BRPI0714046A2

BRPI0714046A2 - mÉtodos de combinaÇço para tratar cÂncer

Info

Publication number: BRPI0714046A2
Application number: BRPI0714046-0A
Authority: BR
Inventors: Eliezer Flescher; Alina Heyfets; Max Herzberg
Original assignee: Univ Ramot; Sepal Pharma Ltd
Priority date: 2006-07-10
Filing date: 2007-07-10
Publication date: 2013-04-24
Also published as: CN101511351A; EP2037903A1; CA2657375A1; AU2007273809A1; JP2009542799A; WO2008007367A1; US20100003346A1

Abstract

MÉTODOS DE COMBINAÇçO PARA TARATAR CÂNCER. A presente invenção se refere às composições e métodos para tratar câncer, por administrar uma combinação n compreendendo um derivado de jasmonato (por exemplo, metil jasmonato ou um composto de qualquer fórmula de I e VII ou quaisquer dos derivados de jasmonato exemplicados por tal fórmula) e pelo menos um outro agente selecionado de um agente quimioterápico (por exemplo, uma nitrosouréia, um composto de paltina, um derivado de taxano, um antibiótico antitumor) e um inibidor de glicólise (por exemplo, 2-deosi-D-glucose). O derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo fornecendo um efeito terapêutico, o qual é preferivelmente sinérgico (cooperativo).

Description

"METODOS DE COMBINAQAO PARA TRATAR CANCER" Campo da Invencao

A presente inven^ao se refere ao tratamento de cancer empregando terapia por com- bina9ao compreendendo um derivado de jasmonato em combina^ao com um agente quimiote- rapico e/ ou um inibidor de glicolise.

Antecedentes da Invenpgo

Os jasmonatos sao uma familia de hormonios do estresse nas plantas，derivados de acido Iinolenico pela via octadecanoide, os quais sao encontrados em quantidades exatas em muitas plantas comestiveis. Hormonios do estresse tais como a familia de jasmonato tem se desenvolvido em plantas, e sao Iiberados em momentos de estresse tal como radiagao de UV extrema, choque osm0tico, choque termico e ataque do patogeno, para iniciar varias cascatas que terminam em respostas adequadas. Os exemplos de membros da familia de jasmonato sao acidos jasmonicos, os quais sao cruciais para sinalizagao intracelular em resposta a Iesao1 e metil jasmonato (MJ), ο qual causa a iridugao de um inibidor de proteinase, que se acumula em concentragdes baixas em resposta a ataques patogenicos ou ferimentos. O uso de jasmo- natos para ο tratamento de cancer em mamifero foi descrito em Patente dos Estados Unidos No. 6.469.061, cujos conteiidos estao incorporados aqui por referenda em sua totalidade. Em Patente dos Estados Unidos No. 6.469.061，foi mostrado que os jasmonatos foram diretamente citotoxico para varios tipos de celulas de cancer humano derivadas de canceres no sarigue, mama, prostata e pele. MJ em particular mostrou ser eficaz em prevengao de desenvolvimento de Iinfomas em camundorigos (veja, U.S. 6.469.061 e Firigrut, O. e E. Flescher. 2002 (1)). MJ da mesma forma mostra induzir a morte em Iinhagens de celulas de melanoma e mama, pros- tata, Ieucemia humana，assim como em celulas Ieucemicas de pacientes com Ieucemia Iinfoci- tica cronica (CLL) (2,3).

Ao mesmo tempo em que os jasmonatos obtidos morrem em celulas Molt-4 Ieucemica

humana, nao Iesionam as celulas do esperma humano e Iinfocitos normais (2)，eritrocitos de sangue periferico normal (4). Veja tambem WO 02/080890，cujos conteiidos estao incorpora- dos aqui por referencia em sua totalidade. Estes resultados fortemente suportam a conclusao que os jasmonatos especificamente objetivam as celulas transformadas. Publicagao de Patente Internacional de PCT WO 2005/054172，cujos conteiidos estao

incorporados aqui por referencia em sua totalidade, descreve novos derivados halogenio ados de jasmonato, composi?0es farmaceuticas compreendendo os derivados, e seu uso para redu- zir ο crescimento da celula de cancer e para tratar ο cancer.

Publica?5es de Patentes Internacionais WO 2007/066336 e WO 2007/066337, cujos conteiidos de cada uma estao incorporados aqui por referencia em sua totalidade, descrevem novos derivados de jasmonato, composigdes farmaceuticas compreendendo os derivados, e

seu uso para reduzir ο crescimento da celula de cancer e para tratar ο cancer. Tem sido ainda mostrado que os jasmonatos sao capazes de induzir a ambos, morte apoptotica e necrotica em Molt-4 de celulas Ieucemia Iinfoblastica humana (1). Alem disso, os jasmonatos sao capazes de matar as celulas de cancer de certo modo independente da trans- crigao de mRNA celular, translagao de proteina (5)，e expressao de p53 (6).

Estudos recentes tem analisado os mecanismo por meio dos quais os jasmonatos in-

duzem a morte celular. As mitocondrias foram encontradas para desempenhar um papel fun- damental no mecanismo de a9§o dos jasmonatos. Na verdade, os jasmonatos agem direta- mente nas mitocondrias, resultando em morte celular (2). Despolarizagao da membrana mito- condrial induzida por jasmonatos e Iibera^ao de citocromo c em contatar as celulas de cancer (2)_ Com mais importancia, a tumefagao e a Iiberagao de citocromo c induzem ο MJ em mito- condrias isoladas das Iinhagens de celulas de hepatoma e Ieucemia humana, assim como celu- las leuc§micas de pacientes com CLL (2). De qualquer modo, os jasmonatos nao induziram a Iiberagao de citocromo c ou a tumefagao em mitocondrias isoladas dos Iinfocitos normais. Des- te modo, parece que a diferenga entre as celulas de cancer e normais existem no nivel mito- condrial. Interessantemente, os jasmonatos nao induziram a tumefagao em mitocondrias isola- das de imortal, mas nao transformada, fibroblastos humano 3T3 (2), sugerindo que a transfor- magao neoplasica produz as mitocondrias suscetiveis aos jasmonatos. Deste modo, ο MJ tem efeitos mitocondriotoxicos diretos, sugerindo fortemente que as mitocondrias sao aIvo das or- ganelas de jasmonatos. Em defesa desta discussao, os inibidores da abertura do complexo do poro de transigao de permeabilidade mitocondrial (PTPC，uma perturba?ao mitocondrial por mediagao do poro resultando em morte celular) reduzem significantemente os efeitos toxicos de MJ nas celulas de cancer e nas mitocondrias isoladas destas celulas. Estes estudos (2) mostram que os jasmonatos matam as celulas de cancer de certo modo dependente do PTPC. O efeito direto dos jasmonatos nas mitocondrias deve favorece-los com a capacidade de des- viar as mutagdes antiapoptotica premitocondriais, desse modo preparando esta classe de a- gentes anti-cancer potencialmente ativa com uma variedade de tumores resistentes a droga.

De acordo com os principios para selecionar os agentes para uso em combinagao com regimes de quimioterapia, as drogas com diferentes mecanismos de agao e com efeitos citotoxicos sinergicos ou aditivos no tumor podem ser combinados (7). A terapia de multiagente tem tres importantes vantagens teoricas sobre a terapia de agente ύηϊοο. Primeiro1 pode maxi- mizar a morte da celula ao mesmo tempo minimizando as toxicidades hospedeiras por empre- gar agentes com toxicidades Iimitadoras de dose nao se sobrepondo. Segundo, pode aumentar a faixa da atividade da droga com as celulas de tumor com resistencia ao endogeno para tipos especificos de terapia. Finalmente, pode da mesma forma, prevenir ou retardar ο desenvolvi- mento de celulas de tumor recentemente resistentes (7). Virtualmente, quase todos os regimes de quimioterapia curativos para cancer empregam combinagdes de drogas de multiagentes (8).

Se bem que as combinagdes de droga ideais seriam aquelas que sao sinergicamente ativa com celulas malignas sem toxicidade sistemica aumentada, atividade anti-tumor aditiva com perfil de toxicidade favoravel pode, da mesma forma, ser clinicamente benefica (9).

Os agentes quimioterapeuticos tradicionais podem ser classificados por mecanismo de agao. Os agentes de alquilagao prejudicam a fungao da celula por formagao de Iigagdes covaIentes com os grupos de amino, carboxila, sulfidrila, e fosfato em moleculas biologicamen- te importantes. Os Iocais mais importantes de alquilagao sao DNA，RNA, e proteinas. Os agen- tes de alquila^ao dependem da proliferagao da celula para a atividade, mas nao sao fases es- pecificas do ciclo celular. Os agentes de alquilagao sao classificados de acordo com suas es- truturas quimicas e mecanismos de Iiga^ao covalentes; esta classe de droga inclui complexos de platina (cisplatina) e mostardas de nitrogeriio, nitrosoureias (BCNU) (7). Os taxanos sao derivados semi-sinteticos de precursores extraidos dos espinhos de plantas teixo. Estas drogas tem um novo anel de 14 membros, ο taxano. Ao contrario dos alcaloides de vinca，os quais causam a separagao microtubular, os taxanos (por exemplo, taxol) promovem a montagem microtubular e a estabilidade, por esse motivo bloqueando ο ciclo celular em mitose (7). Os antibioticos antitumor tipo adriamicina intercala no DNA em sequencias de guaninica-timiria e guaninica-citosina, resultando em formagao de oxidagao espontanea de radicals Iivre de oxige- nio que causam a ruptura do filamento (7).

Recentemente, tem sido empregado tres modelos in vitro de hipoxia simulada (10-12), de modo que as celulas sob condi^des hipoxicas sao mais sensiveis do que as celulas sob condi^des aerobicas a agentes que inibem a glic6lise, tal como 2-deosi-D-glicose (2DG). Por- que uma populagao de tumor se proliferando Ientamente pode ser seletivamente morta com os inibidores glicoliticos, combinando tais agentes com drogas quimioterapeuticas, as quais objeti- vam as celulas aerobicas rapidamente divididas, devendo aumentar as eficacias globais destes tratamentos (10-12). Na verdade, a combina?§o de 2DG e cisplatina e mais eficaz do que outro agente sozinho quando aplicado a varias Iinhagens de celulas que sao rapidamente prolifera- das in vitro (13). O siriergismo similar in vitro tem sido observado com a combina^ao de 2DG e adriamicina (ADR) em celulas MCF7 (14). Tem sido recentemente constatado que 2DG e MJ tem um efeito aditivo em deplegao de ATP em Iinfomas de celulas B expressando qualquer dos dois, peso ou p53 mutante (6). A base para este efeito aditivo e provavelmente os jasmonatos de agoes inibidoras e ο 2DG tem uma serie de reagao celulares diferentes gerando ATP, fosfo- rilagao oxidativa e glicolise, respectivamente.

BCL1 (leucemia de celulas B/ Iinfoma 1) e uma Ieucemia espontanea de murino origi- nalmente descrita em 1978 por Slavin e Strober em um camundongo BALB/cKa femea de 2 anos de idade (H-2d) (15). O camundongo sofrendo do tumor tem contagens elevadas de Ieu- cocito e esplenomegalia acentuada. Os aspectos citologicos das celulas BCL 1 sao essencial- mente os mesmos, como aqueles observados em distiirbios humanos de leucemia Iinfocitica cronica (CLL) e Iinfoma Iinfocitico bem diferenciado (16). Deste modo, fornecem um modelo animal Citil para ο estudo destas doen^as. Com relagao a CLL1 se bem que muitos pacientes tem uma doen^a benigna e vivem um periodo de vida normal, outros tern uma forma mais ma- ligna de doenga e tem ο periodo de vida muito encurtado apos a diagnose devido a resistencia a quimioterapia (17). As drogas quimioterapeuticas, tais como, clorambucila, prednisona, e cer- tos anticorpos monoclonais direcionados para proteinas da superficie da celula especifica indu- zindo apoptose B-CLL in vivo, ainda que a remissao complete seja dificil conseguir e os pacien- tes recaem eventualmente totalmente (18). Os analogos de purina induzem ao melhoramento clinico significante, mas sao associados inevitavelmente com a supressao imune, resultando em infec^des oportunistas (19). Alem disso, a combinagao de 9-)ff-D-arabinofuranosil-2- fluoroadenina (fludarabina) e ciclofosfamida induzem a mielosupressao (20). E, por esse moti- vo, importante buscar novos agentes os quais podem ser Citeis como novas terapias de CLL, sozinhos ou em combinagao com drogas ja conhecidas.

A atividade farmacologica de compostos de jasmonato torna-os candidatos atrativos como agente terapeuticos para ο tratamento de cancer, sozinho ou em combinagao com agen- tes quimioterapeuticos adicionais.

Sumario da lnvenc§o

A presente inven^io se refere a composites e metodos para tratar cancer, por admi- nistrar uma combinagao compreendendo um derivado de jasmonato (por exemplo, metil jas- monato ou compostos de quaisquer formulas de I ate Il ou quaisquer dos derivados de jasmo- nato exemplificados por tais formulas) em combinagao com pelo menos um outro agente sele- cionado de um agente quimioterapico (por exemplo, uma nitrosoureia, um composto de platina, um derivado de taxano, um antibiotico antitumor), um inibidor de glicolise (por exemplo, 2- deosi-D-glicose) ou cx)mbina?oes destes. O derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente coletivamente sao administrados em uma quantidade os quais fornecem um efeito tera- peutico, que e preferivelmente sinergico.

Foi inesperadamente descoberto que a combinagao de um primeiro tratamento que inclui a administra^ao de um derivado de jasmonato, como descrito aqui, e um segundo trata- mento empregando um ou mais agentes selecionados de uma droga quimioterapeutica e um inibidor de glicolise, como descrito aqui, podem fornecer efeitos anticancer terapeuticamente eficazes. Em algumas modalidades, ο efeito e sinergico, isto e, ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente juntos produzem um resultado anticancer significantemente melhor (por exemplo, interrupgao do crescimento celular, apoptose, indugao de diferenciagao, morte celular, etc.) do que os efeitos aditivos obtidos por cada constituinte individual quando adminis- trado sozinho em uma dose terapeutica. Preferivelmente, ο efeito global da terapia combinado apos um processo de tratamento deve ser significantemente melhor do que os efeitos obtidos com um processo de cada um dos agentes terapeuticos individualmente.

A combinagao de terapia e particularmente vantajosa, uma vez que a dosagem de ca- da agente em uma terapia por combinagao pode ser reduzida quando comparada a monotera- pia com cad a agente, ao mesmo tempo em que ainda obtem um efeito global anti-tumor. Alem disso, devido ao efeito sinergico, a quantidade total das drogas administradas a um paciente podendo vantajosamente ser reduzida, a qual pode resultar em efeitos colaterais diminuidos.

Como exemplificado aqui, os requerentes da presente invengao investigaram a intera-

qbo entre ο metil jasmonato (MJ) e os agentes quimioterapeuticos convencionais (por exemplo, a nitrosoureia (BCNU), a cisplatina, ο taxol e a adriamicina), assim como um inibidor de glicoli- se, 2-deosi-D-glicose (2DG). O MJ foi encontrado para agir sinergicamente com diversas dro- gas oitotoxicas e 2DG em uma variedade de Iinhagens de celulas. Especificamente, ο MJ exi- biu um efeito sinergico com taxol em Iinhagens de celulas de adenocarcinoma de prostata e adenocarcinoma mamario, carcinoma de pulmao, adenocarcinoma de mama; com cisplatina em Iinhagens de celulas de adenocarcinoma de prostata e carcinoma pancreatic。； com adria- micina em uma Iinhagem de celulas de Ieucemia de celulas B, e com BCNU em Iinhagens de celulas de Ieucemia de celulas B e carcinoma pancreatico. Alem do mais, resultados in vivo demonstram que ο tratamento combinado de MJ com adriamicina significantemente aumentou a sobrevivencia de camundongos sofrendo de Ieucemia BCL1, ao mesmo tempo em que ο MJ ou a adriamicina sozinhos nao induziram ao aumento de sobrevivencia. Alem disso, ο MJ foi encontrado para agir sinergicamente com 2DG em Iinhagens de celulas de adenocarcinoma de mama e carcinoma do colon, carcinoma de pulmao. Os resultados inesperados grifam a impor- tancia da combinagao de MJ com as drogas quimioterapeuticas e sugerem que podem ter valor clinico para ο tratamento de diversos tipos de cancer.

A presente invengao deste modo se refere a um metodo para tratar cancer em um in- dividuo com necessidade deste, compreendendo administrar ao individuo um derivado de jas- monato em combinagao com pelo menos um outro agente selecionado de um agente quimiote- rapico e um inibidor de glicolise, no qual ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agen- te ao mesmo tempo fomecem um efeito terapeutico sinergico.

Em outra modalidade, a presente invengao se refere a um metodo para inibir a prolife- ragao de celula de cancer, compreendendo contatar as celulas de cancer com um derivado de jasmonato em combinagao com pelo menos um outro agente selecionado de um agente quimi- oterapico e um inibidor de glicolise, no qual ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo fornecem um efeito sinergico.

Airida em outra modalidade, a presente ϊηνβηςέίο se refere ao uso de um derivado de jasmonato em combinagao com pelo menos um outro agente selecionado de um agente quimi- oterapico e um inibidor de glicolise, no qual ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo fornecem um efeito terapeutico sinergico.

O termo "em combinagao" ou "tratamento combinado" como empregado aqui significa qualquer forma de tratamento paralelo ou simultaneo com pelo menos dois agentes terapeuti- cos distintos. Este termo e pretendido para abranger igualmente a administragao concomitante das duas modalidades de tratamento, isto e, empregando substancialmente ο mesmo piano de tratamento, assim como se sobrepondo, administragao em sequencial ou alternando os pianos de cada tratamento.

O derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente quimioterapico podem ser

administrados simultaneamente (na mesma ou em formas de dosagem separadas), ou podem ser administrados sequencialmente, em qualquer sequencia. A administragao pode, da mesma forma, ocorrer de acordo com pianos de dosagem alterados, por exemplo, derivado de jasmo- nato seguido por agente quimioterapeutico, e em seguida uma dose adicional de derivado de jasmonato, seguido pelo inibidor de glicolise, etc. Todos os pianos de administragao, incluindo simultaneo, sequencial e alternado, sao considerados pela presente invengao.

Em uma modalidade atualmente preferida, ο derivado de jasmonato e metil jasmona- to. Em outra modalidade atualmente preferida, ο derivado de jasmonato e um composto repre- sentado pela formula:

Em outra modalidade atualmente preferida, ο derivado de jasmonato e um composto

representado pela formula:

O

Em outra modalidade atualmente preferida, ο jasmonato e um composto da formula 9: Em outras modalidades, entretanto, ο derivado de jasmonato pode ser acido jasmoni- co ou qualquer derivado deste. Os derivados de jasmonato adequados sao descritos em Pa- tente dos Estados Unidos No. 6.469.061, Publicagao de Pedido de Patente Internacional de PCT Nos. WO 02/080890’ WO 2005/054172’ e em WO 2007/066336 e WO 2007/066337. Os conteiidos de cada uma das referencias acima mencionadas estao incorporados aqui por refe- rencia em sua totalidade，como se totalmente apresentados aqui.

Os agentes quimioterapeuticos adequados incluem, mas nao estao Iimitados a, agen- tes de alquilagao, agentes antibioticos, agentes antimetabolicos, agentes hormonais, agentes derivados de plantas e seus derivados sinteticos, agentes antiangiogenicos, agentes de indu- 9§o de diferericiagao, agentes de indugao de interrupgao do crescimento celular, agentes de indu?ao de apoptose, agentes citotoxicos, agentes afetando celulas bioenergicas, isto e, afe- tando os niveis da ATP na celula e moleculas/ atividades regulando estes niveis, agentes bio- Iogicos1 por exemplo, anticorpos monoclonais, inibidores de cinase e inibidores de fatores de crescimento e seus receptores, agentes de terapia de gene, terapia da celula, por exemplo, celulas-tronco, ou qualquer combinagao destes.

Em algumas modalidades atualmente preferidas, ο agente quimioterapico e uma nitro- soureia (por exemplo, 1,3 -bis[2-cloroetil]-10-nitrosoureia (BCNU)), um compost。de platina (por exemplo, cisplatina), um derivado de taxano (por exemplo, taxol), um antibiotico antitumor (por exemplo, adriamicina )’ ou qualquer combina^ao destes. Em outra modalidade atualmente preferida, ο inibidor de glicolise e 2-deosi-D-glicose (2DG).

Em outra modalidade, a presente invengao se refere a um metodo para tratar cancer em um individuo com necessidade deste, compreendendo administrar ao individuo um deriva- do de jasmonato em combinagao com pelo menos um outro agente selecionado do grupo con- sistido de uma nitrosoureia (por exemplo, 1,3-bis[2-cloroetil]-10-nitrosoureia (BCNU)1 um com- posto de platina (por exemplo, cisplatina ), um derivado de taxano (por exemplo, taxol), um antibiotico antitumor (por exemplo, adriamicina ), um inibidor de glicolise (por exemplo, 2DG), ou qualquer combinagao destes, no qual ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro a- gente ao mesmo tempo fornecem um efeito terapeutico. Em uma modalidade preferida, ο efeito terapeutico e sinergico.

Em outra modalidade, ο cancer e carcinoma de pulmao, ο derivado de jasmonato e

metil jasmonato, e pelo menos um outro agente e taxol. Em outra modalidade, ο cancer e car- cinoma pancreatico, ο derivado de jasmonato e metil jasmonato, e pelo menos um outro agente e cisplatina ou BCNU. Em outra modalidade, ο cancer e adenocarcinoma de mama, ο derivado de jasmonato e metil jasmonato, e pelo menos um outro agente e taxol. Em outra modalidade, ο cancer e adenocarcinoma de prostata, ο derivado de jasmonato e metil jasmonato, e pelo menos um outro agente e cisplatina ou taxol. Em outra modalidade, ο cancer e Ieucemia de celulas B1 ο derivado de jasmonato e metil jasmonato, e pelo menos um outro agente e adria- micina ou BCNU. Ainda em outra modalidade, ο cancer e carcinoma do colon, carcinoma de pulmao ou adenocarcinoma de mama, ο derivado de jasmonato e metil jasmonato, e pelo me- nos um outro agente e 2DG.

A presente invengao da mesma forma considera as composigdes farmaceuticas que incluem uma primeira quaritidade de um derivado de jasmonato em combinagao com a segun- da quantidade de pelo menos um outro agente selecionado de um agente quimioterapico e um inibidor de glicolise. A quantidade coletiva de derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente fomece um efeito terapeutico sinergico anti-cancer.

As composig5es farmaceuticas da presente ϊηνβηςβο podem ser fornecidas por qual- quer forma conhecida na tecnica, por exemplo, em uma forma adequada para administragao oral (por exemplo, uma solugao, uma suspensao, um xarope, uma emulsao, uma dispersao, uma suspensao, um comprimido, uma pilula, uma capsula, uma pelete, granulos e um ρό), para administragao parenteral (por exemplo, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, trans- dermal, subcutanea ou intraperitoneal), para administragao topica (por exemplo, um unguento, um gel, um creme), para administragao por inalagao ou para administragao atraves de suposi- torio. Em uma modalidade particular, ο irigrediente ativo e dissolvido em qualquer portador de Iipideo aceitavel.

As combinagoes da presente invengao sao ativas com uma ampla faixa de canceres. As combinag5es da presente invengao sao ativas com uma a ampla faixa de canceres, incluin- do carcinomas, sarcomas, mielomas, leucemias, Iinfomas e tipos mistos de tumores. As cate- gorias particulares de tumores sensiveis ao tratamento incluem distOrbios linfoproliferativos, cancer de mama, cancer ovariano, cancer de prostata, cancer cervical, cancer endometrial, cancer osseo, cancer do figado, cancer do estomago, cancer do colon, cancer pancreatico, cancer da tiroide, cancer de cabega e pescogo, cancer do sistema nervoso central, cancer do sistema nervoso periferico, cancer de pele, cancer do rim, assim como metastases de todos acima. Os tipos particulares de tumores sensiveis ao tratamento incluem: carcinoma hepatoce- lular, hematoma, hepatoblastoma, rabdomiossarcoma, carcinoma esofagico, carcinoma de ti- roide, anglioblastoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogeriico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdoteliosarcoma, carcinoma ductal invasivo, adenocarcinoma papilar, melanoma, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basais，adenocarcinoma (bem diferenciadas, mo- deradamente diferenciadas, pobremente diferenciadas ou riao diferenciadas), carcinoma de celulas renal, hipernefroma, adenocarcinoma hipernefroide, carcinoma de ducto de bills, corio- carcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, tumor testicular, carcinoma de pulmao incluindo celula pequena, nao pequena e carcinoma de celulas grandes de pulmao, carcinoma da bexiga, glioma, astrocitoma, meduloblastoma，craniofaringioma, ependimoma,

pinealoma, retinoblastoma, neuroblastoma, carcinoma do colon, carcinoma retal, malignidades g hematopoeticas incluindo todos os tipos de Ieucemia e Iinfoma incluirido: Ieucemia mielogenosa aguda, Ieucemia mielocitica aguda, Ieucemia Iinfocitica aguda, Ieucemia mielogenosa cronica, Ieucemia Iinfocitica cronica, Ieucemia de mastocitos, mieloma miiltiplo, Iinfoma mieloide, Iinfo- ma de Hodgkin, Iinfoma nao de Hodgkin.

Em particular as combinagdes da presente inven?ao sao ativas com cancer de mama,

cancer do rim, cancer do estomago, leucemia, incluindo Ieucemia linfoblastica, carcinoma de pulmao, melanoma e cancer do colon.

Alem disso, as modalidades e ο escopo completo de aplicabilidade da presente inven- 9§o devem tornar-se evidentes na descri^ao detalhada fornecida mais adiante. De qualquer modo, deve ser entendido que a descrigao detalhada e os exemplos especificos, ao mesmo tempo em que iridicam as modalidades preferidas da invengao, sao fornecidas por meio de ilustragao apenas, uma vez que varias mudangas e modifica?5es sem ο espirito e escopo da invengao devem tornar-se evidentes para aqueles versados na tecnica desta descrigao deta- lhada.

Breve Descricao dos Desenhos

FIGURA 1: Efeito citotoxico de MJ com relagao a Iinhagem de celulas de tumor. A cito- toxicidade e calculada com ο % de controle de celulas nao tratadas, media 土 s.e de triplicatas. Figura 1A: CT26, DA-3 e D122. Figura 1B: TRAMP C1, MIA PaCa-2, MCF7 e BCL 1.

FIGURA 2: Efeito citotoxico de tratamentos combinados com MJ e drogas quimiotera- peuticas em Iinhagens de celulas de carcinomas diferentes in vitro. A citotoxicidade e calculada como % de controle de celulas nao tratadas, media 土 s.e de triplicatas. Os valores esperados sao de aditividade presumida. Os valores do efeito observado sao aqueles na verdade gerados pelas combinag5es de MJ e as drogas citotoxicas.

Figura 2A. As celulas Mia PaCa-2 foram incubadas na presenga de cisplatina ou BCNU nas concentra9oes indicadas el ou 1mM de MJ. pV < 0,05 comparando a citotoxicidade esperada a BCNU + MJ (em todas as concentrates indicadas) e cisplatina + MJ (em 1 e 2,5 pg/ml) versus ο efeito observado.

Figura 2B. As celulas MCF7 foram incubadas na presenga de taxol nas concentragdes indicadas e/ ou 1 mM de MJ. pV < 0,05 comparando a citotoxicidade esperada ao taxol + MJ a 2,5 pg/ml versus ο efeito observado.

Figura 2C. As celulas DA-3 foram incubadas na presents de taxol nas concentragdes indicadas el ou 0,5 mM de MJ. pV < 0,05 comparando a citotoxicidade esperada ao taxol + MJ em todas as concentrag5es indicadas exceto para 10 pg/ml, versus ο efeito observado.

Figura 2D. As celulas D122 foram incubadas na presenga de taxol nas concentragdes indicadas e/ ou 1 mM de MJ. pV < 0,05 comparando a citotoxicidade esperada ao taxol + MJ em todas as concentragdes indicadas versus ο efeito observado.

Figura 2E. As celulas TRAMP C1 foram incubadas na presenga de taxol ou cisplatina nas concentrates indicadas e/ ou 0,5 mM de MJ (no caso de cisplatina) e 1 mM de MJ (no caso de taxol). pV < 0,05 comparando a citotoxicidade esperada a cisplatina + MJ em 2,5 pg/ml versus ο efeito observado. pV < 0.05 comparando a citotoxicidade esperada ao taxol + MJ em todas as coricentrag5es indicadas versus ο efeito observado.

FIGURA 3: Efeito citotoxico de tratamentos combinados com MJ e drogas quimiotera- peuticas em celulas BCL1. As celulas foram preincubadas com BCNU (A) ou adriamicina (B) nas concentrates indicadas durante 1 hora, e ο MJ em 0,1 mM foi adicionado durante 24 ho- ras. Os valores esperados sao de aditividade presumida. Os valores do efeito observado sao aqueles na verdade gerados pelas combinagdes de MJ e as drogas citotoxicas. A citotoxicida- de e calculada como % de controle de celulas nao tratadas, media 土 s.e de triplicatas. pV < 0.05 comparando a citotoxicidade esperada a BCNU + MJ em 2,5，5, 10 pg/ml ou adriamicina + MJ em 5’ 10, 25 ng/ml versus ο efeito observado.

FIGURA 4: A combinagao de adriamicina (ADR) e MJ intra-venoso, exibe um efeito cooperative com Ieucemia BCL1 in vivo. Os camundongos foram tratados com MJ a 60 mg/kg intra-venoso todos os dias (5 dias por semaria) durante 4 semanas. A adriamicina (ADR) foi administrada intra-peritoneal dues vezes, 4 mg/kg, em 7 e 14 dias apos a injegao de BCL1. Os camundongos de controle foram injetados com ο veiculo Iipofundina (LPF). Foram 15 camun- dongos em cada grupo. pV = 0, 028 comparando a sobrevivencia de camundongos tratados com ADR versus ADR + Camundongos tratados com MJ.

FIGURA 5: Efeitos combinados de MJ e 2DG em diferentes Iinhagens de celulas. A ci- totoxicidade e calculada como % de controle de celulas nao tratadas, media ± s.e. de triplica- tas. Os valores esperados sao de aditividade presumida. Os valores do efeito observado sao aqueles na verdade gerados pelas combina?5es de MJ e as drogas citotoxicas. pV < 0,05 comparando ao efeito esperado de MJ + 2DG versus ο efeito observado em celulas CT-26 e D122 em todas as concentrates indicadas de MJ (Figura 5A e 5B) e em 0,5 mM de MJ em celulas MCF (Figura 5C). A diferenga entre ο efeito observado e ο esperado no caso de celulas DA3 (Figura 5D) nao foi significante.

Descricao Detalhada da Presente Invencao

A presente invengao se refere a composigoes e metodos para tratar cancer, por admi- nistrar uma combinagao compreendendo um derivado de jasmonato em combinagao com pelo menos um outro agente selecionado de um agente quimioterapico e um inibidor de glicolise. O derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente sao administrados em uma quantidade coletiva para fornecer um efeito terapeutico, preferivelmente um efeito sinergico.

A presente invengao deste modo se refere a um metodo para tratar cancer em um in- dividuo com necessidade deste, compreendendo administrar ao individuo um derivado de jas- monato em combinagao com pelo menos um outro agente selecionado de um agente quimiote- rapeutico, um inibidor de glicolise e combinagdes destes, no qual ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo fornecem um efeito terapeutico sinergico.

Em outra modalidade, a presente invengao se refere a um metodo para inibir uma pro- Iiferagao de celula de cancer, compreendendo contatar as celulas de cancer com um derivado de jasmonato em combinagao com pelo menos um outro agente selecio门ado de um agente quimioterapeutico, um iriibidor de glicolise e combinagdes destes，no qual ο derivado de jasmo- nato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo fornecem um efeito sinergico.

Ainda em outra modalidade, a presente inverxjao se refere ao uso de um derivado de jasmonato em combinagao com pelo menos um outro agente selecionado de um agente quimi- oterapeutico, um inibidor de glicolise e combinagdes deste, no qual ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo fornecem um efeito terapeutico sinergico.

A terapia por combinagao pode fornecer uma vantagem terapeutica em vista da toxici- dade diferencial associada com os dots tratamentos individuals. Por exemplo, tratamento com ο derivado de jasmonato pode induzir a uma toxicidade particular que nao e observada com ο agente quimioterapico ou ο inibidor de glicolise, e vice versa. Tal como, esta toxicidade dife- rencial pode permitir cada tratamento pode ser administrada em uma dose em que as referidas toxicidades nao existem ou sao minimas, tal que simultaneamente a terapia por combina^ao fornece uma dose terapeutica ao mesmo tempo em que evita as toxicidades de cada um dos constituintes dos agentes de combinagao. Alem disso, quando os efeitos terapeuticos obtidos como um resultado do tratamento por combina^ao sao realgados ou sinergicos, isto e, signifi- cantemente melhores do que os efeitos terapeuticos aditivos, as doses de cada um dos agen- tes pode ser reduzida tambem, alem disso, deste modo reduzindo as toxicidades associados a uma exte门s§o ainda maior.

Os termos "sinergico", "cooperativo" e "super-aditivo" e suas varias variag5es gramati- cais sao empregados alternadamente aqui. Uma interagao entre ο metil jasmonato e outro a- gente e considerada ser sinergica, cooperativa ou super-aditiva quando ο efeito observado (por exemplo, citotoxicidade) na presenga das drogas juntas e mais elevada do que a soma dos efeitos individuals (por exemplo, citotoxicidades) de cada droga administrada separadamente. Em uma modalidade, os efeitos combinados observados das drogas e significantemente mais elevado do que a soma dos efeitos individuals. O termo significante significa que ο ρ < 0,05 foi observado.

Derivados de Jasmonatos

Qualquer derivado de jasmonato inclui acido jasmonico, podendo ser empregado nas combinagdes da presente invengao. Como empregado aqui, ο termo "derivado de jasmonato" inclui todos sais, hidratos, solvates, polimorfos, isomeros opticos, isomeros geometricos, enan- tiomeros, diastereomeros, e misturas deste do derivado de jasmonato particular.

Em uma modalidade atualmente preferida, ο derivado de jasmonato e metil jasmona- to, ο qual e quimicamente nomeado de metil 3-oxo-2-(2-penteniI) acido ciclopentaneacetico. Em uma modalidade atualmente preferida, ο derivado de jasmonato e metil jasmona- to. Em outra modalidade atualmente preferida, ο derivado de jasmonato e um composto repre- seritado pela formula:

O

ο——“

Em outra modalidade atualmente preferida, ο derivado de jasmonato e um composto representado pela formula:

O

Em outra modalidade atualmente preferida, ο jasmonato e um composto da formula 9:

Em outras modalidades, entretanto, ο derivado de jasmonato pode ser acido jasmoni- co ou qualquer derivado deste. Os derivados de jasmonato adequados incluem, mas nao estao Iimitados aos derivados descritos em A) Patente dos Estados Unidos No., 6.469.061 e Publica- ？ao de Pedido de Patente Internacional de PCT No. WO 02/080890; B) Publica^ao de Pedido de Patente Internacional de PCT No. WO 2005/054172; C) Publicagao de Pedido de Patente

Internacional de PCT No. WO 2007/066336; D) Publicagao de Pedido de Patente Internacional de PCT No. WO 2007/066337; e Ε) compostos conjugados de aminoacido de jasmonato. Os conteCidos de cada uma das referencias acima mencionadas sao incorporadas aqui por refe- rencia em sua totalidade, como se totalmente apresentados aqui.

Os exemplos nao Iimitados de derivados de jasmonato adequados incluem: A) Compostos descritos em U.S. 6.469.061 e WO 02/080890, representados pela

formula I:

na qual: η e 0,1, ou 2;

R1 e OH, alcoxi, O-glicosila, ou imino,

R2 is OH, O, alcoxi ou O-glicosila,

R3, R4 e R5 sao H, OH1 alcoxi ou O-glicosila, e/ ou na qual R1 e R21 ou R1 e R4 juntos formam uma lactona, e tambem na qual as Iigag5es entre C3: C7, C4 :C5, e C9 :C10 podem ser Iigagdes duplas ou Linicas; ou um derivado da referida formula, na qual ο derivado tern pelo merios um dos seguintes:

um cadeia lateral de acila inferior a C3 (livre de acido ou ester ou conjugado), um quantidade de ceto ou hidroxi (livre de hidroxi ou ester) no carbono C6, ou uma cadeia lateral de n-pentenil ou n-pentil a C7;

e sais, hidratos, solvatos, polimorfos, isomeros opticos, isomeros geometricos, enanti- omeros, diastereomeros, e misturas deste.

Os exemplares de derivados de jasmonato incluem, mas nao estao Iimitados a, metil jasmonato, acido jasmonico, jasmona, 7-iso-acido jasmonico, 9,10-acido diidrojasmonico, 2,3- acido dideidrojasmonico, 3,4-acido dideidrojasmonico, 3,7-acido dideidrojasmonico, 4,5-acido dideidrojasmonico, 4,5-dideidro-7-iso-acido jasmonico, acido cucurbico, 6-epi-acido cucurbico， 6-epi-cucurbico-acido-lactona, 12-hidr0xi-acido jasmonico, 12-hidr0xi-jasmonico-acido-lactona, 11-hidr0xi-acido jasmonico, 8-hidr0xi-acido jasmonico, homo-acido jasmonico, diomo-acido jasmonico, 11-hidr0xi-diomo-acido jasmonico, 8-hidroxi-diomo-acido jasmonico, acido tuberorii- co, acido tuberoriico-O-^-glucopiranosideo, acido cucurbico-O-^ff-glucopiranosideo, 5,6-acido dideidrojasmonico, 6,7-dideidro-acido jasmonico, 7,8-acido dideidrojasmonico, cis jasmona, metil-diidro-isojasmonato, diidro-jasmona, aminoacido conjugado de acido jasmonico, os este- res de alquila inferiores aos referidos acidos jasmonicos.

B) Compostos descritos em WO 2005/054172，representados pela estrutura da formu-

la II: (II) naqual

η e 0,1, ou 2;

R1 e OH1 C1 a C12 alcoxi, C1 a C12 alcoxi substituido, ariloxi, O-glicosila ou imino; R2 e OH, C1 a C12 alcoxi, C1 a C12 alcoxi substituido, O-glicosila, oxo, alquila ou imino;

R31 R41 R51 R61 R71 A, B, C, D e E sao cada um independentemente H, halogenio, OH,

C1 a C12 alcoxi, C1 a C12 alcoxi substituido, ariloxi, O-glicosila,

C1 a C12 alquila ou C1 a C12 alquila substituida; na qual R1 e R21 OuR1I e R4 podem forma juntos uma Iactona que e opcionalmente substituida;

na qual as Iiga95es entre C3:C7, C4 : C5, e C9 :C10 podem independentemente ser Iiga55es duplas ou Iigagoes Linicas;

com a condi?ao de que pelo menos um R3, R4 R51 R61 R71 A, B, C, D e E e um haloge- nio

e sais, hidratos, solvatos, polimorfos, isomeros opticos, isomeros geometricos, enanti- omeros, diastereomeros, e misturas destes. Os exemplares de derivados de jasmonato incluem, mas nao estao Iimitados a: metil

jasmonato di-brometo (MJDB)1 tetrabrometo de metil jasmonato (MJTB), um composto no qual R6 e R7 sao cada um fluoro, um composto no qual R6 e R7 sao cada um iodo, um composto no qual R6 e R7 sao cada um cloro, a composto no qual um de R6 e R7 e iodo e ο outro e hidroxi, e um composto no qual um de R6 e R7 e iodo e ο outro e metoxi. C) Compostos descritos em Pedido de Patente Internacional de PCT

PCT/IL2006/001408, representados pela estrutura da formula III:

na qual

A e selecionado do grupo consistido de: a) COR1;

b) O-COR10; e

c) OR11; 15

20

25

30

Rl e selecionado do grupo consistido de

a) heteroariloxi;

b) -0[(CH2)pO)]m-R12;

c) um grupo da formula:

-NHv^COOR0 R14

；e

d) quando pelo menos um de R3, R4，R5, R6 e R7 e haloalquila ou quando R5 e R6, jun- tos com os carbonos aos quais sao Iigados formam uma C3-C8 cicloalquiia ou uma C3-C8 ciclo- alquila substituida por halo, R1 pode ainda representar hidrogenio ou C1-C12 alquila substituida ou nao substituida;

R2 e selecionado do grupo consistido de hidrogenio, C1-C12 alquila substituida ou nao substituida, C3-C8 cicloalquiia substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substitui- da, heteroarila substituida ou nao substituida, OR8, oxo e NR9aR9b;

R31 R41 R5, R6 e R7 sao cada um independentemente selecionados do grupo consistido de hidrogenio, halogenio, C1-C12 alquila substituida ou nao substituida, C1-C12 haloalquila subs- tituida ou nao substituida, C3-C8 cicloalquiia substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substituida, heteroarila substituida ou nao substituida, OR8 e NR9aR9bi

ou R5 e R6 juntos com os carbonos aos quais sao Iigados formam um C3-C8 cicloalqui- ia ou uma C3-C8 cicloalquiia substituida por halo;

ou um de R5 e R6 represents um atomo de oxigenio que e Iigado a C6, desse modo formando um oxigenio contendo anel de 6 ou 5 membros heterociclicos, respectivamente;

na qual a Iigagao entre C9 e C10 pode ser uma Iigagao dupla ou Cinica;

R81 R9a e R9b sao cada um independentemente selecionados do grupo consistido de hidrogenio, C1-C12 alquila substituida ou nao substituida, C3-C8 cicloalquiia substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substituida, heteroarila substituida ou nao substituida, gli- cosila，ou R9a e R9b podem juntos com ο nitrogenio ao qual estao Iigados formam um anel hete- roaromatico ou heterociclico substituido ou nao substituido opcionalmente contendo um ou mais heteroatomo adicional selecionado de 0，N e S;

R10 e selecionado do grupo consistido de hidrogenio, C1-C^alquila substituida ou nao substituida, C3-C8 cicloalquiia substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substituida e heteroarila substituida ou nao substituida;

R11 e R12 sao cada um independentemente grupo de protegao de hidroxi ou hidroge-

nio;

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R13 e um grupo de protegao de carboxi;

R14 e ο res id uo de um aminoacido natural ou nao natural;

η e selecionado de 0，1 e 2;

m e um nCimero inteiro de 1 a 20; e ρ e um nCimero inteiro de 1 a 12;

incluindo sais, hidratos, solvatos, polimorfos, isomeros opticos, isomeros geometricos, enantiomeros, diastereomeros, e misturas destes. Os exemplos especificos dos compostos da

Ia 12.

D) Compostos descritos em Publicagao de Patente Internacional de PCT WO 2007/066337, incluem: a) Compostos representados pela estrutura da formula IV:

(IV)

na qual η is 0,1, or 2;

Rl e selecionado do grupo consistido de hidrogenio, C1-C12 alquila substituida ou nao substituida, C3-C8 cicloalquila substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substitui- da, heteroarila substituida ou nao substituida, um aminoacido natural ou nao natural, um pepti- deo，OR8 e NR9aR9b;

R2 e selecionado do grupo consistido de hidrogenio, C1-C12 alquila substituida ou nao

substituida, C3-C8 cicloalquila substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substitui- da, heteroarila substituida ou nao substituida, OR8t NR9aR9b1 NHCOR1。

E NHSO2R11;

R3, R4, R5, R6 e R7 sao cada um independentemente selecionado do grupo consistido de hidrogenio, C1-C12 alquila substituida ou nao substituida, C3-C8 cicloalquila substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substituida, heteroarila substituida ou nao substituida, OR8 e NR9aR9b;

no qual a Iigagao entre C9 e C10pode ser uma Iigagao dupla ou iinica; e

R8, R9a1 R9b, R10 e R11, sao da um independentemente selecionados do grupo consis- tido de hidrogenio, C1-C12 alquila substituida ou nao substituida, C3-C8 cicloalquila substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substituida, heteroarila substituida ou nao substitui- da, glicosila，ou R9a e R9b podem juntos ο nitrogenio ao qual sao Iigados formam um anel hete- roaromatico ou heterociclico substituido ou nao substituida contendo um ou mais heteroatomo adicional selecionado de O, N e S; incluindo sais, hidratos, solvatos, polimorfos, isomeros opticos, isomeros geometricos,

enantiomeros, diastereomeros, e misturas destes.

Os exemplos especificos dos compostos da formula IV incluem, mas nao estao Iimita-

dos a: A5

A6 \

b) Compostos representados pela estrutura da formula V:

(V)

na qual

η e independentemente em cada ocx»rrencia 0,1，ou 2; R1 e um grupo da formula:

R2 e independentemente em cada ocorrencia selecionado do grupo consistido de hi- drogenio, C1-C12 alquila substituida ou nao substituida, C3-C8 cicloalquila substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substituida, heteroarila substituida ou nao substituida, OR8, oxo e NR9aR9b;

R3，R41 R5, R6 e R7 sao cada um independentemente em cada ocorrencia selecionada

do grupo consistido de hidrogenio, C1-C12 alquila substituida ou nao substituida, C3-C8 cicloal- quila substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substituida, hereroarila substituida ou nao substituida, OR8 e NR9aR9b;

no qual a Iigagao entre C9 e C10 pode independentemente em cada ocorrencia ser uma Iigagao Ciriica ou dupla; e

R81 R9a and R9b sao cada um independentemente em cada ocorrencia selecionado do grupo consistido de hidrogenio, C1-C12 alquila substituida ou nao substituida, C3-C8 cicloalquila substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substituida, heretoarila substituida ou nao substituida, glicosila, ou R9a e R9b podem juntos com ο nitrogenio os quais sao Iigados formam um anel heteroaromatico ou heterociclico substituido ou nao substituido opcionalmen- te contendo um ou mais heteroatomo adicional selecionado do grupo O, N e S;

Incluindo sais, hidratos, solvatos, polimorfos, isomeros opticos, isomeros geometricos,

enantiomeros, diastereomeros, e misturas destes.

Um exemplo especifico dos compostos da formula V e: o

d) Derivados de jasmonato dimericos, oligomericos ou polimericos compreendendo uma pluralidade de quantidades de acido jasmonico covalentemente ligados. Compostos representados pela estrutura da formula VII:

ο

c) Compostos representados pela estrutura da formula Vl

(VII)

门a qual η e independentemente em cada ocorrencia 0, 1, ou 2; ρ e 2，3，4，5 ou 6;

R1 um Iigador selecionado do grupo consistido de - O-, polioxi C1-C12 alquileno e uma quantidade de agiicar;

R2 e independentemente em cada ocorrencia selecionado do grupo consistido de hi-

drogenio, C1-C12 alquila substituida ou nao substituida, C3-C8 cicloalquila substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substituida, heteroarila substituida ou nao substituida, OR81 oxo e NR9aR9b;

R3, R4, R51 R6 e R7 sao cada um indenpendentemente em cada ocorrencia seleciona- do do grupo consistido de hidrogenio, C1-C12 alquila substituida ou nao substituida, C3-C8 ciclo- alquila substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substituida, heretoarila substitui- da ou nao substituida, OR8 e NR9aR9b;

no qual a Iigagao entre C9 e C10 pode independentemente em cada ocorrencia ser uma Iigagao iinica ou dupla; e

R81 R9a e R9b sao cada um indenpendentemente em cada ocorrencia selecionado do

grupo consistido de hidrogenio, C1-C12 alquila substituida ou nao substituida, C3-C8 cicloalquila substituida ou nao substituida, arila substituida ou nao substituida, heteroarila substituida ou nao substituida, glicosila, ou R9a e R9b podem juntos com ο nitrogenio aos quais sao Iigados formam um anel heteroaromatico ou heterociclico substituido ou nao substituido contendo um ou mais heteroatomo adicional de 0，N e S;

incluindo sais, hidratos, solvatos, polimorfos, isomeros opticos, isomeros geometricos, enantiomeros, diastereomeros, e misturas destes.

Os exemplos especificos dos compostos da formula Vll incluem, mas nao estao Iimi-

tados a:

e) Compostos oligomericos compreendendo uma pluralidade de quantidades de jas-

monato Iigados atraves de um Iigador de quantidade de agijcar, representados pela estrutura da formula VIII:

(VIM) na qual

R e representado pela formula

■ u/^^L.-

It O

no qual cada um de R21R3, R41 R51 cifico dos compostos da formula Vlll e:

R6 e R7 e como definido acima. Um exemplo espe-

iv-"

E) Conjugados de Aminoacido de Acido Jasmonico:

Os acidos jasmonicos conjugados atraves do grupo de carboxila para os aminoacidos ocorrem por natureza (Plant Hormones, Davies PJ, ed.’ Kluwer Academic Publishers, London, 2004，pp. 618, 620). Os diversos aminoacidos de acido jasmonico tem sido sinteticamente pre- parados.

Os aminoacidos incluem glicina, alanina, valina, Ieucina e isoleucina. (Jikumaru Y. e

outros, Biosci. Biotechnol. Biochem. 68，1461-1466, 2004). Os conteijdos destas referencias estao incorporados aqui por referencia em sua totalidade, como se totalmente apresentados aqui. Todos estes conjugados podem ser empregados nos metodos da presente invengao.

Todos os estereoisomeros dos derivados de jasmonato acima sao considerados, cada um em forma de mistura ou em puro ou substancialmente pura. Os derivados de jasmonato podem ter centros assimetricos em quaisquer dos atomos. Consequentemente, os compostos podem existir em formas enantiomericas ou diastereomericas ou em misturas destes. A pre- sente invengao considera ο uso de quais racematos (isto e, misturas contendo quantidades iguais de cada enantiomeros), misturas enantiomicamente enriquecidas mixtures (isto e, mistu- ras enriquecidas para um eriantiomero), enantiomeros puros ou diastereomeros, ou quaisquer misturas destes. Os centros quirais podem ser nomeados como R ou S ou R1S ou d,D, 1，L ou d，l，D1L. Compostos compreendendo residues de aminoacido incluem residues de D- aminoacidos, L-aminoacidos, ou derivados racemicos de aminoacidos. Compostos compreen- dendo res iduos de agiicar incluem residuos de D-a?Licares, L-agiicares, ou derivados racemi- cos de agijcares. Residuos de D-agiicares, os quais aparecem por natureza, sao preferidos. Alem disso, diversos dos compostos da inven^ao contem uma ou mais Iigagdes duplas. A pre- sente invengao intencionam abranger todos os isomeros geometricos e estruturais incluindo cis, trans, isomeros E e Z, independentemente em cada ocorrencia.

Um ou mais dos compostos da invengao, podem estar presente como um sal. O termo "sal" abrange am bos sais de adigao de acido e basica, incluindo mas nao Iimitados a sais de carboxilato ou sais com amino nitrogenios, e inclui sais formados com anions organicos e inor- ganicos e cations discutidos abaixo. Alem disso, ο termo inclui sais que se formam por reag5es a base de acido padrao com grupos basicos (tais como grupos de amino) e acidos organicos ou inorganicos. Tais acidos incluem hidroclorico, hidrofluorico, trifluoroacetico, sulfijrico, fosfori- co, acetico, sucinico, citrico, Iaticoj maleico, fumarico, palmitico, colico, pam0ico, miicico, D- glutamico, D-canforico, glutarico, ftalico, tartarico, laurico, estearico, salicilico, metanossulfoni- co, benzenossulfonico, sorbico, picrico, benz0ico，cinamico，e acidos similares.

O termo "cation organico ou inorganico" se refere a contra-ions para ο anion de carboxilato de um sal de carboxilato. Os contra-ions sao escolhidos metais alcalinos e alcali terrosos, (tal como litio, sodio, potassio, bario，aluminio e calcio); amonio e mono-, di- e tri- aminas de alquila tal como trimetilamina, cicloexilamina; e os cations organicos, tais como di- benzilamonio, benzilamonio, 2-hidroxi etilamonio, bis(2-hidroxi etil)amonio, peniletilbenzilamo- nio, dibenziletilenediamonio, e cations similares. Veja, por exemplo, "Pharmaceutical Salts," Berge e outros, J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1977)，que e incorporado aqui por referenda. Outros cations abrangido pelo termo acima inclui a forma protonada de procaina, quinina e N- metilglucosamina, e formas protonadas de amirioacidos basicos tal como glicina, ornitina, histi- dina, fenilglicina, Iisina e arginina. Alem disso, qualquer forma hibridas dos compostos presen- tes formados por um acido carboxilico e um grupo de amino sao, da mesma forma, considera- dos.

A presente invengao da mesma forma inclui solvatos dos compostos da presente in- vengao e sais destes. "Solvato" sigifica uma associagao fisica de um compost。da invengao com um ou mais moleculas de solvente. Esta associagao fisica envolve graus variados de Iiga- 9§o ionica e covalerite, incluindo ligarem-se a hidrogenio. Em certos exemplos ο solvate deve ser capaz de isolamento. "Solvato" abrange ambos solvatos isolavel e fase de solugao. Exem- plos nao Iimitads de solvatos adequados incluem etanolatos, metanolatos e os similares. "Hi- drato" e um solvate no qual a molecula solvente e agua.

A presente invengao da mesma forma inclui polimorfos dos compostos da presente in- vengao e sais destes. O termo "polimorfo" se refere a um estado cristalino particular de uma substancia, ο qual pode ser caracterizado por propriedade fisicas particulares tais como difra- qao de raio-X，espectros de IR, ponto de fusao, e similares.

Agentes Quimioterapeuticos

Os agentes quimioterapeuticos adequados para uso nas combinagdes da presente in- ven?ao inclui, mas nao estao Iimitados a, agentes de alquilagao, agentes antibioticos, agentes antimetabolicos, agentes hormonais, agentes derivados de plantas, agentes anti-angiogenicos, agentes de indugao de diferencia^ao, agentes de indugao de interrupgao do crescimento celu- lar, agentes de indugao de apoptose, agentes citotoxicos, agentes afetando celulas bioenergi- cas, agentes biologicos, por exemplo, anticorpos monoclonais, inibidores de cinase e inibido- res de fatores de crescimento e seus receptores，agentes de terapia de gene, terapia da celula, por exemplo, celulas-tronco, ou qualquer combina^ao destes.

Os agentes de alquilagao sao drogas as quais prejudicam a furigao da celula por for- ma?ao de Iigagdes covalentes com grupos de fosfato, amino, carboxila e sulfidrila em molecu- Ias biologicamente importantes. Os locals mais importantes de alquilagao sao DNA, RNA e proteinas. Os agentes de alquilagao dependem de proliferagao da celula para atividade, mas nao sao fases especificas do ciclo celular. Os agentes de alquilagao adequado para uso na presente invengao incluem, mas nao estao Iimitados a, biscloroetilaminas (mostardas de nitro- genio, por exemplo, clorambucila, ciclofosfamida, ifosfamida, mecloretamina, melfalana, mos- tarda de uracila), aziridinas (por exemplo, tiotepa), sulfonatos alcone de alquila (por exemplo, bussulfano), nitrosoureias (por exemplo, BCNU1 carmustina, lomustina, estreptozocina), agen- tes de alquilagao nao classicos (por exemplo, altretamina, dacarbazina, e procarbazina), e compostos de platina (por exemplo, carboplastina e cisplatiria).

Os antibioticos antitumor tipo adriamicina intercalam DNA em sequencias guaninica- citosina e guaninica-timina, resultando em formagao e oxidagao espontanea de radiciais Iivres de oxigenio que causam a ruptura do filamento (7). Outros agentes antibioticos adequados pa- ra uso na presente invengao incluem, mas nao estao Iimitados a, antraciclinas (por exemplo, doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina e antracenodiona), mitomicina C，ble- omici门ει, dacti门omicinsi，e plicatomicina.

Os agentes antimetabolicos adequados para uso na presente invengao incluem mas nao estao Iimitados a, floxuridina, fluorouracila, metotrexato, Ieucovorina1 hidroxiurea, tioguani- nica, mercaptopurina, citarabina, pentostatina, fosfato de fludarabina, dadribina, asparaginase, e gencitabina.

Os agentes hormonais adequados para uso na presente invengao, incluem mas nao estao Iimitados a，um estrogenic), um progestegeno, um antiesterogenio, um androgenic»，um antiandrogenio, um LHRH analogo, um inibidor de aromatase, dietilestilbestrol, tamoxifeno, toremifeno, fluoximesterol, raloxifeno，bicalutamida, nilutamida, flutamida, aminoglutetimida, tetrazol, cetoconazol, acetato de gosserrelina, leuprolida, acetato de megestrol, e mifepristona.

Os agentes derivados de plantas incluem taxanos, os quais sao derivados semi- sinteticos de precursores extraido dos espinhos de plantas teixo. Estas drogas tem um novo anel de 14 membros, ο taxano. Ao contrario dos alcaloides de vinca, os quais causam separa- gao microtubular, os taxanos (por exemplo, taxol) promovem a estabilidade e montagem mi-

crotubular, por esse motivo bloqueando ο ciclo celular em mitose (7). Outros agentes derivdos de plantas include, mas nao estao Iimitados a, vincristina, vimblastina, vindesina, vinzolidina, vinorelbina, etoposida, teniposida, e docetaxel.

Os agentes biologicos adequados para uso na presente inverigao incluem, mas nao estao Iimitados a proteinas de imuno-modulagao, os anticorpos monoclonais com antigenos de tumor, genes supressores de tumor, inibidores de cinase e inibidores de fatores de crescimento e seus receptores e vacinas de cancer. Por exemplo, a proteina de imuno-modula?ao pode ser interleucina 2，interleucina 4’ interleucina 12，interferon E1, interferon D, interferon alfa, eri- tropoetina, granulocito-CSF, granulocito, macrofago-CSF, bacilo de Calmette Guerin, levamisol, ou octreotida. Alem disso, ο gene supressor de tumor pode ser DPC-4，NF-1’ NF-2，RB, p53，WT1, BRCA, ou BRCA2.

Agentes afetando as celulas bioenergicas afetando os niveis da ATP na celula e/ ou moleculas/ atividades regulando estes niveis.

Desenvolvimentos recentes tem introduzido, alem das terapias hormonais e citotoxi- cas traditional, terapias adicionais para ο tratamento de cancer. Por exemplo, muitas formas de terapia de gene sao testes clinicos ou suportando pre-clinicos. Alem disso, as metodologias estao atualmente sob desenvolvimento, que sao com base na inibigao de vasculariza^ao de tumor (angiogenese). O objetivo deste conceito e para cortar ο tumor do fornecimento de nutri- gao e oxigenio por um sistema vascular de tumor recentemente feito. Alem disso, a terapia de cancer e da mesma forma ser tentado pela indugao de diferericiagao terminal das celulas neo- plasicas. Os agentes de diferencia^ao adequados incluem acidos hidroxamicos, derivados de vitamina D e acido retinoico, hormonios de esteroide, fatores de crescimento, promoteres de tumor, e inibidores de sintese de DNA ou RNA. Da mesma forma, inibidores de histona desace- tilase sao agentes quimioterapico adequados para serem empregados na presente invengao.

Em modalidades atualmente preferidas, ο agente quimioterapico e uma nitrosoureia (por exemplo, 1,3-bis[2-cloroetil]-10-nitrosoureia (BCNU), um composto de platina (por exem- plo, cisplatina), um derivado de taxano (por exemplo, taxol ou seus derivados), um antibiotico antitumor (por exemplo, adriamicina )，ou qualquer combina^ao destes.

Inibidores de Glicolise

Como descrito acima, tem sido recentemente mostrado que as celulas sob condi95es hipoxicas sao mais sensiveis do que as celulas sob condi?5es aerobicas para agentes que inibem a glicolise, al como 2-deosi-D-glicose (2DG). Tem sido postulado que combinando tais agentes com drogas quimioterapeuticas, que objetivam as celulas aerobicas rapidamente divi- didas，devendo aumentar as eficacias globais destes tretamentos. Tem sido mostrado que a combinagao de 2DG e cisplatina e mais eficaz do que outro agente sozinho quando aplicado a varias Iinhagens de celulas que estao proliferando rapidamente in vitro. O sinergismo in vitro similar tem sido observado com a combinaQao de 2DG e adriamicina, e tem, alem disso, sido mostrado que 2DG realga significantemente os efeitos citotoxicos de agentes anticancer tipo inibidores de topoisomerase (etoposideo e camptotecina) e uma droga antibiotica (bleomicina) em Iinhagens de celulas de tumor humano estabelecido.

Por esse motivo, em uma modalidade, a presente invengao considera ο uso de um de- rivado de jasmonato em combinagao com um inbidor de glicolitico tal como 2DG, opcionalmen- te tambem em combinagao com um ou mais agentes quimioterapeuticos adicionais descritos acima.

Outros inibidores de glicolise incluem oxamato e seus derivados. Vejaj por exemplo， Hamilton E，Fennell M，Stafford DM. Acta Oncol. 1995; 34(3):429-33, cujos conteCidos estao iricorporados aqui por referenda em sua totalidade.

Mecanismo de acao e Uso Terapeutico

A presente invengao se refere a um metodo para tratar cancer em um individuo com necessidade deste, compreeridendo administrar ao individuo um derivado de jasmonato em combinagao com pelo menos um outro agente selecionado de um agente quimioterapeutico, um inibidor de glicolise e combinag5es destes, no qual ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo fornecem um efeito terapeutico.

Em outra modalidade, a presente invengao se refere a um metodo para tratar cancer em um individuo com necessidade deste, compreendendo administrar ao individuo um deriva- do de jasmonato em combinagao com pelo menos um outro agente selecionado de um agente quimioterapeutico, um inibidor de glicolise e combinag5es destes, no qual ο derivado de jasmo- nato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo fornecem um efeito terapeutico sinergico.

Em outra modalidade, a presente ΐηνβηςείο se refere ao uso de uma combinagao compreendendo um derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente selecionado de um agente quimioterapeutico, um inibidor de glicolise, para a preparagao de um medicamento para ο tratamento de cancer, no qual as primeiras e as segundas quantidades ao mesmo tempo fornecem um efeito terapeutico sinergico.

Como demonstrado aqui, os efeitos cooperativos entre MJ e diversas drogas anti- cancer foram observadas em seis Iinhagens de celulas originando-se de maior diferentes tipos de malignidades: mama, pulmao, carcinomas pancreatico e de prostata e assim como Ieucemi- a. Alem disso, MJ significantemente realga ο efeito anti-leucemico de adriamicina in vivo. Qua- tro diferentes drogas quimioterapeuticas em rotina clinica empregadas foram avaliadas. Foram escolhidas com base em seu mecanismo de a^ao que difere daquele de MJ. Sem querer Hear preso a qualquer teoria ou mecanismo particular, e contemplado que as drogas com diferentes mecanismos de agao sao combinagdes promissoras para a terapia de cancer. No entanto, ο efeito citotoxico de cada uma estas drogas e mediada, tambem indiretamente, atraves de per- turbagao mitocondrial. Deste modo, as mitocondrias servem como um ponto central da vida da celula e decisdes de morte. Sem querer ficar preso a qualquer teoria ou mecanismo particular, e proposto que as combina(j5es de drogas que afetam estas organelas, tambem diferam os mecanismos especificos, podendo unir-se a eficacia da produgao super-aditiva. Estes resulta- dos em valor IC50 das varias drogas quimioterapeuticas sendo drasticalmente inferiores na presenga de MJ, indicando na diregao do potencial de redu^ao dos efeitos colaterais indeseja- veis.

MJ tem previamente sido mostrado para agir com as celulas Ieucemicas dos pacientes

com CLL, ao mesmo tempo em que, poupa os Iinfocitos normais (1, 2, 3). Deste modo, ο MJ poderia realgar a terapia atualmente disporiivel com CLL sem causar efeitos coloterais. Alem do mais, tem previamente sido mostrado que ο MJ pode matar as celulas mutantes p53 (6) e niveis elevados de expressao celular de P-gp. Consequentemente, uma combina^ao de droga incluindo MJ deveria potencialmente ter uma vantagem no tratamento de pacientes apresen- tando resistencia a droga.

Alem disso，uma combinagao de MJ e ο inibidor de glicolise 2DG apresentou um efei- to citotoxico super-aditivo em varias celulas de cancer. Sem querer ficar preso a qualquer teoria ou mecanismo particular, e proposto que isto reflita a cooperagao entre a inibigao de ambos, fosforilagao oxidativa e glicolise como as duas maiores fontes de celulas de biosintese de ATP.

O termo "cancer" no contexto presente invengao inclui todos os tipos de neoplasma se na forma tumores solidos ou nao solidos, de todas as origens, e inclui ambas as condi^Ses malignas e pre-malignas, assim como sua metastase. As combinag5es da presente irivengao sao ativas com uma ampla faixa de canceres. As combinagSes da presente invengao sao ati- vas com uma ampla faixa de canceres, incluindo carcinomas, sarcomas, mielomas, leucemias, Iinfomas e tipos mistos de tumores. As categorias particulares de tumores sensiveis ao trata- mento incluem distijrbios linfoproliferativos，cancer de mama, cancer ovariano, cancer de pros- tata, cancer cervical, cancer endometrial, cancer osseo, cancer do figado，cancer do estomago, cancer do colon, cancer pancreatico, cancer da tiroide, cancer de cabega e pescogo, cancer do sistema nervoso central, cancer do sistema nervoso periferico, cancer de pele, cancer do rim, assim como metastases de todos acima. Os tipos particulares de tumores sensiveis ao trata- mento incluem: carcinoma hepatocelular, hematoma, hepatoblastoma, rabdomiossarcoma, carcinoma esofagico, carcinoma de tiroide, ganglioblastoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, Iipo- sarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, tumor de Ewing，leiomiossarcoma, rabdoteliosarcoma, carcinoma ductal invasivo, adenocarci- noma papilar，melanoma, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basais，ade- nocarcinoma (bem diferenciadas, moderadamente diferenciadas, pobremente diferenciado ou nao diferenciadas), carcinoma de celulas renal, hipernefroma, adenocarcinoma hipernefroide, carcinoma de ducto de bilis, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, tumor testicular, carcinoma de pulmao incluindo celula pequena, carcinoma de celulas de pulmao grande e nao pequena, carcinoma da bexiga，glioma, astrocitoma, meduloblastoma,

craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, retinoblastoma, neuroblastoma, carcinoma do co- Ion, carcinoma retal, malignidades hematopoeticas incluindo todos os tipos de Ieucemia e Iin- foma incluindo: Ieucemia mielogenosa aguda, Ieucemia mielocitica aguda, Ieucemia Iinfocitica aguda, Ieucemia mielogenosa cronica, Ieucemia Iinfocitica cronica, Ieucemia de mastocitos, mieloma mijltiplo, Iinfoma mieloide, Iinfoma de Hodgkin1 nao Iinfoma de Hodgkin.

Em particular, as combinagQes da presente irivengao sao ativas com cancer de mama,

cancer do rim, cancer do estomago, leucemia, incluindo Ieucemia lirifoblastica, carcinoma de pulmao, melanoma e cancer do colon. Em uma modalidade, ο individuo e um mamifero, prefe- rivelmente um humano. De qualquer modo, a presente invengao da mesma forma considera empregando os compostos da presente invengao para mamifero nao humano, por exemplo, em medicina veterinaria.

E para ser entendido que se os termos "tratando ou inibindo ο cancer" ou "tratando ou inibindo uma proliferagao de celula maligna (cancer)" sao empregados aqui na descrigao e nas reivindicagdes, sao pretendidos abranger formagao de tumor, tumores primaries, progressao de tumor ou metastase de tumor. O termo "inibi?ao de proliferagao" em relagao as celulas de cancer, no contexto da

presente invengao se refere a uma diminuigao em pelo menos um dos seguintes: niimero de celulas (devido a morte celular que poder ser necrotica, apoptotica ou qualquer outro tipo de morte celular ou combinagoes destes) quando comparado ao controle; diminuigao em faixas de crescimento de celulas, isto e, ρό niimero total de celulas pode aumentar, mas em um nivel inferior ou em uma faixa inferior do que ο aumento no controle; diminuigao na invasividade das celulas (como determinado, por exemplo, por ensaio de agar macio) quando comparado ao controle ate se seu niimero total nao tern mudado; progressao de um tipo de celula menos dife- renciado a um tipo de celula mais diferenciado; uma desaceleragao na transformafao neoplasi- ca; ou alternativamente a redugao da progressao das celulas de cancer de uma etapa para a proxima.

O termo "tratamento de cancer" no contexto da presente invengao inclui em pelo me- nos um dos seguintes: uma diminuigao na faixa de crescimento do cancer (isto e, ο cancer ainda cresce, mas em uma faixa mais lenta); cessagao do crescimento do crescimento cance- roso, isto e, estase do crescimento do tumor, e, em casos preferidos，ο tumor diminui ou e re- duzido no tamanho. O termo, tambem, inclui a redugao no niimero de metastases, a redugao no niimero de novas metastases formadas, a redugao da progressao do cancer de uma etapa para a outra e uma diminuigao no angiogenese induzido pelo cancer. Em mais casos preferi- dos, ο tumor e totalmente eliminado. Adicionalmente incluidos neste termo esta a prolongagao do periodo de sobrevivencia do individuo suportando ο tratamento, prolongando ο tempo de progressao das doengas, regressao do tumor, e similares. Este termo, da mesma forma, a- brange a prevengao das situag5es profilaticas ou para aqueles individuos que sao suscetiveis a redugao de um tumor. A administra^ao dos compostos da presente invengao deve reduzir a probabilidade do individuo reduzir a doenga. Em situa^oes preferidas, ο individuo a quern ο composto e administrado nao contrai a doenga.

Como empregado aqui, ο termo "administrando" se refere a por em contato com um composto da presente inven^ao. A administragao pode ser efetuadapara culturas das celulas ou tecido, ou para organismos vivos, por exemplo, humanos. Em outra modalidade, a presente invengao abrange administrar os compostos da presente invengao a um individuo humano.

Um tratamento "terapeutico" e um tratamento administrado a um individuo que exibe sinais de patologia para ο proposito de diminuigao ou de eliminagao destes sinais. Uma "quan- tidade terapeuticamente eficaz" e aquela quantidade de composto que e suficiente para forne- cer um efeito benefico ao individuo ao quail ο composto e administrado. Uma "quantidade si- nergica terapeuticamente eficaz" significa que a combinagao do regime de tratamento produz um resuIto anticancer significantemente melhor (por exemplo, interrupgao do crescimento celu- lar, apoptose，indugao de diferencia^ao, morte celular) do que os efeitos aditivos de cada cons- tituinte quando e administrado sozinho em uma dose terapeutica. A analise estatistica padrao pode ser empreganda para determinar quando os resultados sao significantemente melhores. Por exemplo, um Mann-Whitney Test ou mesmo outra analise estatistica geralmente aceita porem ser empregados.

Composicoes Farmaceuticas

Se bem que as combina?5es da presente invengao podem ser administradas sozi- nhas, e contemplado que os componentes da combinagao devem ser administrados em com- posites farmaceuticas, da mesma forma, contendo pelo menos um excipiente ou portador farmaceuticamente aceitavel. Cada um dos componentes pode ser administrado em uma com- posigao farmaceutica separada, ou a combinagao pode ser administrada em uma composigao farmaceutica.

Deste modo, em uma modalidade, a presente invengao, da mesma forma, considera

as composigoes farmaceuticas que incluem uma primeira quantidade de um derivado de jas- monato em combinagao com a segunda quantidade de pelo menos um outro agente selecio- nado de um agente quimioterapico e um inibidor de glicolise. As primeiras e segundas quanti- dades ao mesmo tempo fornecem um efeito terapeutico anti-cancer que e, em uma modalida- de, sinergico.

Em outra modalidade, a presente invengao considera a primeira composigao farma- ceutica que inclui uma primeira quantidade de um derivado de jasmonato e uma segunda com- posigao farmaceutica que inclui uma segunda quantidade de pelo menos um outro agente se- Iecionado de um agente quimioterapico e um inibidor de glicolise. As primeiras e as segundas quantidades, ao mesmo tempo, fornecem um efeito terapeutico anti-cancer que e, em uma modalidade, sinergico. Se a combinagao compreende mais do que dois componentes, e em seguida a quantidade total de derivado de jasmonato, agente quimioterapico e/ ou inibidor de glicolise fornecem um efeito terapeutico anti-cancer que e, em uma modalidade, sinergico.

As composigoes farmaceuticas da presente inven^ao podem ser formuladas para ad- ministragao por uma variedade de rotinas incluindo oral, rectal, transdermal, parenteral (subcu- tanea, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial，transdermal e intramuscular), topico, intrana- sal, ou atraves de um supositorio. Tais composig5es sao preparadas de modo bem conhecido na tecnica farmaceutica e compreeride a um irigrediente ativo, pelo menos um composto da presente Inwengao como descrito aqui acima, e um portador ou excipierite farmaceuticamerite aceitavel. O termo "farmaceuticamente aceitavel" significa aprovado por uma agenda reguIado- ra da Federal ou um estado do governo ou iistado na Farmacopeia dos Estados Unidos ou ou- tra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em hu- manos.

Durante a preparagao das composig5es farmaceuticas de acordo com a presente in- νβηςδο ο ingrediente ativo e usualmente misturado com um portador ou excipiente, os quais podem ser de material solido, semi-solido, ou liquido. As composigaos podem ser na forma de comprimidos, pilulas, capsulas, peletes, granulos, pos, lozangos，saches, selos, elixires, sus- pensdes, dispersoes, emuls5es, solu^Ses, xaropes, aerosois (como um meio solido ou em um liquido, unguentos contendo, por exemplo, ate 10% em peso do composto ativo, capsulas de gelatina macias e duras, supositorios, solug5es estereis injetaveis, e pos estereis empacotados.

Os portadores podem ser qualquer daqueles convencionalmente empregados e sao Iimitados apenas para considerag5es quimicas e fisicas, tal como solubilidade e falta de reativi- dade com ο composto da inven^ao, e pela rotina de administragao. A escolha do portador deve ser determinada pelo metodo particular empregado para administrar a composigao farmaceuti- ca. Alguns exemplos de portadores adequados incluem lactose, glucose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, feculas, goma de acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, sili- cato de calcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, agua e metilcelulose. As formulates podem adicionalmente incluir agentes de Iubrificagao tais como talco, estearato de magnesio, e oleo mineral; agentes de umectagao, tensoativos, agentes de suspensao e de emulsifica^ao; agentes conservantes tais como metil- e propilidroxibenzoatos; agentes ado^an- tes; agentes aromatizantes, corantes, agentes de tamponamento (por exemplo, acetatos, citra- tos ou fosfatos), agentes de desintegragao, agentes de umidifica?ao, agentes antibacterianos, antioxidantes (por exemplo, acido ascorbico ou bissulfeto de sodio), gentes de quelagao (por exemplo, acido etilenodiaminetetraacetico), e agentes para ο ajustamento de tonicidade tal como cloreto de sodio. Outros portadores farmaceuticos podem ser Iiquidos estereis, tais como agua e oleo, incluindo aqueles de origem sintetica ou vegetal, animal, de petroleo, tal como oleo de amendoim, oleo de soja, oleo mineral, oleo de gergelim e similares, glicois de polietile- no, glicerina, glicol de propileno ou outros solverites sinteticos. A agua e um portador preferido quando a composigao farmaceutica e administrada intravenosamente. As solugoes de salino e dextrose aquosa e solugoes de glicerol podem da mesma forma ser empregadas como porta- dores liquidos, particularmente para solugoes injetaveis.

Em uma modalidade, na composi^ao farmaceutica ο ingrediente ativo e dissolvido em qualquer portador de Iipideo aceitavel (por exemplo, acidos graxos, oleos para formar, por e- xemplo, uma micela ou um lipossoma).

Para a preparagao de composites solidas tais como comprimidos, ο ingrediente (s) ativo principal e misturado com um excipiente farmaceutico para formar uma composigao de pre-formula^ao solida coritendo uma mistura homogenea de um composto da presente inven- ?ao. Quando se referendo aquelas composigdes pre-formuladas como homogenea, e significa que ο ingrediente ativo e disperso uniformemente atraves da composigao, a fim de que a com- posi^ao possa ser facilmente sub-dividida em formas de unidade de dosagem igualmente efi- cazes tais como comprimidos, pilulas e capsulas. Esta pre-formulagao solida e em seguida sub-dividida emu ma forma de unidade de dosagem do tipo descrito acima contendo de, por exemplo, cerca de 0,1 mg a cerca de 2000 mg, de cerca de 0,1 mg a cerca de 500 mg, de cer- ca de 1 mg a cerca de 100 mg, de cerca de 100 mg a cerca de 250 mg, etc. do ingrediente (s) ativo da the presente invengao.

Qualquer metodo pode ser empregado para preparer as composites farmaceuticas. As formas de dosagem solidas podem ser preparadas por granula^ao ijmida, granulagao seca, compressao direta e similares. As formas de dosagem solidas da presente inven?ao podem ser revestidas ou misturada diferente para fornecer uma forma de dosagem permitindo a vantagem de agao prolongada. Por exemplo, ο comprimido ou pilula podem compreender uma dosagem interna e um componente de dosagem externo, ο mais recente sendo na forma de um envelo- pe sobre ο formador. Os dois components podem ser separados por uma camada enterica, os quais servem para resistir a desintegragao no estomago e permitir ο componente interno pas- sar intacto no duodeno ou para ser retardado na libera^ao. Uma variedade de materials podem ser empregados para tais revestimentos ou camadas enterica, tais materials incluem um nijme- ro de acidos polimericos e misturas de acidos polimericos com tais materials como acetato de celulose e goma-laca, alcool de cetila.

As formas Iiquidas nas quais as composites presente invengao podem ser incorpo- radas, para administragao oralmente ou por injegao, incluem solug5es aquosas, xaropes ade- quadamente aromatizados, suspensao em oleo ou aquosas, e emulsaos aromatizadas com oleos comestiveis tais como oleo de caro^o de algodao, oleo de gergelim, oleo de coco, ou oleo de amendoim, assim como elixires e veiculos farmaceuticos similares.

As composigaos para inalagao ou isolamento incluem solugoes e suspens5es em sol- ventes organicos ou aquosos farmaceuticamente aceitavel, ou misturas destes, e pos. As com- posig5es Iiquidas ou solidas podem conter excipientes adequados farmaceuticamente aceita- veis como descrito acima. Preferivelmente as composigoes sao administradas pela rotina oral ou respiratoria nasal para ο efeito local ou sistemico. As composigoes em solventes farmaceuti- camente aceitaveis preferivelmente podem ser nebulizadas pelo uso de gases internos. As solu?5es nebulizadas podem ser respiradas diretamente do dispositive de nebuliza^So ou ο dispositivo de nebulizagao pode estar Iigado a uma tenda com mascaras faciais, ou maquina de respiragao com pressao positive intermitente. A solugao, a susperisao, ou as composig5es em ρό podem ser administradas, preferivelmente oralmente ou nasalmente, de dispositivos que Iiberam a formulagao de um modo adequado.

Outra formulagao empregada nos metodos da presente invengao empregam dispositi- vos de Iiberagao transdermal ("emplastros"). Tais emplastros transdermals podem ser empre- gados para fornecer infusao continua ou descontinua dos compostos da presente invengao em quantidades controladas. A construgao e ο uso de emplastros transdermals para a Iiberagao de agentes farmaceuticos e bem conhecida na tecnica.

Ainda em outra modalidade, a composigao e preparada para administrate topica, por exemplo, como um unguento, um gel, uma pastilha ou um creme. Para administra^ao topica para as surpeficies do corpo empregando, por exemplo, cremes, geis, pastilhas, unguentos e similares, os compostos da presente invengao podem ser preparados e aplicados em um dilu- ente fisiologicamente aceitavel com ou sem ο portador farmaceutico. A presente inven^ao pode ser empregada topicamente ou transdermalmente para tratar ο cancer, por exemplo, melano- ma. Adjuvantes para as formas a base de gel ou topica podem incluir, por exemplo, carboxime- tilcelulose de sodio, poliacrilatos, polimeros de bloqueio de polioxietileno-polixipropileno, glicol polietileno e alcoois de cera de madeira.

Alternative as formulates incluem sprays nasais, formulagoes liposomals, formula- goes de Iiberagao de lentas, bombas Iiberando as drogas no corpo (incluindo bombas mecani- cas ou osmotica) formulag5es de Iiberagao controlada e tipos, como sao conhecidas na tecrii- ca.

As composigdes sao preferivelmente formuladas um uma forma de unidade de dosa- gem. O termo "formas de unidade de dosagem" se refere a unidades adequadas fisicamente discretas como dosagens unitarias para individuos humanos e outros mamiferos, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo calculado para produzir ο efeito terapeutico desejado, em associagao com um excipiente farmaceutico adequado.

Na preparagao de uma formulagao, pode ser necessario moer ο ingrediente ativo para fornecer ο tamanho de particula adequedo antes de combinar com outros ingredientes. Se ο compos to ativo e substancialmente insolijvel, ordinariamente e moido para um tamanho de particula de menos do que 200 malhas. Se ο ingrediente ativo e substancialmente soluvel em agua, ο tamanho da particula e normalmente ajustado por moagem para fornece uma distribui- qao substancialmente uniforme na formulagao, por exemplo, cerca de 40 malhas,

POde ser desejavel administrar a composigao farmaceutica da invengao Iocalmente para a area com necessidade de tratamento, pode ser obtidos por, por exemplo, e nao por meio de limitagao, infusao local durante a cirurgia , infusao para ο figado atraves de vasos san- giiineos para alimenta^ao com ou sem cirurgia, aplicagao topica, por exemplo, em conjungao com um adorno enrolado apos a cirurgia, por injegao, por meios de um cateter, por meio de um supositorio, ou por meio de um implant, ο referido implante foi de material poroso, nao poroso, ou gelatinoso. De acordo com algumas modalidades preferidas, a administragao pode ser por injegao direta, por exemplo, atraves de uma seringa, no local de um tumor ou neoplasica ou tecido pre-neoplasico.

Os compostos podem da mesma forma ser administrados por qualquer rotina conve- niente, por exemplo por infusao ou injegao de bolo, por absorgao atraves de revestimentos epi- teliais (por exemplo, mucosa oral, retal e mucosa intestinal etc.), e pode ser administrados jun- tos com outros agentes terapeuticamente ativos. E preferido que a administragao seja Iocaliza- da, mas pode ser sistemica. Alem disso, pode ser desejavel introduzir as composig5es farma- ceuticas da invengao no sisteme nervoso central por qualquer rotina, incluindo injegao intraven- tricular e intratecal; injegao intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, Iigados a um reservatorio. A administragao pulmonar pode da mesma forma ser empregada, por exemplo, por uso de um inalador or nebulizador, e formulada com um agente de aerossolizagao.

Um composto da presente invengao pode serliberado em uma Iiberagao imediata ou em um sistema de Iiberagao controlada. Em uma odalidade, uma bomba de infusao pode ser empregada para administrar um composto da invengao, tal como um que e empregado para Iibera^ao por quimioterapia para orgaos ou tumores (veja, Buchwald e outros, 1980，Surgery 88: 507; Saudek e outros, 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). Em uma forma preferida, um com- posto da invengao e administrado em combinagao com um implante polimerico biocompativel, biodegradavel, os qua is Iiberam os compostos durane um periodo controlado de tempo em um local selecionado. Os exemplos de materials polimerico preferidos incluem polianidridos, polior- toesteres, acido poliglicolico, acido polilatico, acetato de vinila polietileno, copolimeros e combi- na?5es destes (Veja, Medical applications of controlled release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Fla.). Ainda em outra modalidade, um sistema de Iiberagao controlada possa ser colocado na proximidade do alvo terapeutico, deste modo exigindo aperias uma fra- gao da dose sistemica.

Alem disso, de vez em quando, as composi?5es farmaceuticas podem ser formuladas para administragao parenteral (injegao subcutanea, intravenosa, intraarterial, transdermal, in- traperitoneal ou intramuscular) e pode incluir solugSes de injegao estereis isotonicas, aquosas e nao aquosas, as quais podem conter ariti-oxidantes, tamp5es, bacteriostatos, e solutos que rendem a formulagao isotonica com ο sangue do recipiente pretendido, e as suspensdes este-

rieis aquosas e nao aquosas que incluem os agentes de suspensao, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes, e preservatives. Os oleos como oleos sinteticos ou, vegetais, ani- mals ou de petroleo, e sabdes tais como metal de alcali graxo, amonio, e sais de trietanolami- na，e detergentes adequados podem da mesma forma ser empregados para administra^ao parenteral. As formulagoes acima podem, da mesma forma, ser empregadas paor injegao dire- ta intratumoral. Ainda, a fim de minimizar ou eliminar a irritagao no local da injegao, as compo- sites podem conter um ou mais tensoativos nao ionico. Os tensoativos adequados incluem esteres acido graxo de sorbitano polietileno, tal como sorbitano monooleato e peso molecular elevado aduzi de oxido de etileno com uma base hidrofobica, formada pela condensa^ao de oxido de propileno com glicol propileno. As formulag5es parenterals podem ser apresentadas em recipente selado de dose ύ-

nica ou miiltiplas doses, tal como ampolas e frascos, e podem ser armazenada em uma condi- gao de secado por congelamento (IiofiIizado) exigindo apenas a adigao de um portador Iiquido esteril, por exemplo, agua, para inje95es, imediatamente antes do uso. As suspens5es e solu- g5es para injegao extemporanea podem ser preparadas de pos esterieis, granulos, e compri- midos da especie previamente descrita e conhecida na tecnica.

Alternativamente, as combinag5es da presente invengao podem ser empregadas em hemodialise tal como Ieucoforese e outros metodos relacionados, por exemplo, ο sangue e tirado do paciente por uma variedade de metodos tal como dialise atraves de uma coluna/ membrana de fibra oca, cartucho etc, e tratada com os derivados de jasmonato e/ ou droga quimioterapeutica e ou inibidor de glicolise Ex-vivo, e restituido ao paciente seguinte ao trata- mento. Tais metodos de tratamento sao bem conhecidos e descritos na tecnica. Veja, por e- xemplo, Kolho e outros (J. Med. Virol. 1993, 40(4): 318-21); Ting e outros (Transplantation, 1978, 25(1): 31-3); cujos conteiidos estao aqui incorporados por referenda em sua totalidade.

Pianos de Dosagem e Doses O tratamento com ο derivado de jasmonato e pelo menos outro agente quimioterapico

e/ ou inibidor de anti-glicolise pode ocorrer sequencialmente em qualquer sequencia, simulta- neamente ou uma combinagao destes. Por exemplo, a administragao de um derivado de jas- monato pode ocorrer antes de, apos ou ao mesmo tempo que a administragao do agente qui- mioterapico e/ ou ο inibidor de glicolise. Por exemplo, um periodo do tratamento total pode ser decidido para ο derivado de jasmonato. O agente (s) adicional (agente quimioterapico e/ ou ο inibidor de glicolise) pode ser administrado antes do inicio do tratamento com ο derivado de jasmonato ou seguindo ο tratamento com ο derivado de jasmonato. Alem disso, ο agente (s) adicional pode ser administrado durante ο periodo de adminsitra?ao do derivado de jasmona- tomas nao necessita ocorrer durante ο periodo inteiro de tratamento de derivado de jasmonato. Em outra modalidade, ο regime de tratamento inclui pre-tretamento com um agente, ou ο deri- vado de jasmonato ou ο agente quimioterapeutico/ inibidor de glicolise, seguida pela adigao do

outro agente ou agentes. As seqiiencias alternadas de administragao sao, da mesma forma, consideradas. A administragao alternada inclui a administragao de um derivado de jasmonato, um agente quimioterapico e/ ou inibidor de glicolise em seqiiencias alternadas, por exemplo, derivado de jasmonato, seguida pelo agente quimioterapeutico, seguido por inibidor de glicoli- se, seguido por derivado de jasmonato, etc.

A quantidade de um composto da invengao (isto e, derivado de jasmonato/ agente

quimioterapeutico/ inibidor de glicolise) que deve ser eficaz no tratamento de uma condigao ou doenga particular, incluirido cancer, deve depender da natureza do distCirbio ou condigao, e pode ser determinada pelas tecnicas clinicas padrao. Alem disso, os ensaios in vitro podem opcionalmente ser empregados para ajudar a identificar as faixas de dosagem ideais. A dose precisa a ser empregada na formulagao deve da mesma forma depender da rotina da adminis- tragao, e a seriedade da doenga ou distiirbio, e deveria ser decidido de acordo com ο julga- mento do medico e as circunstancias de cada paciente. Uma dosagem preferida deve ser na faixa de 0,01-1000 mg/kg do peso do corpo, 0’1mg/kg a 100 mg/kg, 1 mg/kg a 100mg/kg, 10 mg/kg a 75 mg/kg, 0,1-1 mg/kg, etc. Os exemplos (nao limitaos) de quantidades do derivado de jasmonato/ agente quimioterapeutico/ inibidor de glicolise incluem 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 75 mg/kg e 100 mg/kg. Alternativamente, as quantidades administradas podem ser medidas e expresses como molari- dade do composto administrado. Por meio de ilustragao apenas e nao limitagao, um derivado de jasmonato (por exemplo, metil jasmonato) pode ser administrado em uma faixa de 0,1-10 mM, por exemplo, 0,1, 0,25, 0,5, 1 e 2 mM. Alternativamente, as quantidades administradas podem ser medidas e expresses como mg/ml, pg/ml, ou ng/ml. Por meio de ilustragao apenas e na limitagao, um agente quimioterapico pode ser administrado em uma quantidade de 1 ng/ml a 100 mg/ml, por exemplo 1-1000 ng/ml, 1-100 ng/ml, 1-1000 "g/ml，1-100 pg/ml, 1000 mg/ml, 1-100 mg/ml, etc. As doses eficazes podem ser extrapoladas de curvas de resposta a dose derivadas de sistemas ou bioensaios de teste de modelo animal ou in vitro. Quando um efeito sinergico e observado, a dose global de cada um dos componentes pode ser inferior, deste modo os efeitos colaterais experimentado pelo individuo pode ser significantemente inferior, ao mesmo tempo em que um efeito quimoterapeutico suficiente e, no entanto，obtido. Como de- monstrado aqui na segao Experimental, ο metil jasmonato derivado de jasmonato, em combi- na^ao com varios agentes quimioterapeuticos (adriamicina, taxol, BCNU e cisplatina) apresen- tam efeitos sinergicos anti-proliferativos em varias faixas de concentragao, in-vitro e in-vivo.

Em uma modalidade, a terapia por combinagao reduz a quantidade de cada um dos componentes por um fator de 2，isto e, cada componente e fornecido na metada da dose quand comparado com terapia de agente Cinico, e ainda obtem ο mesmo efeito terapeutico ou similar em outra modalidade, a terapia por combina^ao reduz a quantidade de cada um dos seus componentes por um fator de 5，10，20, 50 ou 100. Como demonstrado aqui, ο IC50 de

agentes quimioterapeuticos como agentes anti-proliferativa em varias celulas de cancer sao reduzidas quando comparadas ao IC 50 do agente quimioterapeutico, quando administrados sozinhos.

O piano de administragao deve depender de diversos fatores tais como ο cancer sen- do tratado, a severidade e a progressao, a populagao do paciente, idade, peso etc. Por exem- plo, as composigoes da invengao podem ser empregadas uma vez ao dia, duas vezes ao dia, tres vezes ao dia, um vez por semana ou uma vez ao mes. Alem disso, a administragao pode ser continua, isto e, todos os dias, ou intermitentemente. Os termos "intermitente" ou "intermi- tentemente" como empregados aqui significam interromper e iniciar em cada intervalos regula- res ou irregulares. Por exemplo, administragao intermitente podem ser administragao de uma a seis dias por semana ou pode significar admiriistra^ao em ciclos (por exemplo, administragao diaria de duas a oito semanas consecutivas, e em seguida um periodo de repouso com nao administragao por ate uma semana) ou pode significar administra^ao administraQao em dias alternados. Os diferentes componentes da combinagao podem, independentemente de outro, seguir diferentes pianos de dosagem.

Os exemplos seguintes estao presentes, a fim de, ilustrar mais totalmente certas mo- dalidades da invengao. O caminho nao deve, de qualquer modo, ser construido como Iimitagao ao amplo escopo da inven^ao. Alguem versado na tecnica pode facilmente planejar muitos variagdes e modifica?5es dos principios descritos aqui se afastar-se do escopo da invengao.

Secao de Detalhes Experimentais

Exemplo 1 - Materials e Metodos

Quimicos:

Metil jasmonato [metil 3-oxo-2-(2-pentenil) acido ciclopentaneacetico], 2-Deosi-D- glicose (2DG), 1,3-bis{2-Cloroetil}-1-nitrosoureia (BCNU) e cis dicloreto de Diammineplatina (II) (cisplatina) foram comprados de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemanha. A adria- micina foi comprada de Pharmacia Italia S.p.A. e Taxol de MeadJohnson, USA. O Metil Jasmo- nato foi dissolvido em etanol absolute para produzir uma solugao de materia-prima de 500 mM. Ainda1 as dilutes de MJ e diluigdes das drogas citotoxicas foram realizadas em meio de culti- vo. A concentragao final de etanol em cultures nao excedeu 0,6%. Para experimentos in vivo, a adriamicina foi dissolvida em Salino de Tampao de Fosfato.

Linhagens de celulas tumor:

CT26 e um carcinoma do colon de murine. DA-3 e um adenocarcinoma mamario de murino. TRAMP C1 e um adenocarcinoma de prostata de murino. MCF7 e um adenocarcinoma de mama humano. M 1A PaCa-2 e um carcinoma pancreatico humano. D122 e um carcinoma de pulmao de murino. BCL1 e uma leukemia de celula B de murino. Todas as Iinhagens de celulas foram compradas de ATCC (Rockville，MD, USA), exceto para DA3 e D122 as quais foram gentilmente fornecidas por Prof. Y. Keisari (Tel-Aviv University, Israel).

As Iinhagens de celulas foram encontradas negatives para infecgao de micoplasma quando revelado pelo kit 25T de detecgao de micoplasma VenorGem (Minerva Biolabs, Berlin, Alemanha).

As celulas foram mantidas em uma atmosfera umidificada, a 37 0C com 5% de CO2. As celulas CT26 e DA-3 foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Biological Industries, Beit-Haemek1 Israel)，suplementadas com 10% de FCS1 2 mM de L-glutamiria, 100 U ml"1 de penicilina，100 "g ml"1 de estreptomicina, 1 mM de piruvato de sodio e diluigao em 1:100 de aminoacidos nao essenciais (todos comprados de Biological Industries, Israel).

As celulas MCF7, MIA PaCa-2 e BCL1 foram mantidas em meio RPMI-1640 (Biologi- cal Industries，Israel) suplementadas com 10% de FCSj 2 mM de L-glutamina, 100 U ml"1 de penicilina e 100 /yg ml"1 de estreptomicina.

As celulas TRAMP C 1 foram aumentadas em meio de Eagle modificadas por Dulbec- co, suplementadas com 10% de FCS, 2 mM de L-glutamina, 100 U ml"1 de penicilina, 100 "g ml"1 de estreptomicina, 1 mM de piruvato de sodio, diluigao de 1:100 de aminoacidos nao es- senciais, 5 pg/ml de insulina bovina e 10 nM de deidroisoandrosterona. As celulas BCL1, as quais sao iricapazes de aumentar-se continuamente en cuktura,

foram mantidas em camundongos BALB/c. O sangue foi empregado na veia da cauda dos ca- mundongos BCL1 sofrendo 23-28 dias pos-irioculagao, e esvaziado das celulas vermelhas do sangue (RBC) empregando tampao de Iise RBC (Sigma-Aldrich). As celulas Ieucemicas purifi- cadas foram empregadas para experimentos in vitro e in vivo. Ensaio de citotoxicidade:

Todas as celulas (exceto para BCL1) foram colocadas em placas de micro-titulo de 96 cavidades (Corning) em uma densidade de 2* 103 celulas por cavidade e foram deixadas para aderir antes do tratamento. As celulas BCL1 foram semeadas em uma densidade de 20* 104 celulas por cavaidade. As celulas foram expostas ao MJ, drogas citotoxicas, 2DG ou combina- goes em diferentes concentragdes durante 24 horas. Drogas citotoxicas e 2DG foram adiciona- das 1 hora da adig§o de MJ.

A inibi^ao de proliferagao da celula foi determinada pela CeIITiter 96 Aqueous Non- Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, Wl1 USA). Com a conclusao de um experimento fornecido, 20 μ\ de uma mistura (20:1) de MTS (um composto de tetrazolio, em uma concentragao final de 333 "g/ml) + metossulfato de fenazina em uma concentra^ao de 25 //m) foram adictonado a cada cavidade na placa de 96 cavidades durante 1 hora a 37 °C. Dei- xada para ο desenvolvimento da reagao em que a desidrogenases reduz a MTS em celulas metabolicamente ativas. Uma vez que as celulas nao foram Iavadas antes da adi^So de MTS, nao foram observados problemas com celulas potencialmente Iigeiramente aderente ou nao aderente. O produto de formazana MTS soliivel em 490 nm de comprimento de onda foi medi- do com Ieitora CERES 900 HDi ELISA (Bio-Tek Instruments, Highland Park, VT, USA). A den- sidade ideal e diretamente proporcional ao nijmero de celulas vivas em cultura. A citotoxicidade (%) foi calculada do seguinte modo: [(absorvencia de celulas de controle - absorvencia de celu- Ias tratados com a droga)/ absorvencia de celulas de controle] χ 100.

Estudo in vivo:

Os camundongos machos Balb/c (7-8 semanas de idade) foram obtidos da colonia de criagao de Tel-Aviv University, Israel. A experimentagao e ο cuidado de animais foram realiza- dos de acordo com diretrizes de Tel-Aviv University e aprovados pelo emprego de animal insti- tutional e comissao assistencial. Os camundongos foram guardados em gaiolas sob alimenta- ?ao padrao e condigdes de armazenamento durante os experimentos.

As celulas 2 χ 104 BCL1, recentemente extraidas dos camundongos BALB/c sofrendo de leucemia, foram inoculada intraperitonealmente (intra-peritoneal) nos camundongos em 100 μ\ de PBS para produzir ο aumento do tumor. Metil jasmonato em 60 mg/kg foi administrado para animais 5 vezes por semana, por dia，para 4 semanas, iniciando um dia apos a inoculagao da celula. Esta dose de MJ foi encontrado para ser tolerado por animais em experimentos pre- liminares. O MJ foi dissolvido em uma formulagao de lipideo, Lipofundin (B. Braun Melsungen, Melsungen, Alemanha). A adriamicina foi fornecida aos camundongos duas vezes, em 7 e 14 dias，em 4 mg/kg, intra-peritoneal. Os camundongos de controle foram tratados com ο veiculo apenas. A sobrevivencia dos camundongos foi monitorada diariamente.

Analise estatistico

A significancia estatistico em experimentos in vitro foi avaliada empregando ο teste t de Student de dois rabos. P<0，05 foi considerado estatisticamente significante. As curves da sobrevivencia (teste de Kaplan-Meier) e analise estatistica (teste de Mantel-Cox) foram realiza- dos empregando software Statistical.

Exemplo 2: Efeito citotoxico de MJ com relagao a Inhagens de celulas de tumor in vitro

A atividade citotoxica de MJ foi testada in vitro com Iinhagem de celula com 6 aderen- tes e 1 Iinhagem de celulas de camundongo ex vivo. Cada Iinhagem de celulas foi exposta ao MJ durante 24 horas em concentrates variando de 0,1 mM a 2 mM e a citotoxicidade foi de- terminada como descrito nos Metodos. Os valores IC50 sao resumidos na Tabela 1. Comoo pode ser observado na figura 1，ο MJ exercitou os efeitos citotoxicos em concentra^des em ou acima de 0,25 mM. Todas as Iinhagens de celulas respondidas em um estilo dependente da dose para ο MJ.

Tabela 1: IC50 de MJ em diferente Iinhagens de celulas

Valores de IC50 MJ (mM) D122 1,22 ±0,06 DA-3 1,91 ±0,08 CT26 2,59 ±0,12 TRAMP C1 2,94 ±0,13 MIA PaCA-2 1’46±0’13 MCF7 1，49±0，06 BCL1 0,56 ± 0,09

Exemplo 3: Efeito citotoxico de tratamento combinado com MJ e drogas quimotera- peuticas em Iinhagens de celulas de carcinoma in vitro

O efeito cooperativo de MJ com drogas quimioterapeuticas tradicionais foi investigado. As agentes anticancer sao raramente empregados como monoterapias. A quimioterapia eficaz usualmente depende da combina^ao adequada e eficaz de dois ou mais agentes. Quatro dro- gas com diferente modos de agao foram selecionadas. BCNU, cisplatina, taxol e adriamicina foram avaliado para cooperatividade em combinagao com uma concentragao fixa de MJ em 7 Iinhagens de celulas. A concentragao de MJ foi escolhida de acordo com os dados de resposta a dose (Figura 1) tal que a citotoxicidade de MJ nao excedera 40%. A interagao entre ο MJ e outro agente foi considerada cooperativo (super aditivo)

quando a diferenga entre a citotoxicidade na presenga de ambas as drogas juntas e a soma de das citotoxidades de cada droga administrada separadamente (aditividade esperada no grafi- co), produzindo um pV<0,05. O sumario destes experimentos e apresentado ria tabela 2. Como pode ser observado, ο MJ nao exibe atividade cooperativa com quaisquer das 4 drogas em celulas CT26, ao mesmo tempo em que em outras Iinhagens de celulas um efeito cooperativo de MJ foi observado com uma ou mais drogas quimioterapeuticas.

DA-3 D122 CT26 MIA PaCA-2 MCF7 TRAMP C1 BCL1 Cisplatina - - - + - + - Adriamicina - - - - - - + BCNU - - - + - - + Taxol + + - - + + -

Tabela 2: Sumario de experimentos avaliando as combinagdes entre ο MJ e as varias drogas quimioterapeuticas.

+ combinagdes de produgao, em pelo as mesmas concentragoes, efeito cooperativo Como mostra na figura 2A, as celulas Mia PaCa-2 exibem efeitos cooperativos fortes

com BCNU em todas as concentragdes testadas (1-25 [tg/m1), apesar de que a cooperagao com cisplatina e exibida em baixas concentragdes de cisplatina (1 e 2,5 /yg/ml). O IC50 de BCNU por si so e acima de 25 /yg/ml ao mesmo tempo em que aquele da combinagao e menor do que 1 /vg/ml.

Em celulas MCF7 (figura 2B) ο MJ realga a capacidade citotoxica de taxol quando

combinado com 2,5 /yg/ml de taxol, apesar de que as combina?0es em outras concentrates sao aditivas.

Em celulas DA-3 (figura 2C), um efeito cooperativo de MJ com taxol em 1, 2,5 e 5

//g/ml e observado, ao mesmo tempo em que em 10 //g/ml ο efeito e aditivo. O IC50 de taxol riesta combinagao e reduzido para 2,5 /yg/ml apesar de que ο IC50 de taxol sozinho e de 9 /yg/ml. A cooperagao muito forte de taxol e MJ pode ser observada em celulas D122 (figura 2D) em todas as concentragoes. O IC50 de taxol sozinho neste sistema experimental e de 8,2 /yg/ml, mas e reduzido para menos do que 1 "g/ml na presenga de MJ.

A cooperagao de taxol com MJ e mostrada na figura 2E em celulas TRAMP C1: em

totas as concentrates testadas (1-50 /vg/ml) ο efeito combinado em celulas TRAMP C1 e sig- nificantemente mais elevado do que a aditividade esperada. O IC 50 de taxol para as celulas TRAMP C1 e de 38 /yg/ml. Este valor e diminuido por tratamento combinado com MJ a 2 /yg/ml· A cisplatina da mesma forma exibiu cooperagao com taxol em celulas TRAMP C1 em concentrag5es de 1 e 2,5 "g/ml.

Exemplo 4: Efeito citotoxico de MJ com relagao as celulas BCL1 in vitro A citotoxicidade de MJ com relagao as celulas BCL1 as quais foram recentemente ex- traidas dos camundongos sofrendo de Ieucemia BCL1 foi examinada (figura 1). Estas celulas foram encontrado por serem mais sensiveis ao MJ (IC50 = 0,56). Alem disso, as celulas BCL1 sao consideradas com um modelo de Ieucemia de celula B humana e ο MJ matou efetivamente as clulas Ieucemicas recentemente retirada do sangue dos pacientes com CLL (2,3). Conse- quentemente, ο efeito cooperativo possivel de MJ com drogas quimioterapeuticas nestas celu- las primparias de tumor foi avaliado. A concentragao de MJ escolhida nestes experimentos (0,1 mM) foi muito mais baixo do que em experimentos com celulas de carcinoma devido a elevada sensibilidade das celulas BCL1. O efeito nao cooperativo de MJ com cisplatina e taxol foi ob- servado. De qualquer modo, com pode ser observado na figura 3 e com e resumido na Tabela 2，existe cooperagao entre MJ e BCNU em 2,5 e 5 /yg/ml (pV<0,05) e adriamicina em 10 e 25 ng/ml. Em outras concentra?5es um efeito aditivo foi observado.

Exemplo 5: Combinagao de MJ e adriamicina e siriergico com BCL1 in vivo Uma vez que adriamicina e empregada para tratamento de leucemia, foi escolhida pa-

ra um experimento avaliando uma combinagao com MJ in vivo. Os camundongos BALB/c fo- ram injetados intra-peritoneal com 104 recentemente extraido de celulas BCL1 e tratados com combinagao de adriamicina e MJ durante 4 semanas. A dose de adriamicina foi escolhida com base em experimentos previos in vivo, isto e, em um nivel nao toxico que exibe um efeito mi- nimo de cura. O tratamento com MJ iniciado um dia apos injegao de BCL1. O MJ foi admiriis- trado todos os dias a 60 mg/kg por injegao intravenosa, apesar de que a adriamicina foi injeta- da duas vezes: em 7 dias e em 14 dias. Como pode ser observado na figura 4, a sobrevivencia de camundongos tratados com MJ + ADR e significantemente prolongada (pV =0,028) versus camundongos tratados por MJ ou ADR sozinhos. Deste modo, a cooperagao entre MJ e ADR nao pode ser observada apenas in vitro, mas da mesma forma in vivo.

Exemplo 6: Efeitos citotoxico de tratamento combinado com MJ e 2DG em diferentes

Iinhagens de celulas in vitro Os requerentes da presente invengao tem recentemente mostrado que a inibigao de glicolise por 2DG em Iinfoma de celulas B celulas 29M4.1 realgou ο efeito de MJ em niveis de ATP, produzindo um deplegao dratica de niveis da ATP na celula que foi significantemente mais fortes do que ο efeito causado por MJ sozinho (6). Por esse motivo, ο efeito combinado possivel de MJ com 2DG em viabilidade celular foi examiriado. Para este proposito, quatro Ii- nhagens de celulas foram exposta as diferentes concentragdes de MJ com uma concentragao constante de 2DG. Os resultados deste experimento sao resumidos na figura 5. Como mostra, 2 DG em 0,5 mM significantemente realgou a citotoxicidade de MJ em celulas CT26 e D122 em cada uma das concnetrag5es de MJ (pV<0,05), apesar de que nas celulas MCF7 ο efeito foi significante apenas em 0,5 mM de MJ e aditivo em outras concentragdes. Nenhum efeito coo- perativo foi observado nas celulas DA-3.

Na conclusao, ο agente MJ mitocondriotoxico anti-cancer pode cooperar com varias drogas quimioterapeuticas comuns，assim como um inibidor de glicolise, ambas in vitro e in vivo. Estes dados constituem uma fundagao para ο potencial ο uso clinico de MJ em combina- goes de drogas, possivelmente da mesma forma com tumores resistentes a droga.

Ao mesmo tempo em que certas modalidades da invengao tem sido ilustradas e des- critas, deve ser claro que a invengao nao esta Iimitada as modalidades descritas aqui. Modifi- ca^oes numerosas, mudan^as, varia?5es, substitui?5es e equivalentes deve ser evidentes para aqueles versados na tecnica sem afastar-se do espirito e escopo da presente invengao como descrito pela reivindica?5es, que seguem.

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Claims

1. Metodo1 CARACTERIZADO pelo fato de que trata cancer em um individuo com ne- cessidade deste, compreenderido administrar ao individuo um derivado de jasmonato em com- bina?ao com pelo menos um outro agente selecionado do grupo consistido de um nitrosourea， um composto de platina, um derivado de taxano, um antibiotico antitumor e um inibidor de gli- colise, no qual ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo for- necendo um efeito terapeutico sinergico.

2. Metodo, CARACTERIZADO pelo fato de que inibe a proliferagao de celula de can- cer, compreenderido contatar uma celula de cancer com um derivado de jasmonato em combi- nagao com pelo menos um outro agente selecionado do grupo consistido de uma nitrosoureia, um composto de platina, um derivado de taxano, um antibiotico antitumor e um inibidor de gli- colise, no qual ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo for- necendo um efeito sinergico anti-proliferativo.

3. Metodo, de acordo com a reivindicaQao 1 ou 2，CARACTERIZADO pelo fato de que ο derivado de jasmonato e metil jasmonato .

4. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que ο derivado de jasmonato e um composto representado pela formula: O

5. Metodo de acordo com a reivindicagao 1 ou 2，CARACTERIZADO pelo fato de que ο derivado de jasmonato e um composto representado pela formula: O

6. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que ο derivado de jasmonato e um composto represeritado pela formula 9: O

7. Metodo, de acordo com a reivindica9ao 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a nitrosoureia e 1,3-bis [2-cloroetil] -10-nitroso-ureia (BCNU).

8. Metodo, de acordo com a reivindica9ao 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que ο composto de platina e cisplatina.

9. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1 ou 2’ CARACTERIZADO pelo fato de que ο derivado de taxano e taxol.

10. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que ο antibiotico antitumor e adriamicina.

11 .Metodo de acordo com a reivindicagao 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um outro agente e um inibidor de giicolise.

12. Metodo, de acordo com a reivindicagao 11, CARACTERIZADO pelo fato de que ο inibidor de giicolise e 2-deosi-D-glicose (2DG).

13. Metodo, de acordo com a reivindicagao 3’ CARACTERIZADO pelo fato de que ο agente quimioterapico e selecionado do grupo consistido de 1,3-bis [2-cloroetil]-10-nitrosoureia (BCNU), cisplatina, taxol e adriamicina.

14. Metodo, de acordo com a reivindicagao 3, CARACTERIZADO pelo fato de que ο inibidor de giicolise e 2-deosi-D-glicose (2DG).

15. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ο individuo e um humano.

16. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente sao administrados na mesma composi- gao farmaceutica.

17. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente sao administrados em composigoes far- maceuticas separadas, simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer seqiiencia .

18. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que ο cancer e um carcinoma, um sarcoma ou uma leucemia.

19. Metodo, de acordo com a reivindicagao 18, CARACTERIZADO pelo fato de que ο carcinoma e carcinoma de mama, carcinoma de pulmao, carcinoma do colon, carcinoma de prostata ou carcinoma pancreatico.

20. Metodo1 de acordo com a reivindica^ao 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que ο cancer e um adenocarcinoma mamario, ο derivado de jasmonato e metil jasmonato, e pelo menos um outro agente e taxol.

21. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que ο cancer e carcinoma de pulmao, ο derivado de jasmonato e metil jasmonato, e pelo me- nos um outro agente e taxol.

22. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1 ou 2, CARATERIZADO pelo fato de que ο cancer e carcinoma pancreatico, ο derivado de jasmonato e metil jasmonato, e pelo menos um outro agente e cisplatina ou BCNU.

23. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1 ou 2，CARACTERIZADO pelo fato de que ο c§ncer e adenocarcinoma mama, ο derivado de jasmonato e metil jasmonato，e pelo menos um outro agente e taxol.

24. Metodo, de acordo com a reivindica^So 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que ο cancer e adenocarcinoma de prostata, ο derivado de jasmonato e metil jasmonato, e pelo menos um outro agente e cisplatina ou taxol.

25. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1 ou 2，CARACTERIZADO pelo fato de que ο cancer e leucemia de eelulas B, ο derivado de jasmonato e metil jasmonato, e pelo me- nos um outro agente e adriamicina ou BCNU.

26. Metodo, de acordo com a reivindicagao 1 ou 2，CARACTERIZADO pelo fato de que ο cancer e carcinoma do colon, carcinoma de pulmao ou adenocarcinoma mama, ο deri- vado de jasmonato e metil jasmonato, e pelo menos um outro agente e 2DG.

27. Composigao farmaceutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um derivado de jasmonato em combina^ao com pelo menos um outro agente selecionado do gru- po consistido de uma nitrosoureia, um composto de platina, um derivado de taxano, um antibio- tico antitumor e um inibidor de glicolise, na qual a quantidade coletiva de derivado de jasmona- to e pelo menos um outro agente fornece um efeito terapeutico sinergico anti-cancer.

28. Composi^ao farmaceutica, de acordo com a reivindicagao 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a composi^ao esta em uma forma adequada para administragao oral，adminis- tragao intravenosa por injegao, administragao topica, administragao por inalagao, ou adminis- tragao atraves de um supositorio.

29. Uso de um derivado de jasmonato em combinagao com pelo menos um outro a- gente selecionado do grupo consistido de uma nitrosoureia, um composto de platina, um deri- vado de taxano, um antibiotico antitumor e um inibidor de glicolise, na preparagao de um medi- camento para ο tratamento de cancer, CARACTERIZADO pelo fato de que ο derivado de jas- monato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo fornecendo um efeito terapeutico si- nergico.

30. Metodo, CARACTERIZADO pelo fato de que para tratar cancer em um individuo com necessidade deste, compreendendo administrar ao individuo um derivado de jasmonato em combinagao com pelo menos um outro agente selecionado de um agente quimioterapico e um inibidor de glicolise, no qual ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo fornecendo um efeito terapeutico sinergico.

31. Metodo, CARACTERIZADO pelo fato de que inibe uma proliferagao de celula de cancer, compreendendo contatar uma celula de cancer com um derivado de jasmonato em combinagao com pelo menos um outro agente selecionado de um agente quimioterapico e um inibidor de glicolise, no qual ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo fornecendo a efeito sinergico anti-proliferativo.

32. Metodo, de acordo cm a reivindica^ao 30 ou 31, CARACTERIZADO pelo fato de que ο agente quimioterapico e selecionado do grupo consistido de um agente de alquilagao, um agente antibiotico, um agente antimetabolico, um agente hormonal, um agente derivado de vegetal, um agente anti-angiogenico, um agente de indugao de diferenciagao, agente de indu- gao por interrupgao de crescimento celular, um agente de indugao de apoptose, um agente citotoxico, um agente biologico, um agente de terapia de gene, e qualquer combinagao destes.

33. Metodo, de acordo com a reivindicagao 30 ou 31，CARACTERIZADO pelo fato de que ο derivado de jasmonato e metil jasmonato.

34. Derivado de jasmonato em combinagao com pelo menos um outro agente selecio- nado do grupo consistido de uma nitrosoureia, um composto de platina, um derivado de taxano, um antibiotico antitumor e um inibidor de glicolise, CARACTERIZADO pelo fato de tratar can- cer, onde ο derivado de jasmonato e pelo menos um outro agente ao mesmo tempo fornecen- do um efeito terapeutico sinergico.