JP2021070632A - 癌の予防または治療剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】２種類の抗癌剤の併用により優れた抗癌効果が得られ、かつ副作用の少ない新たな抗癌剤併用療法の提供。【解決手段】パノビノスタット又はその塩と、チューブリン阻害剤とを組み合わせてなる、相乗的に優れた癌の予防または治療剤。単独投与では十分な効果を示さない種々の固形癌細胞に対する増殖抑制効果が得られる。これら２種類の成分をリポソーム中に内包させることにより、溶解性の異なる２成分を含有するリポソーム製剤を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は癌の予防または治療剤に関する。
パノビノスタットは、非選択的ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の１種であり、再発または難治性の多発性骨髄腫の治療薬として用いられている（非特許文献１）。ＨＤＡＣ阻害剤であるパノビノスタットは、遺伝子の転写や細胞の分化を促進する作用を有する独特な抗癌剤であり、エイズ治療薬としても注目を集めている。ところで、ＨＤＡＣ阻害剤としてボリノスタットも知られているが、ボリノスタットは皮膚Ｔ細胞性リンパ腫にのみ治療効果が認められているにすぎない。
一方、ビンクリスチンに代表されるチューブリン阻害剤は、微小管の重合反応を阻害することにより、細胞の有糸分裂を阻害し、軟部腫瘍、血液腫瘍などに用いられている（非特許文献２）。
ファリーダックカプセル１０ｍｇ添付文書
オンコビン注射用１ｍｇ添付文書
癌の治療においては、１種類の抗癌剤投与だけでは十分な効果が得られないことが多く、複数種類の抗癌剤の併用により治療効果を得ようとする試みがなされている。しかしながら、抗癌剤の併用療法により十分な効果が得られるとは限らず、逆に副作用の増強により投与が継続できなくなることが多いのが現状である。
従って、本発明の課題は、２種類の抗癌剤の併用により優れた抗癌効果が得られ、かつ副作用の少ない新たな抗癌剤併用療法を提供することにある。
従って、本発明の課題は、２種類の抗癌剤の併用により優れた抗癌効果が得られ、かつ副作用の少ない新たな抗癌剤併用療法を提供することにある。
そこで本発明者は、パノビノスタット又はその塩と他の抗癌剤との併用投与による抗癌効果を検討してきたところ、パノビノスタット又はその塩とチューブリン阻害剤との併用により相乗的に優れた抗癌効果が得られ、また単独投与では十分な効果を示さない種々の固形癌細胞に対する増殖抑制効果が得られることを見出した。特に、そのような抗癌効果は、パノビノスタット又はその塩に、極低用量のチューブリン阻害剤を併用することで発揮されることを見出した。また、これら２種類の成分をリポソーム中に内包させれば、溶解性の異なる２成分を含有するリポソーム製剤も得られることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、次の発明〔１〕〜〔１８〕を提供するものである。
〔１〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩と、（Ｂ）チューブリン阻害剤とを組み合わせてなる、癌の予防または治療剤。
〔２〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩と、（Ｂ）チューブリン阻害剤とを併用投与するものである〔１〕記載の癌の予防または治療剤。
〔３〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤とを含有する癌の予防または治療用医薬組成物である〔１〕記載の癌の予防または治療剤。
〔４〕前記チューブリン阻害剤が、ビンクリスチン又はその塩である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔５〕前記癌が、固形癌である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔６〕前記癌が、血液癌である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔７〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩及び（Ｂ）チューブリン阻害剤がリポソームに内包されているリポソーム製剤である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔８〕前記リポソームの組成が、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、およびジパルミトイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせからなる群から選択される、〔７〕記載の癌の予防または治療剤。
〔９〕前記リポソームの組成が、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせであり、前記水素化ダイズホスファチジルコリンと前記コレステロールとのモル比が３：２である、〔８〕記載の癌の予防または治療剤。
〔10〕前記リポソームの組成が、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせであり、前記ジステアロイルホスファチジルコリンと前記コレステロールとのモル比が３：２である、〔８〕記載の癌の予防または治療剤。
〔11〕経口投与製剤または経静脈投与製剤である、〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔12〕経口投与製剤または経静脈投与製剤である、〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔13〕ジパルミトイルホスファチジルコリン、水素化ダイズホスファチジルコリンまたはジステアロイルホスファチジルコリンと、コレステロールとを用いてリポソームを調製する工程、および、
前記リポソームにパノビノスタットを混合する工程の後に、チューブリン阻害剤を混合する工程、
を含む、リポソーム製剤の製造方法。
〔14〕前記チューブリン阻害剤が、ビンクリスチン又はその塩である、〔１３〕記載の製造方法。
〔15〕前記リポソームを調製する工程において、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとを用いる、〔１３〕又は〔１４〕記載の製造方法。
〔16〕癌の予防または治療のための、（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤との組み合わせ。
〔17〕癌の予防または治療剤製造のための、（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤との組み合わせの使用。
〔18〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤とを併用して投与することを特徴とする癌の予防または治療方法。
〔２〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩と、（Ｂ）チューブリン阻害剤とを併用投与するものである〔１〕記載の癌の予防または治療剤。
〔３〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤とを含有する癌の予防または治療用医薬組成物である〔１〕記載の癌の予防または治療剤。
〔４〕前記チューブリン阻害剤が、ビンクリスチン又はその塩である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔５〕前記癌が、固形癌である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔６〕前記癌が、血液癌である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔７〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩及び（Ｂ）チューブリン阻害剤がリポソームに内包されているリポソーム製剤である〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔８〕前記リポソームの組成が、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、およびジパルミトイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせからなる群から選択される、〔７〕記載の癌の予防または治療剤。
〔９〕前記リポソームの組成が、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせであり、前記水素化ダイズホスファチジルコリンと前記コレステロールとのモル比が３：２である、〔８〕記載の癌の予防または治療剤。
〔10〕前記リポソームの組成が、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせであり、前記ジステアロイルホスファチジルコリンと前記コレステロールとのモル比が３：２である、〔８〕記載の癌の予防または治療剤。
〔11〕経口投与製剤または経静脈投与製剤である、〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔12〕経口投与製剤または経静脈投与製剤である、〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔13〕ジパルミトイルホスファチジルコリン、水素化ダイズホスファチジルコリンまたはジステアロイルホスファチジルコリンと、コレステロールとを用いてリポソームを調製する工程、および、
前記リポソームにパノビノスタットを混合する工程の後に、チューブリン阻害剤を混合する工程、
を含む、リポソーム製剤の製造方法。
〔14〕前記チューブリン阻害剤が、ビンクリスチン又はその塩である、〔１３〕記載の製造方法。
〔15〕前記リポソームを調製する工程において、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとを用いる、〔１３〕又は〔１４〕記載の製造方法。
〔16〕癌の予防または治療のための、（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤との組み合わせ。
〔17〕癌の予防または治療剤製造のための、（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤との組み合わせの使用。
〔18〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤とを併用して投与することを特徴とする癌の予防または治療方法。
パノビノスタット又はその塩とチューブリン阻害剤とを併用すれば、相乗的に優れた抗癌効果が得られる。特にパノビノスタットと組み合わせることにより、チューブリン阻害剤の投与量は、劇的に低減させることができるため、本発明の併用によると、特にチューブリン阻害剤に起因する副作用を大幅に低減または全く生じさせずに、長期間投与が継続でき、その結果としてさらに優れた抗癌効果が得られる。また、パノビノスタット及びチューブリン阻害剤の２成分を内包するリポソーム製剤を用いれば、２成分を効率よく同時に投与できるので、優れた抗癌効果が得られる。
本発明の癌の予防または治療剤の有効成分は、（Ａ）パノビノスタット又はその塩と、（Ｂ）チューブリン阻害剤との組み合わせである。
（Ａ）パノビノスタット又はその塩
パノビノスタットは、前述のようにＨＤＡＣ阻害剤の１種であり、化学名（２Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−〔４−（｛［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル〕プロプ−２−エナミドである。また、パノビノスタットの塩としては、乳酸塩、酢酸塩、塩酸塩、硫酸塩等の酸付加塩が挙げられるが、乳酸塩が好ましい。本明細書において、「（Ａ）パノビノスタット又はその塩」は、「成分（Ａ）」ともいう。
パノビノスタットは、前述のようにＨＤＡＣ阻害剤の１種であり、化学名（２Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−〔４−（｛［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル〕プロプ−２−エナミドである。また、パノビノスタットの塩としては、乳酸塩、酢酸塩、塩酸塩、硫酸塩等の酸付加塩が挙げられるが、乳酸塩が好ましい。本明細書において、「（Ａ）パノビノスタット又はその塩」は、「成分（Ａ）」ともいう。
（Ｂ）チューブリン阻害剤
チューブリン阻害剤は、微小管の重合反応を阻害する成分であり、その例としては特に限定されないが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン等のビンカアルカロイド系化合物又はその塩、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン系化合物、コルヒチン、オキシベンダゾール等が挙げられる。このうち、ビンカアルカロイド系化合物又はその塩が好ましく、ビンクリスチン又はその塩が特に好ましい。ビンクリスチンは、化学名メチル（３ａＲ，４Ｒ，５Ｓ，５ａＲ，１０ｂＲ，１３ａＲ）−４−アセトキシ−３ａ−エチル−９−［（５Ｓ，７Ｓ，９Ｓ）−５−エチル−５−ヒドロキシ−９−メトキシカルボニル−１，４，５，６，７，８，９，１０−オクタヒドロ−３，７−メタノ−３−アザシクロウンデシノ ［５，４−ｂ］インドール−９−イル］−６−ホルミル−５−ヒドロキシ−８−メトキシ−３ａ，４，５，５ａ，６，１１，１２，１３ａ−オクタヒドロ−１Ｈ−インドリジノ ［８，１−ｃｄ］カルバゾール−５−カルボキシレートとしても表すことができる。ここで、ビンカアルカロイド系化合物及びビンクリスチンの塩としては、硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酒石酸塩等の酸付加塩が挙げられる。本明細書において、「（Ｂ）チューブリン阻害剤」は、「成分（Ｂ）」ともいう。
チューブリン阻害剤は、微小管の重合反応を阻害する成分であり、その例としては特に限定されないが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン等のビンカアルカロイド系化合物又はその塩、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン系化合物、コルヒチン、オキシベンダゾール等が挙げられる。このうち、ビンカアルカロイド系化合物又はその塩が好ましく、ビンクリスチン又はその塩が特に好ましい。ビンクリスチンは、化学名メチル（３ａＲ，４Ｒ，５Ｓ，５ａＲ，１０ｂＲ，１３ａＲ）−４−アセトキシ−３ａ−エチル−９−［（５Ｓ，７Ｓ，９Ｓ）−５−エチル−５−ヒドロキシ−９−メトキシカルボニル−１，４，５，６，７，８，９，１０−オクタヒドロ−３，７−メタノ−３−アザシクロウンデシノ ［５，４−ｂ］インドール−９−イル］−６−ホルミル−５−ヒドロキシ−８−メトキシ−３ａ，４，５，５ａ，６，１１，１２，１３ａ−オクタヒドロ−１Ｈ−インドリジノ ［８，１−ｃｄ］カルバゾール−５−カルボキシレートとしても表すことができる。ここで、ビンカアルカロイド系化合物及びビンクリスチンの塩としては、硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酒石酸塩等の酸付加塩が挙げられる。本明細書において、「（Ｂ）チューブリン阻害剤」は、「成分（Ｂ）」ともいう。
本発明の癌の予防または治療剤は、前記成分（Ａ）と成分（Ｂ）とを組み合わせてなる医薬であり、これらの成分を併用できる形態であればよい。具体的には、各成分の好ましい投与形態や投与スケジュールに基づき、各成分をそれぞれの剤形に分けて製剤化してもよく、一つの剤形にまとめて製剤化（すなわち、配合剤として製剤化）してもよく、さらに各製剤を併用に適した１個のパッケージにまとめて製造販売してもよく、各製剤を別個のパッケージに分けて製造販売してもよい。各製剤を１個のパッケージとするか別個のパッケージとする場合、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を併用投与することを記載した使用説明書を含むキット製剤とすることもできる。ここで「使用説明書」とは、投与量が記載されたものであればよい。具体的には、添付文書、パンフレット等が例示される。また、使用説明書を含むキット製剤とは、キット製剤のパッケージに使用説明書が印刷・添付されているものであっても、キット製剤のパッケージに本発明の癌の予防または治療剤とともに使用説明書が同封されているものであってもよい。
各成分をそれぞれ別の剤形に分けて製剤化する場合には、例えばパノビノスタットは経口投与製剤として既に販売されているのでそのままの形態でよく、ビンクリスチンは経静脈投与製剤として既に販売されているのでそのままの形態でよい。一方、一つの剤形にまとめて製剤化する場合には、成分（Ａ）と成分（Ｂ）とを含有する医薬組成物、例えば後述のように２成分を内包したリポソームを含有する製剤としてもよいし、他の剤形としてもよい。
成分（Ａ）は、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜５０ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ〜２５ｍｇ、更に好ましくは１０ｍｇ〜２０ｍｇの量で本発明の医薬に含ませることができる。成分（Ａ）が上記範囲であることにより、本発明は、好ましい抗癌作用を発揮することができ、かつ、成分（Ｂ）との相乗効果がより顕著に発揮される。また、成分（Ａ）は、成分（Ｂ）と併用することにより、成分（Ａ）単独で抗癌効果を示す量よりも少ない量（例えば、１／１０〜１／２）で、抗癌効果を示す可能性がある。従って、成分（Ａ）の副作用は、成分（Ｂ）と併用することにより、低減できる可能性がある。
成分（Ａ）は、インビトロ又はエクスビボの系において、好ましくは０．０００１μＭ〜１μＭ、より好ましくは０．００１μＭ〜０．１μＭ、更に好ましくは０．００１μＭ〜０．０５μＭの濃度で治療対象の細胞に接触する量で、本発明の医薬に含ませることができる。
成分（Ａ）は、インビボの系において、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬの血中濃度となる量で、本発明の医薬に含ませることができる。
成分（Ａ）が上記範囲であることにより、本発明は、好ましい抗癌作用を発揮することができ、かつ、成分（Ｂ）との相乗効果がより顕著に発揮される。成分（Ａ）は、成分（Ｂ）と併用することにより、成分（Ａ）単独で抗癌効果を示す濃度よりも少ない濃度（例えば、１／１０〜１／２）で、抗癌効果を示す可能性がある。従って、成分（Ａ）の副作用は、成分（Ｂ）と併用することにより、低減できる可能性がある。
成分（Ａ）は、インビトロ又はエクスビボの系において、好ましくは０．０００１μＭ〜１μＭ、より好ましくは０．００１μＭ〜０．１μＭ、更に好ましくは０．００１μＭ〜０．０５μＭの濃度で治療対象の細胞に接触する量で、本発明の医薬に含ませることができる。
成分（Ａ）は、インビボの系において、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬの血中濃度となる量で、本発明の医薬に含ませることができる。
成分（Ａ）が上記範囲であることにより、本発明は、好ましい抗癌作用を発揮することができ、かつ、成分（Ｂ）との相乗効果がより顕著に発揮される。成分（Ａ）は、成分（Ｂ）と併用することにより、成分（Ａ）単独で抗癌効果を示す濃度よりも少ない濃度（例えば、１／１０〜１／２）で、抗癌効果を示す可能性がある。従って、成分（Ａ）の副作用は、成分（Ｂ）と併用することにより、低減できる可能性がある。
成分（Ｂ）は、１０ｍｇ以下、好ましくは１ｍｇ以下、１μｇ以下、１ｎｇ以下、１ｐｇ以下、１ｆｇ以下、１ａｇ以下の量で本発明の医薬に含ませることができる。また、成分（Ｂ）は、０ｇ超、好ましくは１ａｇ以上、１ｆｇ以上、１ｐｇ以上、１ｎｇ以上、１μｇ以上、１ｍｇ以上の量で本発明に含ませることができる。成分（Ｂ）は、例えば１ａｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１ａｇ〜１ｎｇ、より好ましくは１ｆｇ〜１ｎｇ、更に好ましくは１ｐｇ〜１ｎｇ、の量で本発明の医薬に含ませることができる。
成分（Ｂ）は、インビトロ又はエクスビボの系において、０Ｍ超１０μＭ以下、好ましくは１ａＭ〜１μＭ、より好ましくは１ｆＭ〜１ｎＭの濃度で治療対象の細胞に接触する量で、本発明の医薬に含ませることができる。
成分（Ｂ）は、インビボの系において、０ｇ／ｍＬ超１００ｎｇ／ｍＬ以下、好ましくは１ｚｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ａｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、更に好ましくは１ｆｇ／ｍＬ〜１ｐｇ／ｍＬの血中濃度となる量で、本発明の医薬に含ませることができる。
成分（Ｂ）が上記範囲であることにより、本発明は、好ましい抗癌作用を発揮することができ、かつ、成分（Ａ）との相乗効果がより顕著に発揮される。また、成分（Ｂ）は、成分（Ａ）と併用することにより、成分（Ｂ）単剤で用いられる場合の１０2分の１以下、例えば１０3分の１以下、１０4分の１以下、１０5分の１以下、１０6分の１以下、１０７分の１以下、１０８分の１以下の量で、抗癌作用を示すことができる。従って、成分（Ｂ）の副作用は、成分（Ａ）と併用することにより、大幅に低減でき、又は全く示されないレベルにまで低減させることができる。
成分（Ｂ）は、インビトロ又はエクスビボの系において、０Ｍ超１０μＭ以下、好ましくは１ａＭ〜１μＭ、より好ましくは１ｆＭ〜１ｎＭの濃度で治療対象の細胞に接触する量で、本発明の医薬に含ませることができる。
成分（Ｂ）は、インビボの系において、０ｇ／ｍＬ超１００ｎｇ／ｍＬ以下、好ましくは１ｚｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ａｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、更に好ましくは１ｆｇ／ｍＬ〜１ｐｇ／ｍＬの血中濃度となる量で、本発明の医薬に含ませることができる。
成分（Ｂ）が上記範囲であることにより、本発明は、好ましい抗癌作用を発揮することができ、かつ、成分（Ａ）との相乗効果がより顕著に発揮される。また、成分（Ｂ）は、成分（Ａ）と併用することにより、成分（Ｂ）単剤で用いられる場合の１０2分の１以下、例えば１０3分の１以下、１０4分の１以下、１０5分の１以下、１０6分の１以下、１０７分の１以下、１０８分の１以下の量で、抗癌作用を示すことができる。従って、成分（Ｂ）の副作用は、成分（Ａ）と併用することにより、大幅に低減でき、又は全く示されないレベルにまで低減させることができる。
成分（Ａ）及び成分（Ｂ）は、成分（Ａ）：成分（Ｂ）＝１：１以下、成分（Ａ）：成分（Ｂ）＝１０3：１以下、成分（Ａ）：成分（Ｂ）＝１０6：１以下、成分（Ａ）：成分（Ｂ）＝１０9：１以下、成分（Ａ）：成分（Ｂ）＝１０12：１以下、のモル比で、本発明の医薬に含ませることができる。
成分（Ａ）及び成分（Ｂ）のモル比が上記範囲であることにより、本発明は、好ましい抗癌作用を発揮することができ、かつ、成分（Ａ）と成分（Ｂ）との相乗効果がより顕著に発揮される。従って、成分（Ｂ）の副作用は、成分（Ａ）と併用することにより、大幅に低減でき、又は全く示されないレベルにまで低減させることができる。
本発明の実施態様において、成分（Ｂ）は、成分（Ａ）の抗癌作用を増強させる。本発明の別の実施態様において、成分（Ａ）は、成分（Ｂ）の抗癌作用を増強させる。
成分（Ａ）及び成分（Ｂ）のモル比が上記範囲であることにより、本発明は、好ましい抗癌作用を発揮することができ、かつ、成分（Ａ）と成分（Ｂ）との相乗効果がより顕著に発揮される。従って、成分（Ｂ）の副作用は、成分（Ａ）と併用することにより、大幅に低減でき、又は全く示されないレベルにまで低減させることができる。
本発明の実施態様において、成分（Ｂ）は、成分（Ａ）の抗癌作用を増強させる。本発明の別の実施態様において、成分（Ａ）は、成分（Ｂ）の抗癌作用を増強させる。
成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を投与することにより、癌の予防または治療方法を提供することができる。成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の投与は、同時であってよく、同時でなくてもよい。
本発明は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトに投与される。
また、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の投与経路は、同じであってよく、異なっていてもよい。投与経路は、経口、経静脈、経動脈、皮下、筋肉内、経肺を含む任意の経路であってよい。
一実施態様において、成分（Ａ）の投与は、経口投与であり、かつ、成分（Ｂ）の投与は、経静脈投与である。別の実施態様において、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）は、ともに経口投与である。別の実施態様において、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）は、ともに経静脈投与である。
本発明は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトに投与される。
また、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の投与経路は、同じであってよく、異なっていてもよい。投与経路は、経口、経静脈、経動脈、皮下、筋肉内、経肺を含む任意の経路であってよい。
一実施態様において、成分（Ａ）の投与は、経口投与であり、かつ、成分（Ｂ）の投与は、経静脈投与である。別の実施態様において、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）は、ともに経口投与である。別の実施態様において、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）は、ともに経静脈投与である。
本発明において、成分（Ｂ）は、成分（Ａ）と併用することで、成分（Ｂ）単剤の場合よりも非常に低い量（例えば、１０2分の１以下、１０3分の１以下、１０4分の１以下、１０5分の１以下、１０6分の１以下、１０7分の１以下、１０8分の１以下）で抗癌作用を示すことから、成分（Ａ）とともに製剤化することができる。本発明の医薬は、経口、経静脈、経動脈、皮下、筋肉内、経肺を含む任意の経路に適するように製剤化することができる。本発明の製剤は、例えば、エアゾール剤、液剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、坐剤、錠剤、注射剤を含む、任意の剤形に製剤化できる。
好ましくは、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を含む本発明は、リポソーム製剤である。本発明は、リポソーム製剤であることにより、溶解度の異なる成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を効率よく含むことができる。
好ましくは、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を含む本発明は、リポソーム製剤である。本発明は、リポソーム製剤であることにより、溶解度の異なる成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を効率よく含むことができる。
本発明の癌の予防または治療剤の対象となる癌種には血液癌だけでなく固形癌が含まれる。血液癌としては、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫が挙げられる。固形癌としては、具体的には、頭頸部癌、消火器癌（食道癌、胃癌、十二指腸癌、肝臓癌、胆道癌（胆嚢・胆管癌など）、膵臓癌、小腸癌、大腸癌（結腸直腸癌、結腸癌（結腸腺癌を含む）、直腸癌など）、消化管間質腫瘍など）、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、乳癌、卵巣癌、子宮癌（子宮頸癌、子宮体癌など）、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、肉腫（線維肉腫、滑膜肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫など）等が挙げられる。なお、ここで癌には、原発巣のみならず、他の臓器（肝臓など）に転移した癌も含む。
成分（Ａ）又は成分（Ｂ）、それぞれ単独では固形癌に有効性は認められないが、本発明の成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を組み合わせてなる癌の予防または治療剤は、後記実施例に示すように多くの固形癌に対して優れた増殖抑制効果を示す。
成分（Ａ）又は成分（Ｂ）、それぞれ単独では固形癌に有効性は認められないが、本発明の成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を組み合わせてなる癌の予防または治療剤は、後記実施例に示すように多くの固形癌に対して優れた増殖抑制効果を示す。
本発明の癌の予防または治療剤の投与形態は、各成分が通常採用されている投与形態でもよいが、両成分を含有する医薬組成物（配合剤）とするのが好ましい。成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を含有する医薬組成物の形態としては、経口投与製剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示できるが、経口投与製剤又は経静脈投与製剤が好ましい。
これらの投与形態は、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）に加えて、薬学的に許容される担体を用いて、通常公知の方法により調製することができる。斯かる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。
これらの投与形態は、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）に加えて、薬学的に許容される担体を用いて、通常公知の方法により調製することができる。斯かる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。
成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を含有する医薬組成物とするにあたっては、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）がリポソームに内包されているリポソーム製剤とするのが好ましい。リポソーム製剤は、リポソーム、すなわち脂質二分子膜内に成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を内包した形態の製剤である。
リポソームを形成するリン脂質としては、（１）卵黄レシチン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、水素化ダイズホスファチジルコリン等のジアシル基が飽和又は不飽和のリン脂質、（２）親水基がエタノールアミン、セリン、イノシトール、グリセロールであるアシル基が飽和又は不飽和のリン脂質、（３）アシル基がリソ体であるリン脂質のいずれでも良く、もちろん上記複数の組み合わせでも良い。また、リン脂質に加えて膜安定化作用を有するコレステロールを併用することもできる。
これらのリポソーム形成脂質としては、成分（Ａ）と成分（Ｂ）の内封率の点から、リン脂質とコレステロールとの組み合わせが好ましく、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ジパルミトイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせがより好ましく、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせがさらに好ましく、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせが最も好ましい。
また、リン脂質とコレステロールとのモル比は、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の内封率の点から、１０：１〜１０：１０が好ましく、５：１〜５：５がより好ましく、２：１〜４：３がさらに好ましく、特に３：２が好ましい。
このようにリポソーム製剤とすることにより、溶解性の異なる成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を好ましいモル比で効率よく治療部位に送達することができる。
これらのリポソーム形成脂質としては、成分（Ａ）と成分（Ｂ）の内封率の点から、リン脂質とコレステロールとの組み合わせが好ましく、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ジパルミトイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせがより好ましく、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせがさらに好ましく、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせが最も好ましい。
また、リン脂質とコレステロールとのモル比は、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の内封率の点から、１０：１〜１０：１０が好ましく、５：１〜５：５がより好ましく、２：１〜４：３がさらに好ましく、特に３：２が好ましい。
このようにリポソーム製剤とすることにより、溶解性の異なる成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を好ましいモル比で効率よく治療部位に送達することができる。
リポソーム製剤の製造法としては、水和法、逆相蒸発法、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、凍結融解法等が挙げられる。ここで、リポソーム中に成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を内封させる場合、成分（Ａ）を内封させ、次いで成分（Ｂ）を内封させる手段を採用することにより、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の両者の内封率が向上する。具体的には、ジパルミトイルホスファチジルコリン、水素化ダイズホスファチジルコリン又はジステアロイルホスファチジルコリンと、コレステロールとを用いてリポソームを調製する工程、および、
前記リポソームに成分（Ａ）を混合する工程の後に、成分（Ｂ）を混合する工程を採用することにより、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の両者の内封率が向上したリポソーム製剤が得られる。
前記リポソームに成分（Ａ）を混合する工程の後に、成分（Ｂ）を混合する工程を採用することにより、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の両者の内封率が向上したリポソーム製剤が得られる。
本発明の成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を内包したリポソーム製剤は、有効成分の内封率が高いため、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を効率よく投与することができる。好ましくは、本発明の成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を内包したリポソーム製剤は、経口投与及び経静脈投与を含む様々な投与手段に使用可能であり、癌の予防または治療剤として有用である。
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されない。
実施例１（パノビノスタットとの併用抗癌剤の探索）
１．実験方法
（スクリーニング１）パノビノスタットとの２剤併用による癌細胞の生存率の低下を指標として、併用抗癌剤のスクリーニングを実施した。
使用ライブラリー：ＬＴＴバイオファーマ既承認薬ライブラリー（株式会社ＬＴＴバイオファーマから入手した）
使用細胞：Ｃｏｌｏｎ２６ ＮＬ−１７マウス結腸癌細胞株（（財）癌研究会 癌化学療法センターから入手した）
ＨＤＡＣ阻害剤：パノビノスタット
陰性コントロール：未処理
コントロール：パノビノスタット単独添加（１．０μＭ）
サンプル群：パノビノスタット（０．０１μＭ、０．１μＭ、１．０μＭ）および既承認薬ライブラリー化合物（１．０μＭ）併用添加群
評価：Ｃｏｌｏｎ２６ ＮＬ−１７マウス結腸癌細胞株を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。Ｃｏｌｏｎ２６ ＮＬ−１７マウス結腸癌細胞株を播種（３，０００細胞／ウェル、３７℃）してから２４時間後に、未処理、パノビノスタット単独（１．０μＭ）、またはパノビノスタット（１．０μＭ）と既承認薬ライブラリー化合物（１．０μＭ）との併用でそれぞれ処理し、その４８時間後にＷＳＴ−８アッセイにて前記細胞の生存率の低下を評価した。この結果、パノビノスタット単独添加の生存率の７割以下になっている併用添加群の既承認薬ライブラリー化合物を選別した。
次に、併用添加群についてパノビノスタットの最終濃度０．０１μＭおよび０．１μＭを追加した以外は上記と同様の方法で再評価を行い、全ての濃度を通じてパノビノスタット単独添加群の生存率の５割以下になっている併用添加群の既承認薬ライブラリー化合物を選別した。
１．実験方法
（スクリーニング１）パノビノスタットとの２剤併用による癌細胞の生存率の低下を指標として、併用抗癌剤のスクリーニングを実施した。
使用ライブラリー：ＬＴＴバイオファーマ既承認薬ライブラリー（株式会社ＬＴＴバイオファーマから入手した）
使用細胞：Ｃｏｌｏｎ２６ ＮＬ−１７マウス結腸癌細胞株（（財）癌研究会 癌化学療法センターから入手した）
ＨＤＡＣ阻害剤：パノビノスタット
陰性コントロール：未処理
コントロール：パノビノスタット単独添加（１．０μＭ）
サンプル群：パノビノスタット（０．０１μＭ、０．１μＭ、１．０μＭ）および既承認薬ライブラリー化合物（１．０μＭ）併用添加群
評価：Ｃｏｌｏｎ２６ ＮＬ−１７マウス結腸癌細胞株を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。Ｃｏｌｏｎ２６ ＮＬ−１７マウス結腸癌細胞株を播種（３，０００細胞／ウェル、３７℃）してから２４時間後に、未処理、パノビノスタット単独（１．０μＭ）、またはパノビノスタット（１．０μＭ）と既承認薬ライブラリー化合物（１．０μＭ）との併用でそれぞれ処理し、その４８時間後にＷＳＴ−８アッセイにて前記細胞の生存率の低下を評価した。この結果、パノビノスタット単独添加の生存率の７割以下になっている併用添加群の既承認薬ライブラリー化合物を選別した。
次に、併用添加群についてパノビノスタットの最終濃度０．０１μＭおよび０．１μＭを追加した以外は上記と同様の方法で再評価を行い、全ての濃度を通じてパノビノスタット単独添加群の生存率の５割以下になっている併用添加群の既承認薬ライブラリー化合物を選別した。
（スクリーニング２）細胞をＨＣＴ１１６ヒト結腸腺癌細胞株に代えた以外はスクリーニング１と同様の方法で、パノビノスタットとの２剤併用による癌細胞の生存率の低下を指標として、併用抗癌剤のさらなるスクリーニングを実施した。
（スクリーニング３）スクリーニング１および２によりスクリーニングされた既承認薬ライブラリーの化合物について、２種類の細胞でパノビノスタットとの２剤併用による癌細胞の生存率の低下を評価して、併用抗癌剤をスクリーニングした。
使用細胞：ＨＣＴ１１６ヒト結腸腺癌細胞株（ＨＣＴ１１６）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した）
Ｃｏｌｏｎ２６ ＮＬ−１７マウス結腸癌細胞株（Ｃ２６ＮＬ１７）
サンプル群：パノビノスタット（１μＭ）および既承認薬ライブラリー化合物（１μＭ）
併用添加群
＋ ‥ パノビノスタット （１μＭ）添加した併用群
− ‥ パノビノスタット未添加のライブラリー化合物群
評価：スクリーニング１と同様にして、上記細胞における生存率の低下を評価した。
使用細胞：ＨＣＴ１１６ヒト結腸腺癌細胞株（ＨＣＴ１１６）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した）
Ｃｏｌｏｎ２６ ＮＬ−１７マウス結腸癌細胞株（Ｃ２６ＮＬ１７）
サンプル群：パノビノスタット（１μＭ）および既承認薬ライブラリー化合物（１μＭ）
併用添加群
＋ ‥ パノビノスタット （１μＭ）添加した併用群
− ‥ パノビノスタット未添加のライブラリー化合物群
評価：スクリーニング１と同様にして、上記細胞における生存率の低下を評価した。
２．実験結果
（スクリーニング１）
パノビノスタット（１μＭ）単独添加群の生存率の７割以下になっている併用添加群の既承認薬ライブラリー化合物を選別した。その結果、９２化合物に絞り込まれた。
その９２化合物を用い、併用添加群におけるパノビノスタットの最終濃度を０．０１μＭ、０．１μＭ、１．０μＭと変更して再評価を行い、全ての濃度を通じてそれぞれパノビノスタット単独添加群の生存率の５割以下になっている併用添加群の既承認薬ライブラリー化合物を選別した。その結果、３４化合物に絞り込まれた。
（スクリーニング１）
パノビノスタット（１μＭ）単独添加群の生存率の７割以下になっている併用添加群の既承認薬ライブラリー化合物を選別した。その結果、９２化合物に絞り込まれた。
その９２化合物を用い、併用添加群におけるパノビノスタットの最終濃度を０．０１μＭ、０．１μＭ、１．０μＭと変更して再評価を行い、全ての濃度を通じてそれぞれパノビノスタット単独添加群の生存率の５割以下になっている併用添加群の既承認薬ライブラリー化合物を選別した。その結果、３４化合物に絞り込まれた。
（スクリーニング２、３）
ＨＣＴ１１６ヒト結腸腺癌細胞株を用いたスクリーニングにおいて高い併用効果を示した化合物を選択した結果、４化合物のチューブリン阻害薬が含まれていた（図１）。
ＨＣＴ１１６ヒト結腸腺癌細胞株を用いたスクリーニングにおいて高い併用効果を示した化合物を選択した結果、４化合物のチューブリン阻害薬が含まれていた（図１）。
実施例２（α−チューブリン染色によるパノビノスタットとビンクリスチン併用時の微小管の観察）
１．実験材料
パノビノスタット ０．０１μＭ
ビンクリスチン ０．０１μＭ
Ａｎｔｉ−α−ｔｕｂｕｌｉｎ ｐＡｂ （ＭＢＬ）
Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８ （Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
マウント剤（Ｐｅｒｍａ Ｆｌｕｏｒ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
ＤＡＰＩ（１ｍｇ／ｍＬ）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
１．実験材料
パノビノスタット ０．０１μＭ
ビンクリスチン ０．０１μＭ
Ａｎｔｉ−α−ｔｕｂｕｌｉｎ ｐＡｂ （ＭＢＬ）
Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８ （Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
マウント剤（Ｐｅｒｍａ Ｆｌｕｏｒ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
ＤＡＰＩ（１ｍｇ／ｍＬ）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
２．実験方法
ＨＣＴ１１６ヒト結腸腺癌細胞株を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。ＨＣＴ１１６細胞をノンコートガラスプレート（松浪硝子工業）に７．０×１０4細胞／１５０μＬずつ播種し、コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）（薬剤無添加群）、パノビノスタット（ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）０．０１μＭ、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）０．０１μＭ、パノビノスタット０．０１μＭとビンクリスチン０．０１μＭとの併用（併用）の終濃度となるようそれぞれ１０μＬ添加した後、１２時間、３７℃、５％ＣＯ2にてインキュベートした。
ＨＣＴ１１６ヒト結腸腺癌細胞株を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。ＨＣＴ１１６細胞をノンコートガラスプレート（松浪硝子工業）に７．０×１０4細胞／１５０μＬずつ播種し、コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）（薬剤無添加群）、パノビノスタット（ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）０．０１μＭ、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）０．０１μＭ、パノビノスタット０．０１μＭとビンクリスチン０．０１μＭとの併用（併用）の終濃度となるようそれぞれ１０μＬ添加した後、１２時間、３７℃、５％ＣＯ2にてインキュベートした。
これを８時間インキュベートしたものを染色用サンプルとした。その後、薬液をアスピレートし、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、−２０℃の冷凍庫で冷やしたメタノールにプレートを浸し、１０分間固定した。１５０μＬの３％ウシ血清アルブミン−ＰＢＳ溶液（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で室温にて６０分間ブロッキングし、ブロッキング液をアスピレートした後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍希釈したａｎｔｉ−α−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体を７５μＬ添加し、室温で１時間反応させた。次にＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８を７５μＬ添加し、遮光下室温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、マウント剤を１滴ずつ滴下し、１μＬのＤＡＰＩを加えてピペッティングし、カバーガラス（松浪硝子工業）をかぶせ封入した。マウント剤が十分乾燥した後、共焦点レーザースキャン顕微鏡（Ａ１Ｒ+、Ｎｉｋｏｎ）で観察した。
３．実験結果
図２及び図３に示すように、コントロールと比べて、パノビノスタット添加群では微小管が伸長したものが多いという点が特徴的であった。ビンクリスチン添加群では細胞周期がＭ期で停止し、微小管が２つに分裂したものが多数見られた。パノビノスタットとビンクリスチン併用群ではこの２つの特徴が混在したものやパノビノスタットだけの特徴を反映したもの、ビンクリスチンだけの特徴を反映したもの、さらには多極紡錘体（ｍｕｌｔｉ−ｐｏｌａｒ ｓｐｉｎｄｌｅ）が見られた。
図２及び図３に示すように、コントロールと比べて、パノビノスタット添加群では微小管が伸長したものが多いという点が特徴的であった。ビンクリスチン添加群では細胞周期がＭ期で停止し、微小管が２つに分裂したものが多数見られた。パノビノスタットとビンクリスチン併用群ではこの２つの特徴が混在したものやパノビノスタットだけの特徴を反映したもの、ビンクリスチンだけの特徴を反映したもの、さらには多極紡錘体（ｍｕｌｔｉ−ｐｏｌａｒ ｓｐｉｎｄｌｅ）が見られた。
実施例３（細胞増殖抑制効果の検討）
（１）ヒト結腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭおよび１０μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭおよび１０μＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
（１）ヒト結腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭおよび１０μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭおよび１０μＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
（ＨＣＴ１１６細胞の細胞調製）
ＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％ トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
ＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％ トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．単剤による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタットまたはビンクリスチンの終濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭまたは１μＭとなるようそれぞれ２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ａ．単剤による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタットまたはビンクリスチンの終濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭまたは１μＭとなるようそれぞれ２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１６０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタット単独で最終濃度０．００３μＭ、あるいはパノビノスタット最終濃度０．００３μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭまたは１μＭの併用となるように２０μＬずつ添加し、それぞれ３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１６０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタット単独で最終濃度０．００３μＭ、あるいはパノビノスタット最終濃度０．００３μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭまたは１μＭの併用となるように２０μＬずつ添加し、それぞれ３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｃ．併用による細胞増殖抑制試験
パノビノスタットの最終濃度を０．０１μＭにした以外は「Ａ．単剤による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で細胞を処理した後、生細胞数を算出した。
パノビノスタットの最終濃度を０．０１μＭにした以外は「Ａ．単剤による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で細胞を処理した後、生細胞数を算出した。
細胞増殖抑制試験のデータを解析し、相乗効果の指標としてＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）値を求めた。ＣＩ値は、ＣｏｍｐｕＳｙｎ社の「ＣｏｍｐｕＳｙｎ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｄｏｓｅ−Ｅｆｆｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｔｉｎｇ−Ｃｈａｏ Ｃｈｏｕ」を用いて算出した。
２．実験結果
Ａ．単剤による細胞増殖抑制効果を図４に示す。
Ｂ．パノビノスタット０．００３μＭとビンクリスチンの併用による効果を図５に示す。
Ｃ．パノビノスタット（Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）０．０１μＭとビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）の併用による効果を図６に示す。
Ａ．単剤による細胞増殖抑制効果を図４に示す。
Ｂ．パノビノスタット０．００３μＭとビンクリスチンの併用による効果を図５に示す。
Ｃ．パノビノスタット（Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）０．０１μＭとビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）の併用による効果を図６に示す。
併用による効果を評価するため、パノビノスタット濃度は、単剤処理において細胞増殖抑制効果の低かった０．００３μＭと０．０１μＭに設定した。それぞれ濃度をふったビンクリスチンと併用し、細胞増殖抑制効果を検討した。
パノビノスタット０．００３μＭ併用群では、パノビノスタット単独の場合に細胞生存率の低下が認められなかったところ、ビンクリスチン０．００３μＭ及び０．０１μＭとの併用群では、ビンクリスチン単独の場合よりも細胞生存率を低下させ、癌細胞増殖抑制効果を有することが示された。またその併用効果は、ビンクリスチンの濃度が低いほど、顕著に示された（図４〜図５）。
一方、パノビノスタット０．０１μＭ併用群では、０．３μＭのビンクリスチン単剤と同程度またはそれ以上の効果を、およそ１００倍濃度の薄い０．００３μＭのビンクリスチンで得ることができた（１μＭビンクリスチン単剤：８６．３％抑制、０．３μＭビンクリスチン単剤：８２．９％抑制、０．００３μＭビンクリスチン＋パノビノスタット０．０１μＭ：８４．４％抑制）。このことから、特に０．０１μＭのパノビノスタットを用いた場合、ビンクリスチンと併用することにより、癌細胞の細胞増殖抑制効果が劇的に向上することが示された。またその併用効果は、ビンクリスチンの濃度が低いほど、顕著に示された（図５及び図６）。
パノビノスタット０．００３μＭ併用群では、パノビノスタット単独の場合に細胞生存率の低下が認められなかったところ、ビンクリスチン０．００３μＭ及び０．０１μＭとの併用群では、ビンクリスチン単独の場合よりも細胞生存率を低下させ、癌細胞増殖抑制効果を有することが示された。またその併用効果は、ビンクリスチンの濃度が低いほど、顕著に示された（図４〜図５）。
一方、パノビノスタット０．０１μＭ併用群では、０．３μＭのビンクリスチン単剤と同程度またはそれ以上の効果を、およそ１００倍濃度の薄い０．００３μＭのビンクリスチンで得ることができた（１μＭビンクリスチン単剤：８６．３％抑制、０．３μＭビンクリスチン単剤：８２．９％抑制、０．００３μＭビンクリスチン＋パノビノスタット０．０１μＭ：８４．４％抑制）。このことから、特に０．０１μＭのパノビノスタットを用いた場合、ビンクリスチンと併用することにより、癌細胞の細胞増殖抑制効果が劇的に向上することが示された。またその併用効果は、ビンクリスチンの濃度が低いほど、顕著に示された（図５及び図６）。
ＣＩ値は、０に近いほど相乗効果が高いと評価でき、１付近の場合に相加効果ありと評価でき、１を上回って大きくなるほど相加及び相乗効果が小さいと評価できる。ＣＩ値は下記表の通りであった。
ＣＩ値から、パノビノスタットとビンクリスチンとは癌細胞（ＨＣＴ１１６）の細胞増殖抑制について相乗効果を示すこと、及びその相乗効果はビンクリスチンが低濃度の場合により顕著であったことが示された。
Ｄ． 併用による細胞増殖抑制試験
ビンクリスチン単独で最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭあるいは０．０３μＭとパノビノスタット最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭまたは０．３μＭの併用となるように２２．５μＬずつ添加した以外は「Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で細胞を処理した後、生細胞数を算出した。
また、Ｄ．の結果より、癌細胞増殖抑制におけるパノビノスタットの併用効果は、パノビノスタット単剤である程度癌細胞増殖抑制効果が見られる濃度で発揮されることが示された（図７〜図９）。
ビンクリスチン単独で最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭあるいは０．０３μＭとパノビノスタット最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭまたは０．３μＭの併用となるように２２．５μＬずつ添加した以外は「Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で細胞を処理した後、生細胞数を算出した。
また、Ｄ．の結果より、癌細胞増殖抑制におけるパノビノスタットの併用効果は、パノビノスタット単剤である程度癌細胞増殖抑制効果が見られる濃度で発揮されることが示された（図７〜図９）。
また、ＣＩ値は下記表の通りであった。
これらの結果から、癌細胞（ＨＣＴ１１６）の細胞増殖抑制について、パノビノスタットが所定の濃度範囲である場合にビンクリスチンとの相乗効果が発揮されること、及びパノビノスタットとビンクリスチンとの濃度比（モル比）が相加又は相乗効果の発揮に影響することが示された。
実施例４（ヒト結腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞（ビンクリスチン極低濃度（ｎＭオーダー）））
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ１０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭまたは３０ｎＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ１０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭまたは３０ｎＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
ヒト結腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
ヒト結腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、または３ｎＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ａ．ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、または３ｎＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。最終濃度０．０１μＭのパノビノスタット単独（ｐａｎｏ ｏｎｌｙ）、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、または３ｎＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。最終濃度０．０１μＭのパノビノスタット単独（ｐａｎｏ ｏｎｌｙ）、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、または３ｎＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
２．実験結果
ビンクリスチン単独ではまったくあるいはほとんど癌細胞の増殖抑制効果が得られない低濃度域においても、パノビノスタットと併用することで、癌細胞の増殖抑制効果が観察された（図１０、図１１）。
ビンクリスチン単独ではまったくあるいはほとんど癌細胞の増殖抑制効果が得られない低濃度域においても、パノビノスタットと併用することで、癌細胞の増殖抑制効果が観察された（図１０、図１１）。
実施例５（ヒト結腸腺がん細胞株ＨＣＴ１１６細胞（ビンクリスチン極低濃度（ｎＭオーダー以下）））
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．０３ｐＭ、０．１ｐＭ、０．３ｐＭ、１ｐＭ、３ｐＭ、１０ｐＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭまたは１０ｎＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
ヒト結腸腺がん細胞株ＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ． ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．００３ｐＭ、０．０１ｐＭ、０．０３ｐＭ、０．１ｐＭ、０．３ｐＭ、１ｐＭ、０．００３ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭまたは１ｎＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ． 併用による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。最終濃度０．０１μＭのパノビノスタット単独（ｐａｎｏ ｏｎｌｙ）、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３ｐＭ、０．０１ｐＭ、０．０３ｐＭ、０．１ｐＭ、０．３ｐＭ、１ｐＭ、０．００３ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭまたは１ｎＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
また、細胞増殖抑制試験のデータを解析し、相乗効果の指標としてＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）値を求めた。ＣＩ値は、ＣｏｍｐｕＳｙｎ社の「ＣｏｍｐｕＳｙｎ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｄｏｓｅ−Ｅｆｆｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｔｉｎｇ−Ｃｈａｏ Ｃｈｏｕ」を用いて算出した。
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．０３ｐＭ、０．１ｐＭ、０．３ｐＭ、１ｐＭ、３ｐＭ、１０ｐＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭまたは１０ｎＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
ヒト結腸腺がん細胞株ＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ． ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．００３ｐＭ、０．０１ｐＭ、０．０３ｐＭ、０．１ｐＭ、０．３ｐＭ、１ｐＭ、０．００３ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭまたは１ｎＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ． 併用による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。最終濃度０．０１μＭのパノビノスタット単独（ｐａｎｏ ｏｎｌｙ）、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３ｐＭ、０．０１ｐＭ、０．０３ｐＭ、０．１ｐＭ、０．３ｐＭ、１ｐＭ、０．００３ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭまたは１ｎＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
また、細胞増殖抑制試験のデータを解析し、相乗効果の指標としてＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）値を求めた。ＣＩ値は、ＣｏｍｐｕＳｙｎ社の「ＣｏｍｐｕＳｙｎ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｄｏｓｅ−Ｅｆｆｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｔｉｎｇ−Ｃｈａｏ Ｃｈｏｕ」を用いて算出した。
２．実験結果
ビンクリスチン単独ではまったくあるいはほとんど癌細胞の増殖抑制効果が得られない低濃度域においても、パノビノスタットと併用することで、癌細胞の増殖抑制効果が観察された（図１２、図１３）。
ビンクリスチン単独ではまったくあるいはほとんど癌細胞の増殖抑制効果が得られない低濃度域においても、パノビノスタットと併用することで、癌細胞の増殖抑制効果が観察された（図１２、図１３）。
また、ＣＩ値は下記表の通りであった。
ＣＩ値から、癌細胞（ＨＣＴ１１６）の細胞増殖抑制についてのパノビノスタットとビンクリスチンとの相乗効果は、ビンクリスチンがｎＭオーダー以下の極低濃度であっても発揮されることが示された。
実施例６（ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０細胞）
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭおよび０．３μＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭおよび０．３μＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ社から入手した）を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ社から入手した）を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
ＨＴ１０８０細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
ＨＴ１０８０細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタット最終濃度０．０１μＭ（ｐａｎｏ ｏｎｌｙ）、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭおよび０．０３μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ａ．ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
ＨＴ１０８０細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
ＨＴ１０８０細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタット最終濃度０．０１μＭ（ｐａｎｏ ｏｎｌｙ）、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭおよび０．０３μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
２．実験結果
ビンクリスチン単剤で癌細胞の細胞増殖抑制効果がまったく見られなかった濃度で、パノビノスタットと併用することにより、癌細胞の細胞増殖抑制効果が示された。特に、低濃度のビンクリスチンを用いた場合に、パノビノスタットとの併用効果が高いことが示された。
また、ビンクリスチン単剤で約７０％の癌細胞の細胞増殖抑制効果を示す濃度においても、パノビノスタットと併用することにより、癌細胞の細胞増殖抑制効果がさらに向上することが示された（図１４、図１５）。
ビンクリスチン単剤で癌細胞の細胞増殖抑制効果がまったく見られなかった濃度で、パノビノスタットと併用することにより、癌細胞の細胞増殖抑制効果が示された。特に、低濃度のビンクリスチンを用いた場合に、パノビノスタットとの併用効果が高いことが示された。
また、ビンクリスチン単剤で約７０％の癌細胞の細胞増殖抑制効果を示す濃度においても、パノビノスタットと併用することにより、癌細胞の細胞増殖抑制効果がさらに向上することが示された（図１４、図１５）。
実施例７（ヒト子宮癌由来細胞株ＨｅＬａ細胞）
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、０．５μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭおよび０．３μＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、０．５μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭおよび０．３μＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
ヒト子宮癌由来細胞株ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから入手した）を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
ヒト子宮癌由来細胞株ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから入手した）を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．ビンクリスチンおよびパノビノスタット単剤による細胞増殖抑制試験
ＨｅＬａ細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。また、パノビノスタットの最終濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭおよび０．０５μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
ＨｅＬａ細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタット最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭおよび０．０５μＭとビンクリスチン最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭおよび０．０３μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ａ．ビンクリスチンおよびパノビノスタット単剤による細胞増殖抑制試験
ＨｅＬａ細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。また、パノビノスタットの最終濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭおよび０．０５μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
ＨｅＬａ細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタット最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭおよび０．０５μＭとビンクリスチン最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭおよび０．０３μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
細胞増殖抑制試験のデータを解析し、相乗効果の指標としてＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）値を求めた。ＣＩ値は、ＣｏｍｐｕＳｙｎ社の「ＣｏｍｐｕＳｙｎ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｄｏｓｅ−Ｅｆｆｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｔｉｎｇ−Ｃｈａｏ Ｃｈｏｕ」を用いて算出した。
２．実験結果
パノビノスタットがほとんど殺癌細胞効果を示さない濃度とビンクリスチンが全く殺癌細胞効果を示さない濃度を併用しても劇的な殺癌細胞効果の増強が見られた（図１６〜図２１）。
またＣＩ値は下記表の通りであった。
パノビノスタットがほとんど殺癌細胞効果を示さない濃度とビンクリスチンが全く殺癌細胞効果を示さない濃度を併用しても劇的な殺癌細胞効果の増強が見られた（図１６〜図２１）。
またＣＩ値は下記表の通りであった。
これらの結果から、パノビノスタットとビンクリスチンとは癌細胞（ＨｅＬａ）の細胞増殖抑制について相乗効果を示すこと、及びその相乗効果はパノビノスタット及びビンクリスチンがそれぞれ低濃度である場合により顕著である傾向が示された。
実施例８（ヒト乳癌由来細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．３μＭ、０．５μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭおよび０．３μＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．３μＭ、０．５μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭおよび０．３μＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
ヒト乳癌由来細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（ＡＴＣＣから入手した）を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
ヒト乳癌由来細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（ＡＴＣＣから入手した）を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．ビンクリスチンおよびパノビノスタット単剤による細胞増殖抑制試験
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。また、パノビノスタットの最終濃度が０．０３μＭおよび０．０５μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタット最終濃度０．０３μＭおよび０．０５μＭとビンクリスチン最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭおよび０．０３μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ａ．ビンクリスチンおよびパノビノスタット単剤による細胞増殖抑制試験
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。また、パノビノスタットの最終濃度が０．０３μＭおよび０．０５μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタット最終濃度０．０３μＭおよび０．０５μＭとビンクリスチン最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭおよび０．０３μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
２．実験結果
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてもパノビノスタットに低濃度のビンクリスチンを併用させることで劇的な殺癌細胞効果の増強が見られた（図２２、図２３）。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてもパノビノスタットに低濃度のビンクリスチンを併用させることで劇的な殺癌細胞効果の増強が見られた（図２２、図２３）。
実施例９（正常細胞における細胞増殖抑制効果の検討）
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭおよび０．３μＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−（＋）−アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭおよび０．３μＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
マウス内皮細胞株２Ｈ１１細胞（ＡＴＣＣから入手した）を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
マウス内皮細胞株２Ｈ１１細胞（ＡＴＣＣから入手した）を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
２Ｈ１１細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
２Ｈ１１細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。最終濃度０．０１μＭパノビノスタット単独（ｐａｎｏ ｏｎｌｙ）、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ａ．ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
２Ｈ１１細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
２Ｈ１１細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。最終濃度０．０１μＭパノビノスタット単独（ｐａｎｏ ｏｎｌｙ）、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
２．実験結果
正常細胞である２Ｈ１１細胞において、ビンクリスチンとパノビノスタットとの併用は、細胞増殖抑制効果をほとんどあるいはまったく示さなかった。これらの結果から、パノビノスタットとビンクリスチンの併用に係る細胞増殖抑制効果は、癌細胞特異的であるとともに、正常細胞に対する毒性が低いことが示された。なお、ビンクリスチン単独、およびパノビノスタット単独も同様に、正常細胞に対する毒性は低いことが示された（図２４、図２５）。
正常細胞である２Ｈ１１細胞において、ビンクリスチンとパノビノスタットとの併用は、細胞増殖抑制効果をほとんどあるいはまったく示さなかった。これらの結果から、パノビノスタットとビンクリスチンの併用に係る細胞増殖抑制効果は、癌細胞特異的であるとともに、正常細胞に対する毒性が低いことが示された。なお、ビンクリスチン単独、およびパノビノスタット単独も同様に、正常細胞に対する毒性は低いことが示された（図２４、図２５）。
実施例１０（他のＨＤＡＣ阻害剤との比較）
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット、ボリノスタット、ベリノスタット、あるいはモセチノスタット ３００ μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−(＋)−アルギニン ９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液、５μＭのボリノスタット溶液、２μＭのベリノスタット溶液、１０ μＭのモセチノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭまたは１０μＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
１．実験方法
（サンプルの調製）
パノビノスタット、ボリノスタット、ベリノスタット、あるいはモセチノスタット ３００ μｇに対しＤＭＳＯ １０μＬ、Ｌ−(＋)−アルギニン ９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ−（＋）−アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液、５μＭのボリノスタット溶液、２μＭのベリノスタット溶液、１０ μＭのモセチノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭまたは１０μＭとなるようにＬ−（＋）−アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
ヒト結腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
ヒト結腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ. ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ２存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ． パノビノスタット併用による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。最終濃度０．０１μＭのパノビノスタット単独、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｃ． ボリノスタット併用による細胞増殖抑制試験
最終濃度０．５μＭのボリノスタット単独、ボリノスタット最終濃度０．５μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加した以外は「Ｂ．パノビノスタット併用による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で行い、生細胞数を算出した。
Ｄ． ベリノスタット併用による細胞増殖抑制試験
最終濃度０．２μＭのベリノスタット単独、ベリノスタット最終濃度０．２μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加した以外は「Ｂ．パノビノスタット併用による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で行い、生細胞数を算出した。
Ｅ． モセチノスタット併用による細胞増殖抑制試験
最終濃度１μＭのモセチノスタット単独、モセチノスタット最終濃度１μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加した以外は「Ｂ．パノビノスタット併用による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で行い、生細胞数を算出した。
Ａ. ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ２存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ． パノビノスタット併用による細胞増殖抑制試験
ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６−ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。最終濃度０．０１μＭのパノビノスタット単独、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ−８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｃ． ボリノスタット併用による細胞増殖抑制試験
最終濃度０．５μＭのボリノスタット単独、ボリノスタット最終濃度０．５μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加した以外は「Ｂ．パノビノスタット併用による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で行い、生細胞数を算出した。
Ｄ． ベリノスタット併用による細胞増殖抑制試験
最終濃度０．２μＭのベリノスタット単独、ベリノスタット最終濃度０．２μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加した以外は「Ｂ．パノビノスタット併用による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で行い、生細胞数を算出した。
Ｅ． モセチノスタット併用による細胞増殖抑制試験
最終濃度１μＭのモセチノスタット単独、モセチノスタット最終濃度１μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加した以外は「Ｂ．パノビノスタット併用による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で行い、生細胞数を算出した。
２．実験結果
パノビノスタットとビンクリスチンの併用は、他のＨＤＡＣ阻害剤（ボリノスタット、ベリノスタット、モセチノスタット）とビンクリスチンを併用した場合と比較して顕著に高い併用効果を示し、効果的に癌細胞の増殖を抑制した（図２６〜図２９）。
パノビノスタットとビンクリスチンの併用は、他のＨＤＡＣ阻害剤（ボリノスタット、ベリノスタット、モセチノスタット）とビンクリスチンを併用した場合と比較して顕著に高い併用効果を示し、効果的に癌細胞の増殖を抑制した（図２６〜図２９）。
実施例１１（２剤内封リポソーム）
（１）脂質組成検討
１．実験方法
パノビノスタットとビンクリスチンの定量法の確立
（リポソームの崩壊）
パノビノスタットとビンクリスチンを内封したリポソームをメタノールで崩壊させ、内封率を測定した。
（ＨＰＬＣ条件）
ＨＰＬＣ装置：
オートサンプラー Ｌ−２２００ ＨＩＴＡＣＨＩ
ＵＶ検出器 Ｌ−２４００ ＨＩＴＡＣＨＩ
ポンプ Ｌ−２１３０ ＨＩＴＡＣＨＩ
カラム Ｌ−２３５０ ＨＩＴＡＣＨＩ
カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ ＱＡ（４．６×１５０ｍｍ）
測定時間：４０ｍｉｎ
移動相：Ａ液 ０．１％リン酸
Ｂ液 アセトニトリル
０ ｍｉｎ Ａ／Ｂ＝１００／０
０→１０ ｍｉｎ Ａ／Ｂ＝１００／０→７０／３０
１０→２０ ｍｉｎ Ａ／Ｂ＝７０／３０→２０／８０
２０→３０ ｍｉｎ Ａ／Ｂ＝２０／８０→１００／０
３０→４０ ｍｉｎ Ａ／Ｂ＝１００／０→１００／０
注入量：１０μＬ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３５℃
検出波長：２９５ｎｍ
ＨＰＬＣ測定は、すべて上記条件で行った。
（１）脂質組成検討
１．実験方法
パノビノスタットとビンクリスチンの定量法の確立
（リポソームの崩壊）
パノビノスタットとビンクリスチンを内封したリポソームをメタノールで崩壊させ、内封率を測定した。
（ＨＰＬＣ条件）
ＨＰＬＣ装置：
オートサンプラー Ｌ−２２００ ＨＩＴＡＣＨＩ
ＵＶ検出器 Ｌ−２４００ ＨＩＴＡＣＨＩ
ポンプ Ｌ−２１３０ ＨＩＴＡＣＨＩ
カラム Ｌ−２３５０ ＨＩＴＡＣＨＩ
カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ ＱＡ（４．６×１５０ｍｍ）
測定時間：４０ｍｉｎ
移動相：Ａ液 ０．１％リン酸
Ｂ液 アセトニトリル
０ ｍｉｎ Ａ／Ｂ＝１００／０
０→１０ ｍｉｎ Ａ／Ｂ＝１００／０→７０／３０
１０→２０ ｍｉｎ Ａ／Ｂ＝７０／３０→２０／８０
２０→３０ ｍｉｎ Ａ／Ｂ＝２０／８０→１００／０
３０→４０ ｍｉｎ Ａ／Ｂ＝１００／０→１００／０
注入量：１０μＬ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３５℃
検出波長：２９５ｎｍ
ＨＰＬＣ測定は、すべて上記条件で行った。
２剤内封リポソームの作製
（脂質の溶解）
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）は１００ｍＭとなるようにクロロホルムに溶解した。
（リポソーム組成（モル比））
ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２
ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２
（２剤内封リポソームの調製）
１００ｍＭのＤＰＰＣ、ＨＳＰＣあるいはＤＳＰＣ ３００μＬと１００ｍＭのＣｈｏｌ ２００μＬをナス型フラスコに分取し、ロータリーエバポレーターで減圧下クロロホルムを留去し、１時間以上真空ポンプにて減圧乾固した。２５０ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ３．０）を１ｍＬ加えて水和後、液体窒素を用いて凍結融解を３回行った。押出機（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用し、１００ｎｍ孔径のポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｔｒａｃｋ−Ｔｅｃｈ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｗｈａｔｍａｎ Ｌｔｄ．）を用いてエクストルージョンによりリポソームのサイズを約１００ｎｍに調整した。リン酸バッファ（ｐＨ７．４）にて希釈し、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）後、上清を除去し、沈殿したリポソームをビンクリスチン２００μｇを溶解したＰＢＳ ８００μＬで再懸濁し、振盪インキュベート（８０℃、６５０ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）した。次に、パノビノスタット１．０４８ｍｇを溶解したＤＭＳＯ ２０μＬを加えボルテックスし、振盪インキュベート（８０℃、６５０ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）し、室温で冷却した。その後、再び超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）し、上清を除去し、沈殿したリポソームをＰＢＳ １ｍＬで再懸濁した。リポソーム：メタノール＝２０μＬ：３８０μＬで混合し、ＨＰＬＣでパノビノスタットとビンクリスチンを定量した。
（脂質の溶解）
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）は１００ｍＭとなるようにクロロホルムに溶解した。
（リポソーム組成（モル比））
ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２
ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２
（２剤内封リポソームの調製）
１００ｍＭのＤＰＰＣ、ＨＳＰＣあるいはＤＳＰＣ ３００μＬと１００ｍＭのＣｈｏｌ ２００μＬをナス型フラスコに分取し、ロータリーエバポレーターで減圧下クロロホルムを留去し、１時間以上真空ポンプにて減圧乾固した。２５０ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ３．０）を１ｍＬ加えて水和後、液体窒素を用いて凍結融解を３回行った。押出機（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用し、１００ｎｍ孔径のポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｔｒａｃｋ−Ｔｅｃｈ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｗｈａｔｍａｎ Ｌｔｄ．）を用いてエクストルージョンによりリポソームのサイズを約１００ｎｍに調整した。リン酸バッファ（ｐＨ７．４）にて希釈し、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）後、上清を除去し、沈殿したリポソームをビンクリスチン２００μｇを溶解したＰＢＳ ８００μＬで再懸濁し、振盪インキュベート（８０℃、６５０ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）した。次に、パノビノスタット１．０４８ｍｇを溶解したＤＭＳＯ ２０μＬを加えボルテックスし、振盪インキュベート（８０℃、６５０ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）し、室温で冷却した。その後、再び超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）し、上清を除去し、沈殿したリポソームをＰＢＳ １ｍＬで再懸濁した。リポソーム：メタノール＝２０μＬ：３８０μＬで混合し、ＨＰＬＣでパノビノスタットとビンクリスチンを定量した。
２．実験結果
パノビノスタットおよびビンクリスチンの内封率は、リポソームの組成がＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２である場合に最も高く、リポソームの組成がＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２である場合に比較的高く、リポソームの組成がＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２である場合に比較的低いことが示された（図３０）。
パノビノスタットおよびビンクリスチンの内封率は、リポソームの組成がＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２である場合に最も高く、リポソームの組成がＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２である場合に比較的高く、リポソームの組成がＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２である場合に比較的低いことが示された（図３０）。
実施例１２（２剤内封リポソームの作製法の改良）
１．実験方法
パノビノスタットとビンクリスチンの定量法の確立
以下に記載する事項以外は実施例９と同様にしてリポソームを作製し、パノビノスタットおよびビンクリスチンの内封率を測定した。
２剤内封リポソームの作製
（脂質の溶解）
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）は１００ｍＭとなるようにクロロホルムに溶解した。
（リポソーム組成）
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２（モル比）
（２剤内封リポソームの調製）
１００ｍＭのＤＳＰＣ ３００μＬと１００ｍＭのＣｈｏｌ ２００μＬをナス型フラスコに分取し、ロータリーエバポレーターで減圧下クロロホルムを留去し、１時間以上真空ポンプにて減圧乾固した。２５０ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ３．０）を１ｍＬ加えて水和後、液体窒素を用いて凍結融解を３回行った。押出機（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用し、１００ｎｍ孔径のポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｔｒａｃｋ−Ｔｅｃｈ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｗｈａｔｍａｎ Ｌｔｄ．）を用いてエクストルージョンによりリポソームのサイズを約１００ｎｍに調整した。ＰＢＳにて希釈し、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）後、上清を除去し、沈殿したリポソームをＰＢＳ８００μＬで再懸濁した。パノビノスタット１．０４８ｍｇを２０μＬのＤＭＳＯに溶解したものにこのリポソーム再懸濁液を少量ずつボルテックスしながら加え、全量混和した後約２分間ボルテックスし、振盪インキュベート（８０℃、６５０ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）した後氷中で急冷した。その後、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）し、上清の体積を測定し、沈殿したリポソームをＰＢＳ ７００μＬで再懸濁した（パノビノスタット内封リポソーム）。ビンクリスチン２４４μｇをＰＢＳ １５０μＬで溶解し、パノビノスタット内封リポソームを少量ずつボルテックスしながら加え、全量混和した後約２分間ボルテックスし、振盪インキュベート（８０℃、６５０ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）した後氷中で急冷した。その後、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）し、上清の体積を測定し、沈殿したリポソームをＰＢＳ ８４０μＬで再懸濁した（２剤内封リポソーム）。２剤内封リポソーム：メタノール＝２０μＬ：３８０μＬで混合し、ＨＰＬＣでパノビノスタットとビンクリスチンを定量した。
１．実験方法
パノビノスタットとビンクリスチンの定量法の確立
以下に記載する事項以外は実施例９と同様にしてリポソームを作製し、パノビノスタットおよびビンクリスチンの内封率を測定した。
２剤内封リポソームの作製
（脂質の溶解）
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）は１００ｍＭとなるようにクロロホルムに溶解した。
（リポソーム組成）
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２（モル比）
（２剤内封リポソームの調製）
１００ｍＭのＤＳＰＣ ３００μＬと１００ｍＭのＣｈｏｌ ２００μＬをナス型フラスコに分取し、ロータリーエバポレーターで減圧下クロロホルムを留去し、１時間以上真空ポンプにて減圧乾固した。２５０ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ３．０）を１ｍＬ加えて水和後、液体窒素を用いて凍結融解を３回行った。押出機（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用し、１００ｎｍ孔径のポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｔｒａｃｋ−Ｔｅｃｈ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｗｈａｔｍａｎ Ｌｔｄ．）を用いてエクストルージョンによりリポソームのサイズを約１００ｎｍに調整した。ＰＢＳにて希釈し、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）後、上清を除去し、沈殿したリポソームをＰＢＳ８００μＬで再懸濁した。パノビノスタット１．０４８ｍｇを２０μＬのＤＭＳＯに溶解したものにこのリポソーム再懸濁液を少量ずつボルテックスしながら加え、全量混和した後約２分間ボルテックスし、振盪インキュベート（８０℃、６５０ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）した後氷中で急冷した。その後、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）し、上清の体積を測定し、沈殿したリポソームをＰＢＳ ７００μＬで再懸濁した（パノビノスタット内封リポソーム）。ビンクリスチン２４４μｇをＰＢＳ １５０μＬで溶解し、パノビノスタット内封リポソームを少量ずつボルテックスしながら加え、全量混和した後約２分間ボルテックスし、振盪インキュベート（８０℃、６５０ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）した後氷中で急冷した。その後、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）し、上清の体積を測定し、沈殿したリポソームをＰＢＳ ８４０μＬで再懸濁した（２剤内封リポソーム）。２剤内封リポソーム：メタノール＝２０μＬ：３８０μＬで混合し、ＨＰＬＣでパノビノスタットとビンクリスチンを定量した。
２．実験結果
内封率
パノビノスタット：６０．１７％
ビンクリスチン：７４．２１％
内封率
パノビノスタット：６０．１７％
ビンクリスチン：７４．２１％
Claims (15)
- （Ａ）パノビノスタット又はその塩と、（Ｂ）チューブリン阻害剤とを組み合わせてなる、癌の予防または治療剤。
- （Ａ）パノビノスタット又はその塩と、（Ｂ）チューブリン阻害剤とを併用投与するものである請求項１記載の癌の予防または治療剤。
- （Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤とを含有する癌の予防または治療用医薬組成物である請求項１記載の癌の予防または治療剤。
- 前記チューブリン阻害剤が、ビンクリスチン又はその塩である、請求項１〜３のいずれか１項記載の癌の予防または治療剤。
- 前記癌が、固形癌である、請求項１〜４のいずれか１項記載の癌の予防または治療剤。
- 前記癌が、血液癌である、請求項１〜４のいずれか１項記載の癌の予防または治療剤。
- （Ａ）パノビノスタット又はその塩及び（Ｂ）チューブリン阻害剤がリポソームに内包されているリポソーム製剤である請求項３〜６のいずれか１項記載の癌の予防または治療剤。
- 前記リポソームの組成が、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、およびジパルミトイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせからなる群から選択される、請求項７記載の癌の予防または治療剤。
- 前記リポソームの組成が、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせであり、前記水素化ダイズホスファチジルコリンと前記コレステロールとのモル比が３：２である、請求項８記載の癌の予防または治療剤。
- 前記リポソームの組成が、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせであり、前記ジステアロイルホスファチジルコリンと前記コレステロールとのモル比が３：２である、請求項８記載の癌の予防または治療剤。
- 経口投与製剤または経静脈投与製剤である、請求項３〜６のいずれか１項記載の癌の予防または治療剤。
- 経口投与製剤または経静脈投与製剤である、請求項７〜１０のいずれか１項記載の癌の予防または治療剤。
- ジパルミトイルホスファチジルコリン、水素化ダイズホスファチジルコリンまたはジステアロイルホスファチジルコリンと、コレステロールとを用いてリポソームを調製する工程、および、
前記リポソームにパノビノスタットを混合する工程の後に、チューブリン阻害剤を混合する工程、
を含む、リポソーム製剤の製造方法。 - 前記チューブリン阻害剤が、ビンクリスチン又はその塩である、請求項１３記載の製造方法。
- 前記リポソームを調製する工程において、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとを用いる、請求項１３又は１４記載の製造方法。
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- 2019-03-01 WO PCT/JP2019/008204 patent/WO2019168177A1/ja active Application Filing
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| WO2019168177A1 (ja) | 2019-09-06 |
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