, Das et al. 1988). Por outro lado, foi relatado que a aplicação tópica de ácido tânico inibe, de maneira dependente de dose, a atividade de ornitina descarboxilase, a qual está relacionada com a formação de tumores na epiderme de ratos em que os tumores foram introduzidos por TPA (12-0- tetradecanoilforbol-13-acetato) (Gali, Perchellet et al. 1992). Da mesma forma, foi mostrado que a aplicação tópica do ácido tânico inibe a carcinogênese induzida por luz ultravioleta, em ratos BALB/c (Gensler, Gerrish et al. 1994).

[007] Feldman K.S. em 2007 divulgou na patente US 7288273 um método para inibir a liberação de TNF-α e IL-1 β que compreende a administração de um análogo da coriarina A (um elagitanino dimérico unido por uma ligação de diidrodigaloil éter). Os inventores mostram que o dímero análogo à coriarina A tem capacidade de inibir a produção de TNF-α e IL-1β em células mononucleares de sangue periférico estimuladas com LPS; de modo contrário, galotaninos monoméricos como a β-D-pentagaloil-glicose, induzem choque séptico em modelos de camundongos devido à indução de altos níveis plasmáticos de IL-1β. Esses compostos diméricos análogos à coriarina A e as composições dos mesmos são propostos como antagonistas de TNF-α úteis para o tratamento de patologias como o choque séptico associado à superprodução de TNF-α e outras citocinas.

[008] As patentes US 6063770 e 6200568 (Falcon J.) revelam uma composição para o tratamento de câncer que compreende ácido tânico ou complexos do mesmo obtidos a partir de extratos das espécies Musa paradisiaca e Musa Cavendish Enano em uma proporção entre 5 e 20%. De acordo com a invenção, o ácido tânico precipita os polímeros de ácido siálico (α-2,8-N-acetil neuramínico) expostos na superfície das células tumorais, permitindo o reconhecimento dos antígenos tumorais pelas células do sistema imunológico.

[009] A patente WO 2005/000330 (Greenway F.L., et al) revela um método para a diminuição ou prevenção da angiogênese associada à retinopatia diabética, degeneração macular, obesidade, lúpus, psoríase, neovascularização da córnea, tumores benignos e malignos, entre outros, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de ácido gálico ou um derivado do mesmo selecionado dentre: ácido tânico, metil galato, propil galato, butil galato, octil galato, etil galato, lauril galato, ácido elágico, galoil glucosa, digaloil glicose, trigaloil glicose, tetragaloil glicose, pentagaloil glicose ou gliceril trigalato. Dessa forma, inclui como agentes antiangiogênicos os extratos das plantas Rubus suavissimus S. Lee, Diospyros kaki L, Rheum palmatum L, Cornus officinale Nakai, Rubus fruticosus, Rubus occidentalis e especialmente as frações de alta polaridade dos frutos de Púnica granatum L.

[010] A combinação dos derivados do ácido gálico da presente invenção diminui a capacidade clonogênica de células tumorais e apresenta atividade citotóxica sobre diferentes linhagens de células tumorais, através de mecanismos que induzem a despolarização da mitocôndria e a ativação de caspase 3, sugerindo um mecanismo de indução de apoptose. Ademais, sobre linhagens de células tumorais humanas de câncer de mama (MCF7), o controle da proliferação celular se deve principalmente a uma detenção das células na fase G1 do ciclo celular e à indução de um mecanismo de autofagia, que posteriormente leva à morte celular. As células 4T1 reproduzem no rato o padrão de metástase dos pacientes com câncer de mama, sendo um bom modelo para avaliar a atividade de fármacos antimetastáticos e, nesse modelo, demonstrou-se que a combinação dos compostos da invenção diminui o tamanho do tumor primário, a reação leucemoide induzida pelo tumor e reduz o número de metástase no baço, no fígado e gânglios linfáticos mesentéricos, sugerindo uma atividade sobre as células-mãe tumorais, que são as principais responsáveis pela metástase. Ademais, induz a ativação da resposta imunológica evidenciada pela presença de linfócitos T CD4 e CD8 específicos do tumor e produtores de citocinas, que proliferam mediante o estímulo antigénico. A atividade dessa combinação não havia sido avaliada previamente por outros autores e os presentes resultados sugerem que esses compostos apresentam um alto potencial para ser utilizado na terapia do câncer, exercendo sua atividade sobre o tumor primário e a metástase através de: (1) um mecanismo direto sobre a célula tumoral e (2) um mecanismo que implica a ativação da resposta imunológica.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

[011] Em um primeiro aspecto, a invenção se refere a uma combinação de compostos derivados do ácido gálico, que tem capacidade de diminuir o tamanho do tumor primário e o número de metástases, através de um mecanismo direto sobre o tumor e um mecanismo indireto que implica a ativação da resposta imunológica específica.

[012] Em um segundo aspecto, a invenção revela uma composição farmacêutica que compreende uma combinação de compostos derivados do ácido gálico e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[013] Da mesma forma, é parte da invenção o uso da dita combinação de compostos derivados do ácido gálico para a produção de medicamentos para o tratamento de câncer.

[014] Em um aspecto adicional, a invenção inclui o uso da composição da invenção como adjuvante da quimioterapia convencional com agentes inibidores de topoisomerases, inibidores de mitose, agentes alquilantes e antimetabólitos, entre outros.

[015] Em um aspecto final, é revelado um método para tratamento de câncer que compreende a administração da composição da invenção de forma simultânea ou separada com agentes quimioterápicos convencionais.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[016] A Figura 1 mostra a indução da despolarização da membrana mitocondrial de células K562 (A) e 4T1 (B) tratadas com a combinação da invenção.

[017] A Figura 2 mostra a indução de apoptose sobre linhagens celulares tumorais por tratamento com a combinação da invenção.

[018] A Figura 3 mostra a diminuição da capacidade formadora de colônias das células 4T1 e K562 tratadas com uma combinação da invenção.

[019] A Figura 4 mostra a atividade adjuvante da combinação da invenção (tratamento com doses abaixo do ideal da combinação e de agentes quimioterápicos) sobre células tumorais humanas de câncer de mama.

[020] A Figura 5 mostra o efeito da combinação de compostos derivados do ácido gálico da invenção sobre o diâmetro e o peso do tumor em um modelo in vivo de câncer de mama murino.

[021] A Figura 6 mostra a diminuição de focos metastáticos e de megacariócitos em órgãos parenquimatosos de animais tratados com uma combinação de compostos derivados do ácido gálico da invenção.

[022] A Figura 7 mostra a diminuição da produção de interleucina 6 em ratos com tumor tratados com a combinação de compostos derivados do ácido gálico.

[023] A Figura 8 mostra a expressão em membrana de calreticulina e a mobilização de HMGB1 do núcleo para o citoplasma, em células tumorais tratadas com os compostos de derivados do ácido gálico.

[024] A Figura 9 mostra como a vacinação com células tumorais tratadas com a combinação FA-CS e DOX favorece a geração de LT CD4+ produtores de citocinas IL-2, IFN-y e TNF-α.

[025] A Figura 10 mostra a produção de citocinas próprias de células de memória em resposta ao antígeno, obtidas do gânglio poplíteo de ratos vacinados com células tumorais tratadas com uma combinação da invenção ou com doxorrubicina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[026] Para facilitar a descrição dos componentes da presente invenção, foram estabelecidas as seguintes definições para os termos utilizados no relatório descritivo da presente invenção.

[027] A expressão "compostos derivados do ácido gálico" se refere às estruturas resultantes das substituições indicadas nas estruturas carbonadas I e II, os quais são compostos que incluem pelo menos uma molécula de ácido gálico em sua estrutura e são denominados de forma genérica no presente relatório descritivo como derivados do ácido gálico.

[028] A expressão "uma combinação de compostos derivados do ácido gálico" é entendida como a mistura de um ou mais compostos de fórmula I, de um ou mais compostos de fórmula II e o composto 3,4,5,6-tetraquis[(3,4,5- triidroxibenzoil)oxi]oxan-2-il]metil-3,4,5-triidroxi benzoato (denominação comum: pentagaloil-glicose) que formam o princípio ativo ou fármaco, o qual, em uma faixa de dosagem adequada, é misturado com excipientes farmaceuticamente aceitáveis para gerar uma composição farmacêutica.

[029] A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" é entendida como o nível de dosagem dos compostos da invenção necessário para induzir um efeito biológico desejado no tratamento da enfermidade dentro de um equilíbrio entre risco/benefício aceitáveis para qualquer tratamento médico.

[030] A expressão "terapêutico" inclui o tratamento ou a profilaxia de uma enfermidade para um mamífero incluindo o homem.

[031] Em um primeiro aspecto, a invenção se refere a uma combinação com atividade antitumoral, antimetastática e indutora da resposta imunológica para o tratamento de câncer que compreende: a. Entre 75 e 85% em relação ao peso total da combinação de um ou mais compostos de fórmula I:

R1 é hidrogênio, hidroxila, -COO-, -COOH R2 é selecionado dentre hidrogênio, hidroxila, -COO-, -COOH

R3, R4, R5, R6 e R7 são selecionados dentre hidrogênio, hidroxila ou

[032] Em que os ditos compostos de fórmula I são selecionados, de preferência, a partir de: ácido 3,4,5-triidroxi-1-(3,4,5-triidroxibenzoil) oxiciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,4,5-triidroxi-3-(3,4,5-triidroxibenzoil) oxiciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,3,5-triidroxi-4-(3,4,5-triidroxibenzoil) oxiciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,3,4-triidroxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil) oxiciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,4-diidróxi-3,5-bis[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,5-diidróxi-3,4-bis[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,3-diidróxi-4,5-bis[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 4-hidróxi-1,3,5-tris[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 5-hidróxi-1,3,4-tris[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 3-hidróxi-1,4,5-tris[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 1-hidróxi-3,4,5-tris[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,3,4,5-tetraquis[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico.

[033] Da mesma forma, estão incluídos no alcance da invenção os ésteres metílico, etílico propílico, butílico, pentílico, hexílico e heptílico e os sais de adição com ácidos ou bases inorgânicas com metais alcalinos e alcalinos terrosos, tais como: cálcio, lítio, magnésio, alumínio, sódio, potássio dos compostos mencionados anteriormente. b. Entre 10 e 20% em relação ao peso total da combinação de um ou mais compostos de fórmula II:

[034] em que: R1 é selecionado dentre hidrogênio, metila, etila propila, butila, pentila, hexila ou heptila R2 é selecionado dentre hidrogênio ou

[035] Com a condição de que R1 e R2 não sejam simultaneamente hidrogênio,

[036] Em que os ditos compostos de fórmula II são selecionados de preferência a partir de: 3,4,5-triidroxibenzoat Metil-3,4,5-triidroxibenzoato Etil-3,4,5-triidroxibenzoato Propil-3,4,5-triidroxibenzoato Butil-3,4,5-triidroxibenzoato Pentil-3,4,5-triidroxibenzoato Hexil-3,4,5-triidroxibenzoato Heptil-3,4,5-triidroxibenzoato 3,4-diidróxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil)-oxi-benzoato Etil-3,4-diidróxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil)-oxi- benzoato Etil-3,4-diidróxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil)-oxi- benzoato Propil-3,4-diidróxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil)-oxi- benzoato Butil-3,4-diidróxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil)-oxi- benzoato Pentil-3,4-diidróxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil)-oxi- benzoato

[037] Hexil-3,4-diidróxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil)- oxi-benzoato

[038] Heptil-3,4-diidróxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil)- oxi-benzoato c. Entre 0,1 e 8% em relação ao peso total da combinação do composto 3,4,5,6-tetraquis[(3,4,5- triidroxibenzoil)oxi]oxan-2-il]metil-3,4,5-triidroxi benzoato (denominação comum: pentagaloil-glicose)

[039] A dita combinação pode ser empregada para a preparação de medicamentos com atividade terapêutica antitumoral, antimetastática e indutora da resposta imunológica úteis no tratamento do câncer.

[040] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a uma composição farmacêutica com atividade antitumoral, antimetastática e indutora da resposta imunológica para o tratamento de câncer que compreende: (a) um ou mais compostos de fórmula I:

R1 é hidrogênio, hidroxila, -COO-, -COOH R2 é selecionado dentre hidrogênio, hidroxila, -COO-, -COOH ou

R3, R4, R5, R6 e R7 são selecionados dentre hidrogênio, hidroxila ou

(b) um ou mais compostos de fórmula II:

[041] em que: R1 é selecionado dentre hidrogênio, metila, etila propila, butila, pentila, hexila ou heptila R2 é selecionado dentre hidrogênio ou

[042] Com a condição de simultaneamente hidrogênio, (c) o composto triidroxibenzoil)oxi]oxan-2-il]metil-3,4,5-triidroxi benzoato, (d) e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis para a adequação a uma forma farmacêutica líquida, sólida ou heterodispersa.

[043] A dita composição pode ser formulada com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis para administração oral em formas farmacêuticas sólidas ou líquidas, para administração tópica em formas heterodispersas (cremes A/O, cremes O/A, géis e pomadas entre outros) e para administração parenteral ou retal. As composições da invenção podem ser administradas a humanos e outros mamíferos por via oral, retal parenteral, tópica, intravaginal, bucal ou como aspersão nasal ou oral.

[044] As composições para administração oral que contém a combinação de compostos da invenção incluem as formas farmacêuticas orais usadas convencionalmente, tais como: tabletes, cápsulas, formas bucais e líquidos orais, suspensões ou soluções. As cápsulas podem conter misturas dos agentes ativos com excipientes inertes e/ou diluentes tais como: amidos farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, milho, papa ou amido), açúcares, agentes adoçantes artificiais, celuloses em pó (carboximetilcelulose, metilcelulose, etilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose), farinhas, gelatinas e gomas entre outros.

[045] As composições em tabletes podem ser elaboradas por métodos de compressão convencional, granulação úmida ou granulação seca e podem utilizar excipientes tais como: diluentes, lubrificantes, desintegrantes, tensoativos, agentes de suspensão ou estabilização, incluindo, porém, sem limitação, estearato de magnésio, ácido esteárico, talco, laurilsulfato de sódio, celulose microcristalina, carboximetilcelulose, polivinilpirrolidona, gelatina, ácido algínico, goma acácia, goma xantana, citrato de sódio, silicatos complexos, carbonato de cálcio, lactose, caulim, manitol, cloreto de sódio, amidos secos e sacarose em graus farmaceuticamente aceitáveis. Da mesma forma, as composições orais reveladas na invenção podem ser formulações convencionais ou formulações de liberação retardada ou controlada que alterem a absorção dos agentes ativos.

[046] As formulações para administração parenteral da invenção podem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, porém, sem limitação: tensoativos (lecitina, acácia, tragacanto, ésteres de ácidos graxos polioxietilados de sorbitano, gorduras polioxietiladas, oleotriglicerídeos polioxietilados, polioxialquileno derivados de propilenoglicol, produtos de condensação de óxido de polietileno e álcoois graxos, alquilfenóis ou ácidos graxos), agentes modificadores da tonicidade (cloreto de sódio, sacarose, dextrose, manitol, lactose, trihalose, glicose, glicina), solventes (água, propilenoglicol, polietilenoglicol, glicerol, etanol), reguladores de pH (tampão de fosfato, citrato, lactato, glicina, tris, bicarbonato sódico), antioxidantes (octocoferol, BHT, BHA), quelantes (EDTA) e agentes modificadores da viscosidade (carboximetil celulose, croscarmelose, hidroxipropil celulose).

[047] Os níveis e dosagem da combinação de compostos da invenção na composição farmacêutica proporcionada pela invenção podem variar para alcançar a resposta terapêutica desejada dependendo das condições fisiológicas e patológicas do indivíduo, da formulação e da via de administração. Os níveis de dosagem selecionados dependem especificamente da potência terapêutica dos compostos, da via de administração, da severidade da afecção tratada e do histórico médico anterior do paciente a ser tratado.

[048] A dose diária total da combinação da invenção usada na composição da invenção pode variar na faixa de 0,001 a 1.000 mg/kg/dia. Para propósitos de administração oral, as doses preferenciais se encontram na faixa de 0,001 a 5 mg/kg/dia e parenteral na faixa de 0,0001 a 2 mg/kg/dia. Se for necessário, a dose eficaz diária pode ser dividida em múltiplas doses para propósitos de administração, consequentemente, a invenção compreende composições de dose simples que contém a quantidade efetiva ou doses múltiplas que atingem a dose diária eficaz após várias administrações.

[049] A composição farmacêutica da invenção compreende como princípio ativo compostos de fórmula I, II e pentagaloil-glicose em uma faixa entre 0,01 e 90% em peso da composição, com a condição de que entre 75 a 85% do dito princípio ativo correspondam a um ou mais compostos de fórmula I.

[050] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso da composição da invenção para a preparação de medicamentos com atividade terapêutica antitumoral, antimetastática e indutora da resposta imunológica úteis no tratamento de câncer.

[051] Da mesma forma, a invenção inclui o uso da composição da invenção como adjuvante da quimioterapia convencional com agentes inibidores de topoisomerases, inibidores de mitose, agentes alquilantes e antimetabólitos, entre outros para o tratamento de câncer. A dita atividade adjuvante se reflete na diminuição da dose exigida do agente quimioterápico, diminuindo por fim a toxicidade sistémica da terapia.

[052] Dentro do alcance da invenção, está incluído um método para o tratamento de câncer que compreende a administração concomitante ou separada da composição da invenção com agentes quimioterápicos convencionais do tipo inibidores de topoisomerases, inibidores de mitose, agentes alquilantes e antimetabólitos em doses inferiores às exigidas na quimioterapia convencional.

MODALIDADES PREFERENCIAIS DA INVENÇÃO

[053] Uma das combinações de compostos derivados do ácido gálico avaliada ao longo dos exemplos presentados no relatório descritivo da invenção foi denominada genericamente como FA-CS. Essa combinação compreende entre 75 e 85% em % em peso de compostos de fórmula I, entre 10 e 20% em % em peso de compostos de fórmula II e entre 0,1 e 8% em relação ao peso total da combinação do composto pentagaloil-glicose (3,4,5,6-tetraquis[(3,4,5- triidroxibenzoil)oxi]oxan-2-il]metil-3,4,5-triidroxi benzoato), de acordo com a seguinte tabela:

[054] São apresentados, a seguir, a título ilustrativo, os fatos científicos que sustentam a presente invenção, os quais não devem ser entendidos como uma limitação à invenção.

LINHAGENS CELULARES

[055] As linhagens celulares humanas empregadas foram K562 (eritroleucemia humana), CF7 (câncer de mama humano) e A375 (melanoma humano). As linhagens celulares murinas empregadas foram Mel Rel (melanoma murino) e 4T1 (câncer de mama murino). Essas células foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2 Mm de L- glutamina, 100 U de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina e 0,01 de Hepes (Eurobio, Toulouse, FR) a 37 °C com 5% de CO2 em atmosfera úmida. A linhagem celular 4T1 foi, ainda, mantida com 1 mM de piruvato de sódio (Eurobio, Toulouse, FR). Para os ensaios sobre células normais, foram obtidos mononucleares humanos de sangue periférico venoso de doadores saudáveis (PBMC), os quais foram separados por centrifugação utilizando um gradiente de densidade Ficoll- Hypaque (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Bjórkgatan, Uppsala, Suécia).

EXEMPLO 1. ATIVIDADE CITOTÓXICA DA COMBINAÇÃO FA-CS SOBRE DIFERENTES LINHAGENS CELULARES TUMORAIS

[056] O efeito citotóxico da combinação da invenção sobre as células tumorais e normais foi avaliado por observação direta em microscópio e por ensaios de MTT (Sigma, Saint Louis MO, EUA). Para isso, as células tumorais em suspensão (5 x 103 células/poço) ou aderentes (3 x 103 células/poço) foram colocadas em placas de 96 poços com diferentes concentrações de FA-CS: 125, 62,5, 31,2, 15,6, 7,8, 3,9, 1,95 e 0,975 pg/ml por 48 horas (h). Para avaliar o efeito da combinação FA-CS sobre células normais, foram obtidas PBMC (2 x 105 células/poço), as quais foram estimuladas previamente por 12 h com fitoemaglutinina (PHA) (Invitrogen Corp, Grandlsland, NY, EUA) e cultivadas em placas de 96 poços com as mesmas concentrações da combinação. Como controle negativo, foi utilizado etanol (ETOH) a 0,02% e como controle positivo foram utilizadas diferentes drogas antitumorais como doxorrubicina, camptotecina, vincristina e taxol, aos quais foi determinada a concentração inibidora 50 (IC50) para ser tomada como base para os ensaios posteriores. Finalizada a incubação, o meio de cultivo foi retirado e foram adicionados 50 μl de meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol (Eurobio, Toulouse, FR). 50 μl de MTT (1 mg/ml) [Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio] (Sigma, Saint Louis MO, EUA) foram adicionados a cada poço e incubados por 4 h a 37 °C. Os cristais de formazan foram dissolvidos com dimetilsulfóxido (DMSO) e a densidade óptica foi medida a 540 nm em um Multiskan MCC/340 (Labsystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA).

[057] O efeito citotóxico do FA-CS foi avaliado por MTT sobre diferentes linhagens celulares tumorais. O valor da IC50 sobre as diferentes linhagens celulares foi calculado utilizando-se o software Minitab. Na tabela 1, são observadas as diferentes concentrações correspondentes à IC50 calculada para cada linhagem celular. Esses resultados mostram que a linhagem de câncer de mama humana MCF-7 apresenta a maior sensibilidade com uma IC50 de 4,04 pg/ml seguida pela linhagem de eritroleucemia humana K562 (27,1 pg/ml) e melanoma humano A375 (43,4 pg/ml). Para as linhagens celulares murinas 4T1, as concentrações obtidas são maiores, com valores de 34,1. A linhagem Mel Rel, que não é apresentada na tabela, apresenta uma IC50 de 14,1 pg/ml. A IC50 dos fármacos convencionais também é observada na tabela 1.TABELA 1. CONCENTRAÇÃO INIBIDORA 50 (μG/ML) DA COMBINAÇÃO FA-CS DA INVENÇÃO E DOS FÁRMACOS CONVENCIONAIS SOBRE AS LINHAGENS DE CÉLULAS TUMORAIS E CÉLULAS MONONUCLEARES NORMAIS.

[058] A avaliação da atividade citotóxica do FA-CS sobre as células mononucleares normais foi maior que a dose mais alta de FA-CS e sobre os fibroblastos, a IC50 foi também superior ao controle utilizado: Doxorrubicina.

EXEMPLO 2. INDUÇÃO DE APOPTOSE EM CÉLULAS TUMORAIS PELA COMBINAÇÃO FA-CS DA INVENÇÃO.

[059] Como um indicativo de apoptose precoce, as alterações no potencial da membrana mitocondrial das células K562 e 4T1 foram avaliadas em uma cinética de 4, 8, 12, 24 e 48 h, por citometria de fluxo usando a sonda catiônica lipofílica JC-1 (5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'- tetraetilbenzimidolcarbocianinaiodeto) (Sigma, Saint Louis MO, USA). El JC-1 (10 pg/ml em PBS) foi adicionado a 3 x 105 células/ml e incubado por 10 minutos a 37 °C. A intensidade da fluorescência do JC-1 foi quantificada em um citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, New Jersey, EUA) o FACSDiva (BectonDickinson, New Jersey, EUA) e a análise dos dados foi realizada utilizando-se o software CelIQuest Pro (Becton Dickinson, New Jersey, EUA) ou Flowjo (TreeStar Inc., Ashland, EUA). Todos os tratamentos foram feitos por triplicado e os resultados foram expressos como a média +/- SEM. A apoptose foi determinada medindo-se a exposição da fosfatidilserina através de uma marcação com Anexina V/iodeto de propídio (Molecular probes). Para isso, 5 x 105 células 4T1 foram tratadas com a combinação FA-CS ou ETOH (controle negativo) por 24 e 48 horas. Finalizado p tratamento, as células foram coletadas, centrifugadas e suspensas novamente em tampão anexina (Hepes 100 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 2,5 mM) e Anexina V por 8 minutos. Depois, adicionou-se 2,5 μl de iodeto de propídio por 2 minutos. Finalizada a incubação, prosseguiu-se a leitura imediata em um citômetro de fluxo FACSAria (Becton Dickinson).

[060] Conforme pode ser observado na Figura 2A, a combinação FA-CS induz um aumento na porcentagem de células que têm a membrana mitocondrial despolarizada. Esse efeito é dependente do tempo e é igual para as duas linhagens celulares aliadas.

[061] Adicionalmente, foi determinada a ativação da caspase 3 e a fragmentação do DNA induzida pelo FA-CS. Para avaliar a atividade da caspase 3 foi empregado o Kit de Ensaio Calorimétrico de Caspase 3 (R&D systems Inc., Minneapolis, N, EUA), seguindo as instruções do fabricante. Brevemente, 2 x 106 células (K562 ou 4T1) foram postas em cultivo na presença ou na ausência da combinação FA-CS por 48 horas. Como controle negativo foi empregado ETOH a 0,02% e como controle positivo a doxorrubicina. Finalizada a incubação, as células foram centrifugadas a 250 xg por 10 minutos (min) e o pélete resultante foi lisado por 10 min em gelo e centrifugado a 10.000 xg por 1 min. A reação enzimática foi realizada em placas de 96 poços, usando 50 μl de lisado celular (100 a 200 g de proteína total) e 50 μl do tampão de reação suplementado com 10 μl de DTT fresco e 5 μl do substrato colorimétrico da caspase 3 (DEVD-pNA). Depois de 1 a 2 horas de incubação a 37 °C, a atividade de protease da caspase 3 foi medida em um espectrofotômetro a 405 nM (Labsystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA). A quantidade de atividade da caspase 3 no lisado celular é diretamente proporcional à cor obtida na reação. Os resultados apresentam-se como o aumento relativo da ativação da caspase 3 induzida pelo FA-CS ou o fármaco convencional em relação ao controle. A Figura 2B mostra que a combinação da invenção induz a atividade da caspase 3 nas células tratadas K562, à esquerda, e 4T1, à direita.

[062] Como passo final da indução de morte por apoptose, avaliou-se a fragmentação do DNA por coloração com DAPI por microscopia de fluorescência. As células K562 (2 x 105 células) e 4T1 (2 x 105 células) foram colocadas em cultivo por 24 h sobre lâminas de vidro (13 mm de diâmetro) previamente tratadas com colágeno tipo II (Sigma, Saint Louis MO, EUA). Uma vez aderidas, as células foram tratadas com o FA-CS ou com seus respectivos controles. Como controle positivo foi utilizado a doxorrubicina e como controle negativo, ETOH 0,02% por 48 h a 37 °C e 5% de CO2. Depois do tratamento, as células foram lavadas com PBS pH 7,2 e fixadas com paraformaldeído (PAF) (Sigma, Saint Louis MO, EUA) a 2% por 30 min a 4 °C. As células fixadas foram lavadas 2 vezes com PBS-BSA a 2%, incubadas com acetona fria por 1 minuto, lavadas com PBS-BSA 2% e manchadas com 300 nM de DAPI (Sigma, Saint Louis MO, EUA) por 5 min. Finalmente, as células foram tratadas com kit antiesmaecimento (Molecular probes, InvitrogenCorp, Carlsbad, CA, EUA) e analisadas por microscopia de fluorescência utilizando-se o microscópio confocal FluoView 1000 da Olympus (CenterValley PA, EUA). Na Figura 2C, observam-se claramente os núcleos fragmentados em resposta ao tratamento com a combinação da invenção em comparação com o etanol nas células 4T1.

[063] Integrando os resultados apresentados, tem-se que a combinação FA-CS induz a apoptose das células tumorais pela via mitocondrial. A análise da cinética de expressão da fosfatidilserina, a qual constitui um marcador de morte por apoptose, mostrou que as células tumorais expressam fosfatidilserina reconhecida pela marcação com anexina V e que a morte não é um evento que induz necrose precoce, mas sim tardia, conforme observado na Figura 2A.

EXEMPLO 3. REDUÇÃO DA CAPACIDADE CLONOGÊNICA DAS CÉLULAS TUMORAIS POR TRATAMENTO COM LA COMBINAÇÃO DA INVENÇÃO.

[064] Para avaliar o efeito da combinação FA-CS a longo prazo sobre a capacidade clonogênica das células tumorais, as linhagens K562 e 4T1 (1,0 X 105 células /poço) foram tratadas com o FA-CS ou com seus respectivos controles por 6 horas. Como controle positivo foram utilizadas vincristina e doxorrubicina e como controle negativo, ETOH 0,02%. Finalizado o tratamento, 20.000 células foram plaqueadas em placas de Petri de 60 mm com ágar 0,5 a 0,3% por 14 dias a 37 °C com 5% de CO2 e manchadas posteriormente com cristal violeta a 0,4%. As colônias com mais de 50 células foram contadas. Todos os tratamentos foram realizados por triplicado e os resultados são expressos como a média +/- SEM do número de colônias totais.

[065] Conforme observado na Figura 3, depois de 14 dias em cultivo, a capacidade de proliferação das células tumorais K562 (3A) e 4T1 (3B) é reduzida em comparação com o controle negativo (ETOH). Resultados similares foram observados para os respectivos controles positivos.

EXEMPLO 4. ATIVIDADE COADJUVANTE DA COMBINAÇÃO FA-CS COM AGENTES QUIMIOTERÁPICOS CONVENCIONAIS

[066] A atividade coadjuvante da combinação FA-CS da invenção foi determinada sobre a linhagem CF-7 a uma concentração de 1,6 μg/ml (27 vezes menor que a IC50) em cotratamento com agentes quimioterápicos tais como: doxorrubicina, vincristina, taxol e camptotecina a concentrações abaixo do ideal. Para avaliar a viabilidade celular, foi utilizado o teste de MTT. Células MCF-7 (3 x 103 células/poço) foram cultivadas em placas de 96 poços e tratadas por 6 h com a combinação FA-CS, lavadas e incubadas em meio fresco com cada um dos fármacos quimioterápicos por 48 h a 37 °C em atmosfera úmida e 5% de CO2. O ensaio de MTT foi realizado conforme descrito previamente. Os resultados são expressos como porcentagem de viabilidade celular em comparação ao controle.

[067] A Figura 4 mostra que a combinação de doxorrubicina, vincristina e camptotecina com a combinação da invenção FA-CS diminui significativamente a viabilidade celular. Esses resultados mostram que o tratamento com a combinação da invenção pode sensibilizar as células tumorais ao tratamento com os fármacos convencionais, diminuindo as doses exigidas nos tratamentos e por fim a toxicidade sistémica associada à quimioterapia.

EXEMPLO 5. INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO IN VIVO DO TUMOR PRIMÁRIO DE CÉLULAS TUMORAIS 4T1 INDUZIDO PELA COMBINAÇÃO DA INVENÇÃO E DIMINUIÇÃO NA METÁSTASE EM DIFERENTES ÓRGÃOS.

[068] Ratos fêmeas BALB/c de 6 a 12 semanas foram adquiridas junto a Charles Rivers laboratorios (Wilmington, MA) e mantidas no centro de pesquisa animal. Os ratos foram mantidos em caixas de polietileno e alimentados com comida e água à vontade em um quarto com temperatura e umidade relativa controladas e com ciclos de luz-escuridão de 12 h. Os ratos aclimataram-se 1 semana antes de seu uso.

[069] As células 4T1 (1 x 104) foram suspensas novamente em tampão fosfato salino e injetadas na glândula mamária no lado direito (por via subcutânea, s.c, dia 0). 5 dias depois da inoculação, os ratos foram tratados por via I.P com a combinação (9,3 ou 18,7 mg/kg) ou o controle, duas vezes por semana. Para avaliar o efeito da combinação, grupos de 7 a 8 ratos foram separados para seu tratamento diferencial. Semanalmente, amostras de sangre foram tomadas pela veia da cauda para determinar o número de leucócitos, usando-se um hemocitômetro (ABX MICROS 60®). O volume do tumor foi determinado duas vezes por semana utilizando-se um calibrador de vernier e foi calculado usando-se a seguinte fórmula: Volume do tumor (mm3) = [(largura)2 x longitude]/2. Os ratos foram sacrificados quando o tumor primário alcançou 2.000 mm3; e após a morte, o tumor primário foi pesado.

[070] A dose da combinação foi estabelecida depois de determinar a toxicidade in vivo com o fim de estabelecer a dose letal mínima possível de ser utilizada na terapia. Conforme observado na Figura 5A e B, o FA-CS reduz significativamente o diâmetro do tumor em comparação ao controle negativo a partir de 22 até 30 dias de tratamento. Quando os ratos foram sacrificados, ao final do tratamento, o peso do tumor foi calculado e claramente pode observar-se uma diminuição do peso do tumor com o tratamento nas duas concentrações utilizadas versus o controle negativo. Da mesma forma, na Figura 5C, observa-se que o tratamento diminui a reação leucemoide que se apresenta nesse modelo como consequência do crescimento do tumor. Ao realizar as análises histopatológicas dos diferentes órgãos como pulmão, fígado, medula óssea, cérebro e baço, observou-se uma diminuição no número de células tumorais nos órgãos dos ratos tratados com a combinação FA-CS versus o controle negativo (Figura 6A).

[071] Depois do tratamento com a combinação FA-CS, o tumor primário, os pulmões, o baço, o fígado, o cérebro e a medula óssea foram coletados novamente e seccionados. Em seguida, os tecidos foram fixados em 10% de formaldeído (Sigma-Aldrich), embebidos em parafina e cortados em seções de 2 μm para serem manchados com hematoxilina-eosina (H&E). As células tumorais metastáticas infiltrantes nos diferentes órgãos foram avaliadas em cada tecido e foram contadas com o uso de uma grade micrométrica (poder de resolução 10 X e 40 X) em um microscópio de luz. Na Figura 6B, observa-se a diminuição no número de metástase no baço e no pulmão, além da diminuição no número de células tumorais presentes no tumor primário nos ratos tratados com a combinação versus os controles.

[072] O soro dos ratos tratados com a combinação foi coletado por punção cardíaca e a medição de citocinas em soro foi realizada com o uso do kit de CBA de inflamação para ratos (Becton Dickinson). Os experimentos foram realizados duas vezes. Os resultados são expressos como a média de dois experimentos independentes. Observa-se, na Figura 7, uma diminuição da IL6 sérica em resposta ao tratamento com diferentes doses da combinação FA-CS. Esses resultados sugerem que o tratamento com a combinação FA-CS tem um efeito sobre a resposta inflamatória do hospedeiro, que se correlaciona com uma diminuição no diâmetro do tumor e um melhor controle da metástase, confirmando o papel antitumoral da combinação FA-CS da invenção.

EXEMPLO 6. O TRATAMENTO COM A COMBINAÇÃO FA-CS FAVORECE A MORTE IMUNOGÊNICA EM CÉLULAS 4T1.

[073] O efeito do FA-CS sobre a liberação de diferentes sinais de perigo que foram implicados na geração de morte celular imunogênica foi avaliado sobre células 4T1. Para a avaliação na expressão da Calreticulina (CRT), células 4T1 foram cultivadas em placas de 12 poços e tratadas com o controle negativo (etanol), a combinação FA-CS (34 μg/ml) e doxorrubicina (0,51 μg/ml) por 24 h. As células foram marcadas com o anticorpo primário (anti-CRT, ab2907, abcam) diluído em tampão de bloqueio frio (SFB a 2% em PBS) por 30 min, lavadas e incubadas com o anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) em tampão de bloqueio por 30 min. As células foram adquiridas em um citômetro de fluxo FACSAria II (Becton Dickinson) para identificar a CRT na membrana plasmática. A intensidade de fluorescência das células manchadas foi avaliada sobre uma população água negativa. As análises foram realizadas utilizando-se o software FlowJo (Tree Star Inc).

[074] Para a detecção da proteína HMGB1, células 4T1 (1 x 104) foram cultivadas sobre lâminas de vidro em placas de 12 poços e tratadas com o controle negativo (etanol), a combinação FA-CS (34 μg/ml) e doxorrubicina (0,51 μg/ml) por 24 h. Para a coloração intracelular de HMGB1, as células foram marcadas com o anticorpo primário (anti- HMGB1, ab18256, Abcam) por 60 min, lavadas 3 vezes em PBS e incubadas por 30 min com o anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 488 (Molecular Probes). Finalizada essa incubação, as células foram marcadas com DAPI (Molecular Probes) por 5 min e a fluorescência foi preservada com o Prolong Antifade Kit (Molecular Probes) e analisadas em um microscópio de fluorescência confocal (FluoView 1000).

[075] A Figura 8 mostra que o tratamento com a combinação FA-CS favorece o aumento na expressão da CRT na membrana das células tumorais 4T1. Da mesma forma, esse tratamento favorece a translocação da proteína HMGB1 do núcleo para o citoplasma depois do tratamento. Com esses resultados podemos concluir que o tratamento com o FA-CS induz a morte das células tumorais de tipo imunogênica.

EXEMPLO 7. A VACINAÇÃO DE RATOS BALB/C COM CÉLULAS 4T1 PRÉ-TRATADAS COM A COMBINAÇÃO FA-CS FAVORECE A GERAÇÃO DE LINFÓCITOS T CD4+ PRODUTORES DE IL-2, TNF-A E IFN—Y EX VIVO.

[076] Para avaliar o efeito da vacinação de ratos BALB/c com células tumorais 4T1 pré-tratadas in vitro com a combinação FA-CS na indução de uma resposta imunológica, células 4T1 foram tratadas com o controle negativo (etanol), a combinação FA-CS (34 μg/ml) ou doxorrubicina (0,51 ug/ml) por 48 h. Depois do tratamento, as células foram injetadas na almofada plantar de ratos BALB/c. 7 dias depois, os nódulos linfoides poplíteos (NLP) foram obtidos e cultivados (1 x 106) por 1 h na presença ou na ausência de miristato acetato de forbol (PMA) / lonomicina (Becton dickinson), seguido da adição de brefeldina A (6 h a 37 °C). Essas células foram marcadas com um colorante de viabilidade (colorante reativo fluorescente LIVE/DEAD Aqua, Molecular Probes) por 20 min à temperatura ambiente (TA) e com anticorpos monoclonais específicos para: CD3-Alexa Fluor 647 anticamundongo de rato(clone 17A2), CD4-PerCP anticamundongo de rato (clone RM4-5), CD8-PE anticamundongo de rato (clone 53-6.7) (Becton Dickinson) por 30 min a 4 °C. Depois disso, as células foram fixadas e permeabilizadas utilizando-se o kit BD Cytofix/Cytoperm Plus (Becton Dickinson) e marcadas intracelularmente com: IL-2-FITC anticamundongo de rato, TNF-PE Cy7 anticamundongo de rato (clone MP6-XT22) e IFN—Y—Alexa Fluor 700 anticamundongo de rato (clone XMG1.2) (Becton Dickinson) por 30 min a 4 °C. As células foram adquiridas em um citômetro de fluxo FACSAria II e analisadas com o software FlowJo.

[077] Na Figura 9, pode—se observar que os ratos que foram vacinados com as células tumorais 4T1 pré—tratadas in vitro com a combinação FA—CS (t—FA—CS) geram um maior número de linfócitos T CD4+ produtores de IL—2, TNF—α e IFN—Y em comparação aos ratos vacinados com células 4T1 vivas (t—LIVE).

EXEMPLO 8. A VACINAÇÃO DE RATOS BALB/C COM CÉLULAS 4T1 PRÉ-TRATADAS COM A COMBINAÇÃO FA-CS FAVORECE A PRODUÇÃO DE IL-4 E IL-5 EM RESPOSTA AO ESTÍMULO ANTIGÉNICO.

[078] Para avaliar o efeito da vacinação com células 4T1 pré-tratadas in vitro em ratos BALB/c, células 4T1 foram tratadas com o controle negativo (etanol), a combinação FA-CS (34 μg/ml) ou doxorrubicina (0,51 ug/ml) por 48 h. Depois do tratamento, as células foram injetadas na almofada plantar de ratos BALB/c. 7 dias depois, os nódulos linfoides poplíteos (NLP) foram obtidos e cultivados (1 x 106) por 72 h em meio RPMI 1640 suplementado e com 50 mM de 2-mercaptoetanol na presença de 0,5 μg/ml de CD28 anticamundongo (clone 37.51, Becton Dickinson) e 1 μg/ml de CD49d anticamundongo (Clone R1-2, Becton Dickinson). Em alguns poços, fez-se uma nova estimulação com um lisado de células 4T1 (100 μg) ou com um mesmo volume de PBS. Depois de 72 horas, os sobrenadantes foram coletados novamente e armazenados a -70 °C até seu processamento. A produção de citocinas no sobrenadante de cultivo foi avaliada por citometria de fluxo com o uso do kit de arranjo de microesferas (CBA) de BD para citocinas inflamatórias de rato (Becton Dickinson). As citocinas avaliadas foram IL-4, IL-5, TNF-α ou IFN-y. As citocinas foram adquiridas com o uso de um FACSAria II e analisadas com o uso do programa FCAP Array (Becton Dickinson). Os tratamentos foram realizados por triplicado e os resultados expressos como a média e as faixas de 3 experimentos independentes.

[079] Na Figura 10, pode-se observar que a vacinação de ratos BALB/c com t-FA-CS favorece a produção de IL-4 e IL- 5. Esse aumento foi evidenciado mais claramente quando as células foram cultivadas na presença de um lisado de células 4T1, sugerindo que a produção dessas citocinas é dependente de antígeno.

Claims

1. Combinação CARACTERIZADA por compreender: (a) entre 55 e 70% em peso/peso, em relação ao peso total da combinação, de um ou mais compostos selecionados a partir do grupo que consiste em: ácido 3,4,5-triidroxi-1-(3,4,5-triidroxibenzoil) oxiciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,4,5-triidroxi-3-(3,4,5-triidroxibenzoil) oxiciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,3,5-triidroxi-4-(3,4,5-triidroxibenzoil) oxiciclohexano-4-carboxílico, ácido 1,3,4-triidroxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil) oxiciclohexano-4-carboxílico, (b) entre 10 e 20% em peso/peso, em relação ao peso total da combinação, de um ou mais compostos selecionados a partir do grupo que consiste em: ácido 1,4-diidroxi-3,5-bis-[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,5-diidroxi-3,4-bis-[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,3-diidroxi-4,5-bis-[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, (c) entre 1 e 10% em peso/peso, em relação ao peso total da combinação, do composto: ácido 4-hidróxi-1,3,5-tris-[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 5-hidróxi-1,3,4-tris-[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 3-hidróxi-1,4,5-tris-[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 1-hidróxi-3,4,5-tris-[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, (d) entre 1 e 10% em peso/peso, em relação ao peso total da combinação, do composto: 3,4-diidróxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil)-oxi-benzoato, metil-3,4-diidróxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil)-oxi- benzoato, (e) entre 0,1 e 5% em peso/peso, em relação ao peso total da combinação, do composto: metil-3,4,5-triidroxibenzoato, (f) entre 0,1 e 8% em peso/peso, em relação ao peso total da combinação, do composto: 3,4,5,6-tetraquis[(3,4,5-triidroxibenzoil)oxi]oxan-2- il]metil-3,4,5-triidroxi benzoato, em que a combinação fornece um efeito sinérgico no tratamento de câncer.

2. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender: (a) a combinação conforme definida na reivindicação 1; e (b) um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis para a adequação a uma forma farmacêutica líquida, sólida ou heterodispersa; em que a composição farmacêutica fornece efeito sinérgico no tratamento de câncer.

3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA por compreender: (g) entre 55 e 70% em peso/peso, em relação ao peso total da combinação, de um ou mais compostos selecionados a partir do grupo que consiste em: ácido 3,4,5-triidroxi-1-(3,4,5-triidroxibenzoil) oxiciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,4,5-triidroxi-3-(3,4,5-triidroxibenzoil) oxiciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,3,5-triidroxi-4-(3,4,5-triidroxibenzoil) oxiciclohexano-4-carboxílico, ácido 1,3,4-triidroxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil) oxiciclohexano-4-carboxílico, (h) entre 10 e 20% em peso/peso, em relação ao peso total da combinação, de um ou mais compostos selecionados a partir do grupo que consiste em: ácido 1,4-diidróxi-3,5-bis[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,5-diidróxi-3,4-bis[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 1,3-diidróxi-4,5-bis[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, (i) entre 1 e 10% em peso/peso, em relação ao peso total da combinação, do composto: ácido 4-hidróxi-1,3,5-tris[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 5-hidróxi-1,3,4-tris[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 3-hidróxi-1,4,5-tris[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, ácido 1-hidróxi-3,4,5-tris[(3,4,5-triidroxibenzoil) oxi]ciclohexano-1-carboxílico, (j) entre 1 e 10% em peso/peso, em relação ao peso total da combinação, do composto: 3,4-diidróxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil)-oxi-benzoato, metil-3,4-diidróxi-5-(3,4,5-triidroxibenzoil)-oxi- benzoato, (k) entre 0,1 e 5% em peso/peso, em relação ao peso total da combinação, do composto: metil-3,4,5-triidroxibenzoato, (l) entre 0,1 e 8% em peso/peso, em relação ao peso total da combinação, do composto: 3,4,5,6-tetraquis[(3,4,5-triidroxibenzoil)oxi]oxan-2- il]metil-3,4,5-triidroxi benzoato.

4. Uso de uma combinação, conforme definida na reivindicação 1, CARACTERIZADO por ser na preparação de medicamentos em formas farmacêuticas líquidas, sólidas ou heterodispersas com atividade antitumoral, antimetastática e indutora da resposta imunológica para o tratamento de câncer em um mamífero.

5. Uso de uma composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 2 ou 3, CARACTERIZADO por ser como um agente coadjuvante da terapia para o tratamento de câncer, o qual diminui as doses exigidas de agentes inibidores de topoisomerases, inibidores de mitose, agentes alquilantes e antimetabólitos na quimioterapia convencional.

6. Uso de uma composição, conforme definida na reivindicação 2 ou 3, CARACTERIZADO por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer em um mamífero para controlar o tumor primário e/ou as metástases.

7. Uso de uma composição, conforme definida na reivindicação 2 ou 3, CARACTERIZADO por ser na preparação de um coadjuvante de terapia para o tratamento de câncer, o qual diminui as doses exigidas de agentes inibidores de topoisomerases, inibidores de mitose, agentes alquilantes e antimetabólitos na quimioterapia convencional.