WO2019168177A1 - 癌の予防または治療剤 - Google Patents

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WO2019168177A1
WO2019168177A1 PCT/JP2019/008204 JP2019008204W WO2019168177A1 WO 2019168177 A1 WO2019168177 A1 WO 2019168177A1 JP 2019008204 W JP2019008204 W JP 2019008204W WO 2019168177 A1 WO2019168177 A1 WO 2019168177A1
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cancer
panobinostat
cholesterol
polyethylene glycol
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PCT/JP2019/008204
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知浩 浅井
直人 奥
水島　徹
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静岡県公立大学法人
株式会社Ｌｔｔバイオファーマ
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Definitions

  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for cancer.
  • Panobinostat is a kind of non-selective histone deacetylase inhibitor (HDAC inhibitor), and is used as a therapeutic agent for relapsed or refractory multiple myeloma (Non-patent Document 1).
  • HDAC inhibitor non-selective histone deacetylase inhibitor
  • Panobinostat an HDAC inhibitor
  • Vorinostat is also known as an HDAC inhibitor, but vorinostat is only recognized as having a therapeutic effect on cutaneous T-cell lymphoma.
  • tubulin inhibitors typified by vincristine inhibit cell mitosis by inhibiting the polymerization reaction of microtubules, and are used for soft tissue tumors, blood tumors, and the like (Non-patent Document 2). .
  • an object of the present invention is to provide a novel anticancer drug combination therapy that can provide an excellent anticancer effect by using two kinds of anticancer drugs in combination and has few side effects.
  • the present inventor has examined the anticancer effect by the combined administration of panobinostat or a salt thereof and another anticancer agent, and has a synergistically excellent anticancer effect by the combined use of panobinostat or a salt thereof and a tubulin inhibitor.
  • the growth-suppressing effect on various solid cancer cells that are not obtained by a single administration can be obtained.
  • it has been found that such a synergistic anticancer effect is exhibited by combining panobinostat or a salt thereof with an extremely low dose of a tubulin inhibitor.
  • the inventors have found that if these two kinds of components are encapsulated in liposomes, a liposome preparation containing two components having different solubility can be obtained, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following inventions [1] to [20].
  • a prophylactic or therapeutic agent for cancer comprising a combination of (A) panobinostat or a salt thereof and (B) a tubulin inhibitor.
  • the composition of the liposome is selected from the group consisting of a combination of phospholipid and cholesterol, a combination of polyethylene glycol modified phospholipid and cholesterol, and a combination of phospholipid, polyethylene glycol modified phospholipid and cholesterol, [7] The preventive or therapeutic agent for cancer as described.
  • the phospholipid is selected from the group consisting of distearoyl phosphatidylcholine, hydrogenated soybean phosphatidylcholine, and dipalmitoyl phosphatidylcholine
  • the polyethylene glycol modified phospholipid is polyethylene glycol modified distearoyl phosphatidylethanolamine, polyethylene glycol modified hydrogen.
  • the composition of the liposome is a combination of distearoylphosphatidylcholine and cholesterol, a combination of hydrogenated soybean phosphatidylcholine and cholesterol, a combination of dipalmitoylphosphatidylcholine and cholesterol, a combination of polyethylene glycol-modified distearoylphosphatidylethanolamine and cholesterol , Polyethylene glycol modified hydrogenated soybean phosphatidylethanolamine and cholesterol combination, polyethylene glycol modified dipalmitoyl phosphatidylethanolamine and cholesterol combination, distearoyl phosphatidylcholine and polyethylene glycol modified distearoyl phosphatidylethanolamine and cholesterol combination.
  • the prevention or prevention of cancer according to [7] selected from the group consisting of a combination of distea
  • a method for producing a liposome preparation comprising: [16] The production method of [15], wherein the tubulin inhibitor is vincristine or a salt thereof.
  • panobinostat or a salt thereof and a tubulin inhibitor When combined with panobinostat or a salt thereof and a tubulin inhibitor, a synergistically superior anticancer effect can be obtained.
  • the dose of tubulin inhibitor can be dramatically reduced, so the combination of the present invention greatly reduces or eliminates side effects caused by tubulin inhibitors in particular. Therefore, the administration can be continued for a long time, and as a result, a further excellent anticancer effect can be obtained.
  • a liposome preparation containing two components, panobinostat and tubulin inhibitor is used, the two components can be efficiently administered simultaneously, so that an excellent anticancer effect can be obtained.
  • action by combined use with panobinostat and a tubulin inhibitor is shown.
  • the observation result of a microtubule at the time of combined use of panobinostat and vincristine is shown.
  • the observation result of a microtubule at the time of combined use of panobinostat and vincristine is shown (characteristic cell).
  • the time-lapse analysis result of the cell death of HCT116 cell at the time of combined use of panobinostat and vincristine is shown.
  • the HCT116 cell growth inhibitory effect in the case of panobinostat single administration and vincristine single administration is shown.
  • the effect with respect to HCT116 by combined use of panobinostat 0.003 micromol and vincristine is shown.
  • the effect with respect to HCT116 by combined use of panobinostat 0.01 micromol and vincristine is shown.
  • the effect with respect to HCT116 by combined use of vincristine 0.003 micromol and panobinostat is shown.
  • the effect with respect to HCT116 by combined use of vincristine 0.01 micromol and panobinostat is shown.
  • the effect with respect to HCT116 by combined use of vincristine 0.03 micromol and panobinostat is shown.
  • the effect of vincristine alone (nM order) on HCT116 cells is shown.
  • the effect by combined use of panobinostat 0.01 ⁇ M and vincristine (nM order) on HCT116 cells is shown.
  • panobinostat 0.01 ⁇ M and vincristine (nM order or less) on HCT116 cells The effect by combined use of panobinostat 0.01 ⁇ M and vincristine (pM order or less) on HCT116 cells is shown.
  • the effect of vincristine alone on HT1080 cells is shown.
  • the effect by combined use of panobinostat 0.01 ⁇ M and vincristine on HT1080 cells is shown.
  • panobinostat single administration with respect to a HeLa cell is shown.
  • the effect of vincristine single administration with respect to a HeLa cell is shown.
  • the effect of combined administration of vincristine and panobinostat (0.003 ⁇ M) on HeLa cells is shown.
  • the effect of combined administration of vincristine and panobinostat (0.01 ⁇ M) on HeLa cells is shown.
  • the effect of the combined administration of vincristine and panobinostat (0.03 ⁇ M) on HeLa cells is shown.
  • the effect of the combined administration of vincristine and panobinostat (0.05 ⁇ M) on HeLa cells is shown.
  • the effect of the combined administration of vincristine and panobinostat (0.03 ⁇ M) on MDA-MB-231 cells is shown.
  • the effect of combined administration of vincristine and panobinostat (0.05 ⁇ M) on MDA-MB-231 cells is shown.
  • action of a vincristine single administration with respect to a normal cell is shown.
  • the effect of vincristine and panobinostat combined administration with respect to a normal cell is shown.
  • the effect by combined use of panobinostat and vincristine on HCT116 cells is shown.
  • the effect by combined use of vorinostat and vincristine on HCT116 cells is shown.
  • the effect by combined use of belinostat and vincristine on HCT116 cells is shown.
  • the effect by the combined use of mocetinostat and vincristine on HCT116 cells is shown.
  • the effect by combined use of panobinostat and vincristine on mouse leukemia cell line p388 cells is shown.
  • the encapsulation rate of panobinostat and vincristine in liposomes is shown.
  • panobinostat and vincristine The effect of combined use of panobinostat and vincristine on Colon26 NL-17 cell subcutaneous tumor-bearing mice is shown.
  • the transition of body weight in p388 cancer-bearing mice is shown.
  • the survival rate improvement effect by combined use of panobinostat and vincristine for p388 cancer-bearing mice is shown.
  • the active ingredient of the preventive or therapeutic agent for cancer of the present invention is a combination of (A) panobinostat or a salt thereof and (B) a tubulin inhibitor.
  • Panobinostat or a salt thereof
  • Panobinostat is one of HDAC inhibitors as described above, and has the chemical name (2E) -N-hydroxy-3- [4-( ⁇ [2- (2-methyl-1H- Indol-3-yl) ethyl] amino ⁇ methyl) phenyl] prop-2-enamide.
  • panobinostat salts include acid addition salts such as lactate, acetate, hydrochloride and sulfate, but lactate is preferred.
  • component (A) is also referred to as “component (A)”.
  • Tubulin inhibitor is a component that inhibits the polymerization reaction of microtubules, and examples thereof include, but are not limited to, vinca alkaloid compounds such as vincristine, vinblastine, vinorelbine, vindesine, or salts thereof And taxane compounds such as paclitaxel and docetaxel, colchicine, oxybendazole and the like. Of these, vinca alkaloid compounds or salts thereof are preferred, and vincristine or salts thereof are particularly preferred.
  • Vincristine has the chemical name methyl (3aR, 4R, 5S, 5aR, 10bR, 13aR) -4-acetoxy-3a-ethyl-9-[(5S, 7S, 9S) -5-ethyl-5-hydroxy-9-methoxy.
  • the cancer preventive or therapeutic agent of the present invention is a pharmaceutical comprising a combination of the component (A) and the component (B), and may be in any form that can use these components in combination.
  • each component may be formulated into each dosage form, or formulated into a single dosage form (ie, formulated as a combination drug)
  • each preparation may be manufactured and sold together in one package suitable for combined use, or each preparation may be manufactured and sold separately in separate packages.
  • each preparation can be a kit preparation containing instructions for use in which the components (A) and (B) are administered together.
  • the “instruction for use” may be anything that describes the dosage.
  • kit preparation including instructions for use is a description of the use of the kit preparation package together with the cancer preventive or therapeutic agent of the present invention even if the instruction manual is printed and attached to the kit preparation package.
  • the book may be enclosed.
  • panobinostatin is already sold as an oral administration formulation, so it can be used as it is, and vincristine is already sold as an intravenous administration formulation.
  • the form can be used as it is.
  • a pharmaceutical composition containing component (A) and component (B), for example, a formulation containing liposomes containing two components as described below, may be used. It is good also as another dosage form.
  • Component (A) can be included in the medicament of the present invention in an amount of 0.1 mg to 100 mg, preferably 1 mg to 50 mg, more preferably 5 mg to 25 mg, and even more preferably 10 mg to 20 mg.
  • the present invention can exhibit a preferable anticancer action, and a synergistic effect with the component (B) is more remarkably exhibited.
  • the component (A) when used in combination with the component (B), the component (A) alone has an anticancer effect in an amount (for example, 1/10 to 1/2) that is less than the amount that exhibits an anticancer effect. May indicate. Therefore, the side effect of the component (A) may be reduced by using it together with the component (B).
  • Component (A) is preferably added to the cells to be treated at a concentration of 0.0001 ⁇ M to 1 ⁇ M, more preferably 0.001 ⁇ M to 0.1 ⁇ M, and even more preferably 0.001 ⁇ M to 0.05 ⁇ M in an in vitro or ex vivo system. It can be included in the medicament of the present invention in the contact amount.
  • Component (A) preferably has a blood concentration of 0.01 ng / mL to 100 ng / mL, more preferably 0.1 ng / mL to 50 ng / mL, preferably 1 ng / mL to 25 ng / mL in an in vivo system. Can be included in the medicament of the present invention.
  • the present invention can exhibit a preferable anticancer action, and a synergistic effect with the component (B) is more remarkably exhibited.
  • the component (A) When the component (A) is used in combination with the component (B), the component (A) exhibits an anticancer effect at a concentration (for example, 1/10 to 1/2) lower than the concentration at which the component (A) alone exhibits an anticancer effect. there is a possibility. Therefore, the side effect of the component (A) may be reduced by using it together with the component (B).
  • Component (B) is contained in the medicament of the present invention in an amount of 10 mg or less, preferably 1 mg or less, 100 ⁇ g or less, 10 ⁇ g or less, 1 ⁇ g or less, 100 ng or less, 10 ng or less, 1 ng or less, 1 pg or less, 1 fg or less, 1 ag or less. be able to.
  • Component (B) is included in the present invention in an amount of more than 0 g, preferably 1 ag or more, 1 fg or more, 1 pg or more, 1 ng or more, 10 ng or more, 100 ng or more, 1 ⁇ g or more, 10 ⁇ g or more, 100 ⁇ g or more, 1 mg or more. be able to.
  • Component (B) can be included in the medicament of the present invention in an amount of, for example, 1 ag to 10 mg, preferably 1 fg to 1 mg, more preferably 1 ng to 100 ⁇ g, still more preferably 100 ng to 10 ⁇ g.
  • Component (B) is included in the medicament of the present invention in an amount that makes contact with the cells to be treated at a concentration of more than 0 M and 10 ⁇ M or less, preferably 1 fM to 1 ⁇ M, more preferably 1 pM to 1 nM in an in vitro or ex vivo system. be able to.
  • Component (B) is greater than 0 g / mL to 100 ng / mL, preferably 1 ag / mL to 10 ng / mL, more preferably 1 fg / mL to 1 ng / mL, and even more preferably 1 pg / mL to 1 ng / mL in an in vivo system. It can be included in the medicament of the present invention in an amount of blood concentration of mL. When the component (B) is in the above range, the present invention can exhibit a preferable anticancer action, and a synergistic effect with the component (A) is more remarkably exhibited.
  • component (B) by combination with the component (A), component (B) less than 1 in 10 2 minutes when used in monotherapy, for example, 10 one-third or less, 1 or less of 10 4 minutes , 1 of 10 5 minutes or less, 1 of 106 minutes or less, 1 or less of 107 minutes, in an amount of less than one 10 8 minutes, it is possible to exhibit anti-cancer effects. Accordingly, the side effects of component (B) can be greatly reduced or reduced to a level not shown at all when used in combination with component (A).
  • the present invention can exhibit a preferable anticancer action, and the synergistic effect of the component (A) and the component (B). Is more prominent. Accordingly, the side effects of component (B) can be greatly reduced or reduced to a level not shown at all when used in combination with component (A).
  • component (B) enhances the anticancer effect of component (A).
  • component (A) enhances the anticancer effect of component (B).
  • component (A) and component (B) By administering component (A) and component (B), a method for preventing or treating cancer can be provided.
  • the administration of component (A) and component (B) may or may not be simultaneous.
  • component (A) and component (B) are administered to an animal, preferably a mammal, more preferably a primate, most preferably a human.
  • the administration route of a component (A) and a component (B) may be the same, and may differ.
  • the route of administration may be any route including oral, intravenous, transarterial, subcutaneous, intramuscular, transpulmonary.
  • the administration of component (A) is oral administration and the administration of component (B) is intravenous administration.
  • both component (A) and component (B) are oral administration.
  • component (A) and component (B) are both intravenously administered.
  • the component (B) is used in combination with the component (A), so that the amount is much lower than that of the component (B) single agent (for example, 10 1/2 or less, 10 3 or less or less). , 1 of 10 4 minutes or less, 1 of 10 5 minutes or less, 1 of 106 minutes or less, 1 of 10 7 minutes or less, because they exhibit anticancer activity in 1 below) 10 8 minutes, with the component (a) It can be formulated.
  • the medicament of the present invention can be formulated to be suitable for any route including oral, intravenous, transarterial, subcutaneous, intramuscular and transpulmonary.
  • the preparation of the present invention can be formulated into any dosage form including, for example, aerosols, solutions, capsules, granules, pills, suppositories, tablets, injections, and powders.
  • the formulation of the present invention comprising component (A) and component (B) is a liposome formulation. Since this invention is a liposome formulation, it can contain efficiently the component (A) and component (B) from which solubility differs.
  • the cancer types that are targets of the cancer preventive or therapeutic agent of the present invention include not only blood cancer but also solid cancer.
  • Hematological cancers include leukemia, malignant lymphoma and multiple myeloma.
  • Specific examples of solid cancer include head and neck cancer, fire extinguisher cancer (esophageal cancer, gastric cancer, duodenal cancer, liver cancer, biliary tract cancer (eg, gallbladder / bile duct cancer), pancreatic cancer, small intestine cancer, and colon cancer (colorectal cancer).
  • cancer colon cancer (including colon adenocarcinoma), rectal cancer, gastrointestinal stromal tumor), lung cancer (non-small cell lung cancer, small cell lung cancer), breast cancer, ovarian cancer, uterine cancer (cervical cancer, uterus) Body cancer), renal cancer, bladder cancer, prostate cancer, skin cancer, sarcoma (fibrosarcoma, synovial sarcoma, osteosarcoma, chondrosarcoma, etc.) and the like.
  • the cancer includes not only the primary lesion but also cancer that has metastasized to other organs (eg, liver).
  • component (A) or component (B) alone is not effective for solid cancers alone, a preventive or therapeutic agent for cancer comprising the combination of component (A) and component (B) of the present invention is described later. As shown in the examples, it exhibits an excellent growth inhibitory effect on many solid cancers.
  • the dosage form of the preventive or therapeutic agent for cancer of the present invention may be a dosage form in which each component is usually employed, but is preferably a pharmaceutical composition (compound) containing both components.
  • examples of the pharmaceutical composition containing the component (A) and the component (B) include oral preparations (tablets, coated tablets, powders, granules, capsules, liquids, etc.), injections, suppositories, patches, An ointment and the like can be exemplified, but an oral administration preparation or an intravenous administration preparation is preferable.
  • These dosage forms can be prepared by a generally known method using a pharmaceutically acceptable carrier in addition to component (A) and component (B).
  • Such carriers include various types commonly used for ordinary drugs, such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, diluents, solubilizers, suspending agents, isotonic agents, pH.
  • examples include regulators, buffers, stabilizers, colorants, flavoring agents, and flavoring agents.
  • a capsule preparation containing the component (A) and the component (B) is preferable. Since the present invention is a capsule, the component (A) and the component (B) can be contained in a preferable quantitative ratio or molar ratio, and the anticancer effect of the present invention can be efficiently exhibited.
  • the capsule may be a hard capsule or a soft capsule, but a hard capsule is preferred.
  • the capsule encapsulant is, for example, as a powder, component (A) 1 mg to 20 mg (preferably 10 mg or 15 mg), component (B) 100 ng to 10 ⁇ g (preferably 1 ⁇ g or 1.5 ⁇ g), D-mannitol 10 mg It may be ⁇ 1000 mg (preferably 100 mg), cellulose 1 mg ⁇ 50 mg (preferably 35 mg), partially pregelatinized starch 1 mg ⁇ 3 mg (preferably 2.5 mg), and magnesium stearate 1 mg ⁇ 5 mg (preferably 3 mg).
  • a liposome preparation in which the component (A) and the component (B) are encapsulated in the liposome is also preferable.
  • the liposome preparation is a preparation in which the component (A) and the component (B) are encapsulated in a liposome, that is, a lipid bilayer membrane.
  • phospholipids that form liposomes include one or more selected from phospholipids and polyethylene glycol-modified phospholipids. In addition to these phospholipids, cholesterol having a membrane stabilizing action can be used in combination.
  • Phospholipids that form liposomes include (1) phospholipids with saturated or unsaturated diacyl groups, such as egg yolk lecithin, dimyristoyl phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylcholine, distearoyl phosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylcholine, hydrogenated soybean phosphatidylcholine, 2) Either an acyl group in which the hydrophilic group is ethanolamine, serine, inositol, or glycerol is saturated or unsaturated phospholipid, and (3) a phospholipid in which the acyl group is a lyso form, of course, a combination of the above may be used. .
  • diacyl groups such as egg yolk lecithin, dimyristoyl phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylcholine, distearoyl phosphatidylcholine, dioleoyl
  • polyethylene glycol modified phospholipid examples include polyethylene glycol modified diacylphosphatidylethanolamine, polyethylene glycol modified diacylphosphatidylglycerol, and the like.
  • the polyethylene glycol-modified form of the phospholipid includes methoxypolyethyleneglycol-modified diacylphosphatidylethanolamine or polyethyleneglycoloxycarbonyldiacylphosphatidylethanolamide.
  • Use of polyethylene glycol-modified phospholipid is preferable because the retention in blood of liposomes is improved.
  • polyethylene glycol modified phospholipids include polyethylene glycol modified distearoyl phosphatidylethanolamine, methoxypolyethylene glycol modified distearoyl phosphatidylethanolamine, polyethylene glycol modified hydrogenated soybean phosphatidylethanolamine and polyethylene glycol modified dipalmitoyl phosphatidylethanolamine. It is done.
  • liposome-forming lipids include a combination of phospholipid and cholesterol, a combination of polyethylene glycol modified phospholipid and cholesterol, or a phospholipid and polyethylene glycol modified phospholipid in terms of the encapsulation rate of component (A) and component (B).
  • a combination of lipid and cholesterol is preferred.
  • a combination of distearoylphosphatidylcholine and cholesterol, a combination of hydrogenated soybean phosphatidylcholine and cholesterol, a combination of distearoylphosphatidylcholine and polyethylene glycol-modified distearoylphosphatidyl, ethanolamine and cholesterol is more preferable, and distearoylphosphatidylcholine and cholesterol.
  • distearoylphosphatidylcholine and cholesterol is more preferable.
  • distearoylphosphatidylcholine and cholesterol is more preferable.
  • distearoylphosphatidylcholine and cholesterol is more preferable.
  • distearoylphosphatidylcholine and cholesterol is more preferable.
  • distearoylphosphatidylcholine and cholesterol is more preferable.
  • distearoylphosphatidylcholine and cholesterol is more preferable.
  • distearoylphosphatidylcholine and cholesterol is more preferable.
  • the molar ratio of phospholipid to cholesterol is preferably 10: 1 to 10:10, more preferably 5: 1 to 5: 5, from the viewpoint of the encapsulation rate of component (A) and component (B). 2: 1 to 4: 3 is more preferable, and 3: 2 is particularly preferable.
  • the molar ratio of the polyethylene glycol-modified phospholipid to cholesterol is improved in the retention of liposomes in the blood in terms of the encapsulation ratio of component (A) and component (B). From this point, 0.005: 1 to 1: 1 is preferable, 0.01: 1 to 0.5: 1 is more preferable, and 0.1: 1 to 0.2: 1 is still more preferable.
  • the component (A) and component (B) from which solubility differs can be efficiently delivered to a treatment site by a preferable molar ratio.
  • Examples of the method for producing a liposome preparation include a hydration method, a reverse phase evaporation method, an ultrasonic treatment method, an ethanol injection method, a French press method, an ether injection method, and a freeze-thaw method.
  • the component (A) and the component (B) are encapsulated in the liposome, the component (A) is encapsulated by adopting means for encapsulating the component (A) and then encapsulating the component (B). And the encapsulation rate of both the component (B) is improved.
  • a step of preparing liposomes using one or more selected from the group consisting of phospholipids and polyethylene glycol-modified phospholipids, and cholesterol By adopting the step of mixing the component (B) after the step of mixing the component (A) with the liposome, a liposome preparation with improved encapsulation rate of both the component (A) and the component (B) is obtained. It is done.
  • the liposome preparation containing the component (A) and the component (B) of the present invention has a high encapsulation rate of the active component, the component (A) and the component (B) can be efficiently administered.
  • the liposome preparation containing the component (A) and the component (B) of the present invention can be used for various administration means including oral administration and intravenous administration, and is useful as a preventive or therapeutic agent for cancer. .
  • Examples of the preparation of the preventive or therapeutic agent for cancer of the present invention include a combination of a preparation selected from (A-1) to (A-3) and a preparation selected from (B-1) and (B-2), or Examples of the preparation include (C-1) or (C-2). These formulations can be formulated according to the methods of the present invention or methods well known to those skilled in the art.
  • Panobinostat-containing capsules Panobinostat is mixed with powders or granules containing saccharides (for example, D-mannitol), cellulose, (partially pregelatinized) starch and magnesium stearate into gelatin capsules (for example, titanium oxide, blue No. 1 and three Capsules filled with iron dioxide.
  • A-2) Panobinostat-containing tablet A tablet containing panobinostat containing a sugar (eg, D-mannitol), cellulose, (partially pregelatinized) starch, and magnesium stearate.
  • panobinostat-containing injection for intravenous administration
  • panobinostat eg, containing distearoylphosphatidylcholine, cholesterol and methoxypolyethyleneglycol-modified distearoylphosphatidylethanolamine.
  • Vincristine-containing injection for intravenous administration
  • a freeze-dried preparation containing vincristine and lactose hydrate.
  • (B-2) Vincristine-containing injection (for intravenous administration) A liposome-containing preparation containing vincristine (for example, containing distearoylphosphatidylcholine, cholesterol and methoxypolyethyleneglycol-modified distearoylphosphatidylethanolamine).
  • (C-1) Two-agent-encapsulated liposome preparation A preparation containing liposome (including distearoylphosphatidylcholine and cholesterol) containing panobinostat and vincristine.
  • C-2 Two-encapsulated liposome preparation A preparation containing panobinostat and vincristine (for example, containing distearoylphosphatidylcholine, cholesterol and methoxypolyethyleneglycol-modified distearoylphosphatidylethanolamine).
  • panobinostat for example, containing distearoylphosphatidylcholine, cholesterol and methoxypolyethyleneglycol-modified distearoylphosphatidylethanolamine.
  • Example 1 Search for combination anticancer drug with panobinostat.
  • Experimental Method Screening for a combined anticancer agent was performed using as an index the decrease in the survival rate of cancer cells due to the combined use of two agents with panobinostat.
  • LTT Biopharma approved drug library obtained from LTT Biopharma, Inc.
  • Cells used Colon26 NL-17 mouse colon cancer cell line (obtained from Cancer Research Center Cancer Chemotherapy Center)
  • HDAC inhibitor Panobinostat Negative control: Untreated Control: Panobinostat added alone (1.0 ⁇ M)
  • Sample group group added with panobinostat (0.01 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 1.0 ⁇ M) and pre-approved drug library compound (1.0 ⁇ M) Evaluation: Colon26 NL-17 mouse colon cancer cell line at 37 ° C., 5% CO 2 and cultured in the presence of 20% O 2 .
  • Inactivated fetal bovine serum (FBS) was added to D-MEM (high glucose) so as to be 10%, and further cultured using a medium supplemented with 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin. 24 hours after seeding the Colon 26 NL-17 mouse colon cancer cell line (3,000 cells / well, 37 ° C.), approved as untreated, panobinostat alone (1.0 ⁇ M), or panobinostat (1.0 ⁇ M)
  • Each treatment was performed in combination with a drug library compound (1.0 ⁇ M), and after 48 hours, the decrease in the viability of the cells was evaluated by WST-8 assay.
  • the approved drug library compounds in the combination addition group which was 70% or less of the survival rate of panobinostat alone addition, were selected.
  • the same evaluation as described above was performed to reduce the survival rate of the panobinostat single addition group to 50% or less through all the concentrations. Approved drug library compounds in the combination addition group that had been selected were selected.
  • HCT116 human colon adenocarcinoma cell line HCT116 human colon adenocarcinoma cell line (HCT116) (obtained from American Type Culture Collection (ATCC)) Colon26 NL-17 mouse colon cancer cell line (C26NL17)
  • Sample group panobinostat (1 ⁇ M) and approved drug library compound (1 ⁇ M)
  • Combination group added with panobinostat (1 ⁇ M)-Library compound group not added with panobinostat Evaluation In the same manner as in screening 1, the decrease in the survival rate in the cells was evaluated.
  • Example 2 (observation of microtubules in combination with panobinostat and vincristine by ⁇ -tubulin staining) 1. Experimental material Panobinostat 0.01 ⁇ M Vincristine 0.01 ⁇ M Anti- ⁇ -tubulin pAb (MBL) Goat anti rabbit IgG-Alexa488 (Life technologies) Mounting agent (Perma Fluor: Thermo Fisher Scientific) DAPI (1 mg / mL) (Life technologies)
  • HCT116 human colon adenocarcinoma cell line was cultured in the presence of 37 ° C., 5% CO 2 , 20% O 2 .
  • Inactivated fetal bovine serum (FBS) was added to D-MEM (high glucose) so as to be 10%, and further cultured using a medium supplemented with 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin.
  • HCT116 cells were seeded on non-coated glass plates (Matsunami Glass Industrial Co., Ltd.) at 7.0 ⁇ 10 4 cells / 150 ⁇ L each, control (no drug added group), panobinostat 0.01 ⁇ M, vincristine 0.
  • the sample incubated for 8 hours was used as a staining sample. Thereafter, the drug solution was aspirated, washed twice with PBS ( ⁇ ), immersed in methanol cooled in a ⁇ 20 ° C. freezer, and fixed for 10 minutes. Block with 60 ⁇ L of 3% bovine serum albumin-PBS solution (BSA-PBS) at room temperature for 60 minutes, aspirate the blocking solution, and then add 75 ⁇ L of anti- ⁇ -tubulin antibody diluted 1000 times with 1% BSA-PBS And allowed to react for 1 hour at room temperature.
  • BSA-PBS bovine serum albumin-PBS
  • panobinostat added group was characterized in that many microtubules were elongated compared to the control.
  • vincristine addition group the cell cycle stopped at the M phase, and many microtubules were divided into two.
  • panofinostat and vincristine combination group a combination of these two features, a feature reflecting only panobinostat, a feature reflecting only vincristine, and a multi-polar spindle were observed.
  • Example 3 observation of dead cells using time-lapse imaging.
  • Experimental method cell seeding
  • EZVIEW culture 24-well plate LB Cover glass bottom IWAKI was seeded with 1.5 ⁇ 10 4 cells / 500 ⁇ L / well and cultured in HCT116 cell culture medium at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2. Incubated for hours.
  • Time-lapse cell observation First, a stage for embedding the cover glass bottom was attached. After turning on all the power sources of INU, Thermo plate, MIX GAS, and LENS POWER, the CO 2 cylinder was opened. 20 mL of water was poured into the gap between the stages.
  • a confocal laser scanning microscope (A1R +, Nikon) was turned on, and it was confirmed whether the cells were in focus in live mode. After carefully confirming that the subject is in focus, a combination of two agents was added to the cells so that panobinostat was 10 nM and vincristine was 3 nM.
  • Example 4 (Study of cell growth inhibitory effect) (1) Human colon adenocarcinoma cell line HCT116 cell Experimental method (sample preparation) Panobinostat was dissolved at a ratio of 10 ⁇ L of DMSO and 990 ⁇ L of L-(+)-arginine to 300 ⁇ g of panobinostat, then diluted with L-(+)-arginine, and then 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M and 10 ⁇ M panobinostat solutions were prepared. Vincristine was prepared by diluting with L-(+)-arginine so that the concentrations were 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, and 10 ⁇ M.
  • HCT116 cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 and 20% O 2 . Inactivated fetal bovine serum (FBS) was added to D-MEM (high glucose) so as to be 10%, and further cultured using a medium supplemented with 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin. The cells were detached with a 0.025% trypsin / EDTA-PBS ( ⁇ ) solution and centrifuged at 4 ° C., 200 g, and room temperature for 5 minutes. After resuspension, cell numbers were calculated and passaged or prepared.
  • FBS Inactivated fetal bovine serum
  • Cell growth inhibition test A. Cell growth suppression test using a single agent HCT116 cells were seeded at 180 ⁇ L in 96-well plates at 3.0 ⁇ 10 3 cells / well and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours. 20 ⁇ L each was added so that the final concentration of panobinostat or vincristine was 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, or 1 ⁇ M, followed by incubation at 37 ° C. for 48 hours. The medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8. After further incubation for 3 hours, absorbance was measured using a multiplate reader (measurement wavelength: 450 nm, control wavelength: 630 nm), and the number of viable cells was calculated.
  • a multiplate reader measurement wavelength: 450 nm, control wavelength: 630 nm
  • HCT116 cells were seeded at 160 ⁇ L in 96-well plates at 3.0 ⁇ 10 3 cells / well and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours.
  • Panobinostat alone is added at a final concentration of 0.003 ⁇ M, or 20 ⁇ L is added so that the final panofinostat concentration is 0.003 ⁇ M and the final concentration of vincristine is 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, or 1 ⁇ M.
  • the data of the cell growth inhibition test was analyzed, and the combination index (CI) value was determined as an index of synergistic effect.
  • the CI value was calculated using “CompuSyn for Drug Combinations and for General Dose-Effect Analysis by Ting-Ciao Chou” of CompuSyn.
  • FIG. B The cell growth inhibitory effect of a single agent is shown in FIG. B.
  • FIG. C The effect of the combined use of panobinostat 0.003 ⁇ M and vincristine is shown in FIG. C.
  • FIG. 7 shows the effect of combined use of panobinostat (0.01 ⁇ M) and vincristine (Vincristine).
  • the panobinostat concentration was set to 0.003 ⁇ M and 0.01 ⁇ M, which had a low cell growth inhibitory effect in the single agent treatment.
  • cell growth inhibitory effects were examined.
  • the panofinostat 0.003 ⁇ M combination group no decrease in cell viability was observed in the case of panofinostat alone, but in the combination group with vincristine 0.003 ⁇ M and 0.01 ⁇ M, the cell survival rate was lower than in the case of vincristine alone. And was shown to have a cancer cell growth inhibitory effect.
  • the effect of the combined use was more prominent as the concentration of vincristine was lower (FIGS. 5 to 6).
  • panobinostat 0.01 ⁇ M combination group an effect similar to or higher than that of 0.3 ⁇ M vincristine alone could be obtained with 0.003 ⁇ M vincristine that is about 100 times thinner (1 ⁇ M vincristine alone: 86.3% inhibition, 0.3 ⁇ M vincristine single agent: 82.9% inhibition, 0.003 ⁇ M vincristine + panobinostat 0.01 ⁇ M: 84.4% inhibition). From this, it was shown that, particularly when 0.01 ⁇ M panobinostat was used, the cell growth inhibitory effect of cancer cells was dramatically improved by using it together with vincristine. Further, the combined effect was more prominent as the concentration of vincristine was lower (FIGS. 6 and 7).
  • the CI value When the CI value is near 1, the additive effect can be evaluated, and as the CI value increases above 1, the additive and synergistic effect can be evaluated to be small.
  • the CI values were as shown in the table below.
  • CI values showed that panobinostat and vincristine showed a synergistic effect on the suppression of cancer cell (HCT116) cell growth, and that the synergistic effect was more pronounced when vincristine was at a low concentration.
  • D. Cell growth suppression test by combined use Vincristine alone has a final concentration of 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M or 0.03 ⁇ M and a final panobinostat concentration of 0.0003 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M or The number of viable cells was calculated after treating the cells in the same manner as in “B. Cell growth inhibition test by combined use” except that 22.5 ⁇ L each was added so that 0.3 ⁇ M was used together. D. From these results, it was shown that the combined effect of panobinostat in suppressing cancer cell growth was exhibited at a concentration at which cancer cell growth inhibitory effect was observed to some extent with panobinostat alone (FIGS. 8 to 10).
  • Example 5 human colon adenocarcinoma cell line HCT116 cells (very low concentration of vincristine (nM order))
  • Panobinostat was dissolved in a ratio of 10 ⁇ L of DMSO and 990 ⁇ L of L-(+)-arginine to 300 ⁇ g of panobinostat, and then diluted with L-(+)-arginine to prepare a 0.1 ⁇ M panobinostat solution.
  • Vincristine was prepared by diluting with L-(+)-arginine so that the concentration was 0.1 nM, 0.3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM or 30 nM.
  • Cell preparation Human colon adenocarcinoma cell line HCT116 cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 and 20% O 2 . Inactivated fetal bovine serum (FBS) was added to D-MEM (high glucose) so as to be 10%, and further cultured using a medium supplemented with 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin. The cells were detached with a 0.025% trypsin / EDTA-PBS ( ⁇ ) solution and centrifuged at 4 ° C., 200 g, and room temperature for 5 minutes. After resuspension, cell numbers were calculated and passaged or prepared.
  • FBS Inactivated fetal bovine serum
  • Cell growth inhibition test A. Cell growth inhibition test with vincristine alone 180 ⁇ L of HCT116 cells were seeded in 96-well plates at 3.0 ⁇ 10 3 cells / well and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours. 20 ⁇ L each was added so that the final concentration of vincristine was 0.01 nM, 0.03 nM, 0.1 nM, 0.3 nM, 1 nM, or 3 nM, followed by incubation at 37 ° C. for 48 hours. The medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8. After further incubation for 3 hours, absorbance was measured using a multiplate reader (measurement wavelength: 450 nm, control wavelength: 630 nm), and the number of viable cells was calculated.
  • a multiplate reader measurement wavelength: 450 nm, control wavelength: 630 nm
  • HCT116 cells were seeded at a rate of 3.0 ⁇ 10 3 cells / well in a 96-well plate by 180 ⁇ L and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours.
  • Panobinostat alone pano only
  • panobinostat final concentration of 0.01 ⁇ M panobinostat final concentration of 0.01 ⁇ M
  • the mixture was incubated at 37 ° C. for 48 hours.
  • the medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8. After further incubation for 3 hours, absorbance was measured using a multiplate reader (measurement wavelength: 450 nm, control wavelength: 630 nm), and the number of viable cells was calculated.
  • Example 6 human colon adenocarcinoma cell line HCT116 cells (very low concentration of vincristine (nM order or less))
  • HCT116 cells very low concentration of vincristine (nM order or less)
  • panobinostat was dissolved at a ratio of 10 ⁇ L of DMSO and 990 ⁇ L of L-(+)-arginine to 300 ⁇ g of panobinostat, and then diluted with L-(+)-arginine to prepare a 0.1 ⁇ M panobinostat solution.
  • Vincristine is L-(+ so that the concentration is 0.03 pM, 0.1 pM, 0.3 pM, 1 pM, 3 pM, 10 pM, 0.03 nM, 0.1 nM, 0.3 nM, 1 nM, 3 nM or 10 nM. ) -Diluted with arginine to prepare.
  • Cell preparation Human colon adenocarcinoma cell line HCT116 cells were cultured in the presence of 37 ° C., 5% CO 2 , 20% O 2 .
  • Inactivated fetal bovine serum (FBS) was added to D-MEM (high glucose) so as to be 10%, and further cultured using a medium supplemented with 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin.
  • the cells were detached with a 0.025% trypsin / EDTA-PBS ( ⁇ ) solution and centrifuged at 4 ° C., 200 g, and room temperature for 5 minutes. After resuspension, cell numbers were calculated and passaged or prepared.
  • Cell growth inhibition test A. Cell growth inhibition test with vincristine alone 180 ⁇ L of HCT116 cells were seeded in 96-well plates at 3.0 ⁇ 10 3 cells / well and cultured at 37 ° C.
  • HCT116 cells were seeded at a rate of 3.0 ⁇ 10 3 cells / well in a 96-well plate by 180 ⁇ L and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours.
  • the mixture was incubated at 37 ° C. for 48 hours.
  • the medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8.
  • Example 7 human fibrosarcoma cell line HT1080 cells.
  • Panobinostat was dissolved at a ratio of 10 ⁇ L of DMSO and 990 ⁇ L of L-(+)-arginine to 300 ⁇ g of panobinostat, and then diluted with L-(+)-arginine to prepare a 0.1 ⁇ M panobinostat solution.
  • Vincristine was prepared by diluting with L-(+)-arginine so that the concentration would be 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M and 0.3 ⁇ M.
  • Cell preparation Human fibrosarcoma cell line HT1080 cells (obtained from ATCC) were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 and 20% O 2 . Inactivated fetal bovine serum (FBS) was added to D-MEM (high glucose) so as to be 10%, and further cultured using a medium supplemented with 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin. The cells were detached with a 0.025% trypsin / EDTA-PBS ( ⁇ ) solution and centrifuged at 4 ° C., 200 g, and room temperature for 5 minutes. After resuspension, cell numbers were calculated and passaged or prepared.
  • FBS Inactivated fetal bovine serum
  • Cell growth inhibition test A. Cell growth inhibition test with vincristine single agent HT1080 cells were seeded at a rate of 3.0 ⁇ 10 3 cells / well in a 96-well plate by 180 ⁇ L and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours. After adding 20 ⁇ L each so that the final concentration of vincristine was 0.0003 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, or 0.03 ⁇ M, the cells were incubated at 37 ° C. for 48 hours. The medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8.
  • panobinostat final concentration of 0.01 ⁇ M pano only
  • panobinostat final concentration of 0.01 ⁇ M and vincristine final concentrations of 0.0003 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M and 0.03 ⁇ M (combination group)
  • the mixture was incubated at 37 ° C. for 48 hours.
  • the medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8.
  • absorbance was measured using a multiplate reader (measurement wavelength: 450 nm, control wavelength: 630 nm), and the number of viable cells was calculated.
  • Example 8 human uterine cancer-derived cell line HeLa cells.
  • Panobinostat was dissolved at a ratio of 10 ⁇ L of DMSO and 990 ⁇ L of L-(+)-arginine to 300 ⁇ g of panobinostat, diluted with L-(+)-arginine, and then 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 0.5 ⁇ M A panobinostat solution was prepared.
  • Vincristine was prepared by diluting with L-(+)-arginine so that the concentration would be 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M and 0.3 ⁇ M.
  • Cell preparation Human uterine cancer-derived cell line HeLa cells (obtained from ATCC) were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 and 20% O 2 . Inactivated fetal bovine serum (FBS) was added to D-MEM (high glucose) so as to be 10%, and further cultured using a medium supplemented with 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin. The cells were detached with a 0.025% trypsin / EDTA-PBS ( ⁇ ) solution and centrifuged at 4 ° C., 200 g, and room temperature for 5 minutes. After resuspension, cell numbers were calculated and passaged or prepared.
  • FBS Inactivated fetal bovine serum
  • Cell growth inhibition test A. Cell growth suppression test with vincristine and panobinostat single agent HeLa cells were seeded at 180 ⁇ L in 96-well plates at 3.0 ⁇ 10 3 cells / well and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours. . After adding 20 ⁇ L each so that the final concentration of vincristine was 0.0003 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, or 0.03 ⁇ M, the cells were incubated at 37 ° C. for 48 hours.
  • panobinostat was 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, and 0.05 ⁇ M, followed by incubation at 37 ° C. for 48 hours.
  • the medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8.
  • absorbance was measured using a multiplate reader (measurement wavelength: 450 nm, control wavelength: 630 nm), and the number of viable cells was calculated.
  • Panobinostat final concentrations of 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, and 0.05 ⁇ M and vincristine final concentrations of 0.0003 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, and 0.03 ⁇ M are combined (combined group). After adding 22.5 ⁇ L each, the mixture was incubated at 37 ° C. for 48 hours. The medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8. After further incubation for 3 hours, absorbance was measured using a multiplate reader (measurement wavelength: 450 nm, control wavelength: 630 nm), and the number of viable cells was calculated.
  • the data of the cell growth inhibition test was analyzed, and the combination index (CI) value was determined as an index of synergistic effect.
  • the CI value was calculated using “CompuSyn for Drug Combinations and for General Dose-Effect Analysis by Ting-Ciao Chou” of CompuSyn.
  • panobinostat and vincristine have a synergistic effect on cell growth inhibition of cancer cells (HeLa), and the synergistic effect tends to be more pronounced when panobinostat and vincristine are at low concentrations, respectively. .
  • Example 9 human breast cancer-derived cell line MDA-MB-231 cells.
  • Panobinostat was dissolved at a ratio of 10 ⁇ L of DMSO and 990 ⁇ L of L-(+)-arginine to 300 ⁇ g of panobinostat, and then diluted with L-(+)-arginine to prepare 0.3 ⁇ M and 0.5 ⁇ M panobinostat solutions.
  • Vincristine was prepared by diluting with L-(+)-arginine so that the concentration would be 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M and 0.3 ⁇ M.
  • Cell preparation Human breast cancer-derived cell line MDA-MB-231 cells (obtained from ATCC) were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 and 20% O 2 . Inactivated fetal bovine serum (FBS) was added to D-MEM (high glucose) so as to be 10%, and further cultured using a medium supplemented with 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin. The cells were detached with a 0.025% trypsin / EDTA-PBS ( ⁇ ) solution and centrifuged at 4 ° C., 200 g, and room temperature for 5 minutes. After resuspension, cell numbers were calculated and passaged or prepared.
  • FBS Inactivated fetal bovine serum
  • Cell growth inhibition test A. Cell growth inhibition test with vincristine and panobinostat alone MDA-MB-231 cells were seeded at 180 ⁇ L in a 96-well plate at 3.0 ⁇ 10 3 cells / well, at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2. Cultured for 24 hours. After adding 20 ⁇ L each so that the final concentration of vincristine was 0.0003 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, or 0.03 ⁇ M, the cells were incubated at 37 ° C. for 48 hours.
  • panobinostat was 0.03 ⁇ M and 0.05 ⁇ M, followed by incubation at 37 ° C. for 48 hours.
  • the medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8.
  • absorbance was measured using a multiplate reader (measurement wavelength: 450 nm, control wavelength: 630 nm), and the number of viable cells was calculated.
  • panobinostat After adding 22.5 ⁇ L of panobinostat final concentrations of 0.03 ⁇ M and 0.05 ⁇ M and vincristine final concentrations of 0.0003 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, and 0.03 ⁇ M in combination (combination group), Incubated at 37 ° C. for 48 hours. The medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8. After further incubation for 3 hours, absorbance was measured using a multiplate reader (measurement wavelength: 450 nm, control wavelength: 630 nm), and the number of viable cells was calculated.
  • Example 10 (Examination of cell growth inhibitory effect in normal cells) 1.
  • Experimental method (sample preparation) Panobinostat was dissolved at a ratio of 10 ⁇ L of DMSO and 990 ⁇ L of L-(+)-arginine to 300 ⁇ g of panobinostat, and then diluted with L-(+)-arginine to prepare a 0.1 ⁇ M panobinostat solution.
  • Vincristine was prepared by diluting with L-(+)-arginine so that the concentration would be 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M and 0.3 ⁇ M.
  • Cell preparation Mouse endothelial cell line 2H11 cells (obtained from ATCC) were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 and 20% O 2 . Inactivated fetal bovine serum (FBS) was added to D-MEM (high glucose) so as to be 10%, and further cultured using a medium supplemented with 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin. The cells were detached with a 0.025% trypsin / EDTA-PBS ( ⁇ ) solution and centrifuged at 4 ° C., 200 g, and room temperature for 5 minutes. After resuspension, cell numbers were calculated and passaged or prepared.
  • FBS Inactivated fetal bovine serum
  • Cell growth inhibition test A. Cell growth inhibition test with vincristine alone 2H11 cells were seeded at 180 ⁇ L each in a 96-well plate at 3.0 ⁇ 10 3 cells / well and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours. After adding 20 ⁇ L each so that the final concentration of vincristine was 0.0003 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, or 0.03 ⁇ M, the cells were incubated at 37 ° C. for 48 hours. The medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8.
  • panobinostat alone (pano only), panobinostat final concentration 0.01 ⁇ M and vincristine final concentration 0.0003 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M or 0.03 ⁇ M combined use (combined group)
  • panobinostat final concentration 0.01 ⁇ M
  • vincristine final concentration 0.0003 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M or 0.03 ⁇ M combined use (combined group)
  • the mixture was incubated at 37 ° C. for 48 hours.
  • the medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8.
  • absorbance was measured using a multiplate reader (measurement wavelength: 450 nm, control wavelength: 630 nm), and the number of viable cells was calculated.
  • Example 11 Comparison with other HDAC inhibitors.
  • Panobinostat was dissolved at a ratio of 10 ⁇ L of DMSO and 990 ⁇ L of L-(+)-arginine to 300 ⁇ g of panobinostat, vorinostat, belinostat, or mosetinostat, then diluted with L-(+)-arginine, diluted with 0.1-M panovinostat solution, 5 ⁇ M Vorinostat solution, 2 ⁇ M belinostat solution, 10 ⁇ M mosetinostat solution were prepared.
  • Vincristine was prepared by diluting with L-(+)-arginine so that the concentration would be 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M or 10 ⁇ M.
  • Cell preparation Human colon adenocarcinoma cell line HCT116 cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 and 20% O 2 . Inactivated fetal bovine serum (FBS) was added to D-MEM (high glucose) so as to be 10%, and further cultured using a medium supplemented with 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin. The cells were detached with a 0.025% trypsin / EDTA-PBS ( ⁇ ) solution and centrifuged at 4 ° C., 200 g, and room temperature for 5 minutes. After resuspension, cell numbers were calculated and passaged or prepared.
  • FBS Inactivated fetal bovine serum
  • Cell growth inhibition test A. Cell growth inhibition test with vincristine single agent HCT116 cells were seeded at a rate of 3.0 ⁇ 10 3 cells / well in a 96-well plate by 180 ⁇ L and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours. . After adding 20 ⁇ L each so that the final concentration of vincristine was 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, or 1 ⁇ M, incubation was performed at 37 ° C. for 48 hours. The medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8.
  • Panobinostat alone at a final concentration of 0.01 ⁇ M combined with panofinostat final concentration of 0.01 ⁇ M and final concentration of vincristine of 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, or 1 ⁇ M (combination group)
  • the mixture was incubated at 37 ° C. for 48 hours.
  • the medium in each well was replaced with a medium containing 5% CCK-8.
  • absorbance was measured using a multiplate reader (measurement wavelength: 450 nm, control wavelength: 630 nm), and the number of viable cells was calculated.
  • panobinostat and vincristine showed a significantly higher combined effect compared to the combination of other HDAC inhibitors (vorinostat, belinostat, mosetinostat) and vincristine, and effectively suppressed the growth of cancer cells ( FIG. 27 to FIG. 30).
  • Example 12 Combination effect on mouse leukemia cell line p388 cells.
  • Panobinostat was dissolved in a ratio of 10 ⁇ L of DMSO and 990 ⁇ L of L-(+)-arginine to 300 ⁇ g of panobinostat, and then diluted with L-(+)-arginine to prepare a 0.1 ⁇ M panobinostat solution.
  • Vincristine was prepared by diluting with PBS so that the concentration was 0.003 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M and 0.3 ⁇ M.
  • Murine leukemia cell line p388 cells were cultured in the presence of 37 ° C., 5% CO 2 , 20% O 2 . Inactivated fetal bovine serum (FBS) was added to RPMI 1640 medium to 10%, and further cultured using a medium to which 100 units / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin were added. After the cells were collected, they were centrifuged at 4 ° C., 200 g, and room temperature for 5 minutes. After resuspension, cell numbers were calculated and passaged or prepared.
  • FBS Inactivated fetal bovine serum
  • Cell growth inhibition test (Cell growth inhibition test) A. Cell growth inhibition test with vincristine alone 180 ⁇ L of p388 cells were seeded in 96-well plates at 1.0 ⁇ 10 4 cells / well and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours. After adding 20 ⁇ L each so that the final concentration of vincristine was 0.25, 0.5, 1, 2 nM or 4 nM, the mixture was incubated at 37 ° C. for 48 hours. Add 5% CCK-8 to the medium in each well, and after further incubation for 3 hours, measure absorbance using a multiplate reader (measurement wavelength 450 nm, control wavelength 630 nm). Calculated. B.
  • Example 13 two-encapsulated liposome (1) Examination of lipid composition Experimental method Establishment of a quantitative method for panobinostat and vincristine (disintegration of liposomes) Liposomes encapsulating panobinostat and vincristine were disintegrated with methanol, and the encapsulation rate was measured.
  • DSPC Distearoyl phosphatidylcholine
  • DPPC dipalmitoyl phosphatidylcholine
  • HSPC hydrogenated soybean phosphatidylcholine
  • Chol cholesterol
  • the liposome size was adjusted to approximately 100 nm by extrusion using a 100 nm pore size polycarbonate membrane (Nucleopore Track-Tech Membrane, Whatman Ltd.). After diluting with a phosphate buffer (pH 7.4) and centrifuging (453,000 ⁇ g, 15 min, 4 ° C.) using an ultracentrifuge (CS120EX, HITACHI), the supernatant was removed, and the precipitated liposomes were vincristine.
  • a phosphate buffer pH 7.4
  • centrifuging 453,000 ⁇ g, 15 min, 4 ° C.
  • Example 14 (Improvement of preparation method of two-encapsulated liposome) 1.
  • experimental method Establishment of Quantitative Methods for Panobinostat and Vincristine Liposomes were prepared in the same manner as in Example 9 except for the matters described below, and the encapsulation rates of panobinostat and vincristine were measured.
  • Preparation of two-encapsulated liposome (dissolution of lipid) Distearoylphosphatidylcholine (DSPC) and cholesterol (Chol) were dissolved in chloroform so as to be 100 mM.
  • DSPC Distearoylphosphatidylcholine
  • cholesterol cholesterol
  • the liposome size was adjusted to approximately 100 nm by extrusion using a 100 nm pore size polycarbonate membrane (Nucleopore Track-Tech Membrane, Whatman Ltd.). After dilution with PBS and centrifugation (453,000 ⁇ g, 15 min, 4 ° C.) using an ultracentrifuge (CS120EX, HITACHI), the supernatant was removed, and the precipitated liposomes were resuspended in 800 ⁇ L of PBS. The liposome resuspension was added to a solution of panobinostat 1.048 mg dissolved in 20 ⁇ L of DMSO while vortexing little by little.
  • Example 15 (Preparation of PEG-modified double-encapsulated liposome) 1.
  • Experimental method preparation of double-encapsulated liposome (Liquid dissolution) Distearoylphosphatidylcholine (DSPC) and cholesterol (Chol) were dissolved in chloroform so that the concentration was 100 mM, and 1,2-distearoylphosphatidylethanolamine methyl-bonded polyethylene glycol-2000 (mPEG2000-DSPE) was dissolved in 10 mM.
  • the liposome size was adjusted to approximately 100 nm by extrusion using a 100 nm pore size polycarbonate membrane (Nucleopore Track-Tech Membrane, Whatman Ltd.). After dilution with PBS and centrifugation (453,000 ⁇ g, 15 min, 4 ° C.) using an ultracentrifuge (CS120EX, HITACHI), the supernatant was removed, and the precipitated liposomes were resuspended in 800 ⁇ L of PBS. This liposome resuspension was added to a solution of panobinostat 1.048 mg in 20 ⁇ L of DMSO while vortexing little by little.
  • Example 16 Evaluation of therapeutic effect using a tumor bearing model mouse.
  • Experimental method (preparation of two-encapsulated liposome) According to Example 15, PEG-modified double-encapsulated liposomes were prepared.
  • Colon26 NL-17 cell subcutaneous tumor-bearing mouse Colon26 NL17 cells were suspended in D-MEM (High glucose) to 1 ⁇ 10 6 cells / 0.2 mL, and 1 ⁇ 10 6 cells / mouse was placed on the left ventral side of 5-week-old male BALB / c mice. Then, the mice were transplanted by subcutaneous injection to prepare tumor-bearing mice.
  • D-MEM High glucose
  • the tumor volume was calculated according to the formula shown below by measuring the short axis and long axis of cancer.
  • Tumor volume (cm 3 ) 0.4xaxb 2 (a: major axis (cm), b: minor axis (cm))
  • the time schedule of the treatment experiment is described below. 2.
  • Results of the experiment In addition to the group that received the double-encapsulated liposomes, the tumor growth was significantly suppressed compared to the PBS-administered group. A tendency to suppress was observed (FIG. 33).
  • Example 17 (p388 cancer-bearing mouse treatment experiment) 1. Experimental method (sample preparation) Panobinostat was dissolved in PBS so as to be 14.19 mg / kg with respect to the body weight of the mouse to make the total volume 200 ⁇ L (one dose for one panobinostat group). Further, vincristine was dissolved in PBS so as to be 750 ⁇ g / kg with respect to the body weight of the mouse to make the total volume 200 ⁇ L (one dose for one vincristine group).
  • panobinostat and vincristine were dissolved in PBS so as to be 14.19 mg / kg and 750 ⁇ g / kg, respectively, with respect to the body weight of the mouse, so that the total volume was 200 ⁇ L (a single dose for one combination group).
  • Administered. P388 was transplanted by 1 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ L tail vein injection at 5 weeks of age on CD2F1 males. Moreover, this day was set to Day0. Mice were distributed to Day 0 from the measurement results of body weight, divided into groups, and each sample was administered to Day 1, Day 6, Day 11, Day 16 by 200 ⁇ L tail vein injection. Body weight was measured and mouse survival was recorded. 2.
  • Example 18 A capsule containing the following composition as an encapsulated powder is formulated by a method known to those skilled in the art.

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Abstract

新たな抗癌剤併用療法の提供。　（Ａ）パノビノスタット又はその塩と、（Ｂ）チューブリン阻害剤とを組み合わせてなる、癌の予防または治療剤。

Description

癌の予防または治療剤
　本発明は癌の予防または治療剤に関する。
　パノビノスタットは、非選択的ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の１種であり、再発または難治性の多発性骨髄腫の治療薬として用いられている（非特許文献１）。ＨＤＡＣ阻害剤であるパノビノスタットは、遺伝子の転写や細胞の分化を促進する作用を有する独特な抗癌剤であり、エイズ治療薬としても注目を集めている。ところで、ＨＤＡＣ阻害剤としてボリノスタットも知られているが、ボリノスタットは皮膚Ｔ細胞性リンパ腫にのみ治療効果が認められているにすぎない。
　一方、ビンクリスチンに代表されるチューブリン阻害剤は、微小管の重合反応を阻害することにより、細胞の有糸分裂を阻害し、軟部腫瘍、血液腫瘍などに用いられている（非特許文献２）。
ファリーダックカプセル１０ｍｇ添付文書 オンコビン注射用１ｍｇ添付文書
　癌の治療においては、１種類の抗癌剤投与だけでは十分な効果が得られないことが多く、複数種類の抗癌剤の併用により治療効果を得ようとする試みがなされている。しかしながら、抗癌剤の併用療法により十分な効果が得られるとは限らず、逆に副作用の増強により投与が継続できなくなることが多いのが現状である。
　従って、本発明の課題は、２種類の抗癌剤の併用により優れた抗癌効果が得られ、かつ副作用の少ない新たな抗癌剤併用療法を提供することにある。
　そこで本発明者は、パノビノスタット又はその塩と他の抗癌剤との併用投与による抗癌効果を検討してきたところ、パノビノスタット又はその塩とチューブリン阻害剤との併用により相乗的に優れた抗癌効果が得られ、また単独投与では十分な効果を示さない種々の固形癌細胞に対する増殖抑制効果が得られることを見出した。特に、そのような相乗的な抗癌効果は、パノビノスタット又はその塩に、極低用量のチューブリン阻害剤を併用することで発揮されることを見出した。また、これら２種類の成分をリポソーム中に内包させれば、溶解性の異なる２成分を含有するリポソーム製剤も得られることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、次の発明〔１〕～〔２０〕を提供するものである。
〔１〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩と、（Ｂ）チューブリン阻害剤とを組み合わせてなる、癌の予防または治療剤。
〔２〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩と、（Ｂ）チューブリン阻害剤とを併用投与するものである〔１〕記載の癌の予防または治療剤。
〔３〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤とを含有する癌の予防または治療用医薬組成物である〔１〕記載の癌の予防または治療剤。
〔４〕前記チューブリン阻害剤が、ビンクリスチン又はその塩である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔５〕前記癌が、固形癌である、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔６〕前記癌が、血液癌である、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔７〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩及び（Ｂ）チューブリン阻害剤がリポソームに内包されているリポソーム製剤である〔３〕～〔６〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔８〕前記リポソームの組成が、リン脂質とコレステロールの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾リン脂質とコレステロールの組み合わせ、およびリン脂質とポリエチレングリコール修飾リン脂質とコレステロールの組み合わせからなる群から選択される、〔７〕記載の癌の予防または治療剤。
〔９〕リン脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン、水素化ダイズホスファチジルコリンおよびジパルミトイルホスファチジルコリンからなる群から選択されるものであり、ポリエチレングリコール修飾リン脂質が、ポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ポリエチレングリコール修飾水素化ダイズホスファチジルエタノールアミンおよびポリエチレングリコール修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択されるものである〔８〕記載の癌の予防または治療剤。
〔10〕前記リポソームの組成が、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ジパルミトイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾水素化ダイズホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾水素化ダイズホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとの組み合わせからなる群から選択される〔７〕記載の癌の予防または治療剤。
〔11〕前記リポソームの組成が、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせであり、前記水素化ダイズホスファチジルコリンと前記コレステロールとのモル比が３：２である、〔９〕または〔１０〕記載の癌の予防または治療剤。
〔12〕前記リポソームの組成が、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせであり、前記ジステアロイルホスファチジルコリンと前記コレステロールとのモル比が３：２である、〔９〕または〔１０〕記載の癌の予防または治療剤。
〔13〕経口投与製剤または経静脈投与製剤である、〔３〕～〔６〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔14〕経口投与製剤または経静脈投与製剤である、〔７〕～〔１２〕のいずれかに記載の癌の予防または治療剤。
〔15〕リン脂質およびポリエチレングリコール修飾リン脂質からなる群から選択される１種又は２種以上と、コレステロールとを用いてリポソームを調製する工程、および、
　前記リポソームにパノビノスタットを混合する工程の後に、チューブリン阻害剤を混合する工程、
を含む、リポソーム製剤の製造方法。
〔16〕前記チューブリン阻害剤が、ビンクリスチン又はその塩である、〔１５〕記載の製造方法。
〔17〕前記リポソームを調製する工程において、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ジパルミトイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾水素化ダイズホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾水素化ダイズホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、またはジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとの組み合わせを用いる、〔１５〕又は〔１６〕記載の製造方法。
〔18〕癌の予防または治療のための、（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤との組み合わせ。
〔19〕癌の予防または治療剤製造のための、（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤との組み合わせの使用。
〔20〕（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤とを併用して投与することを特徴とする癌の予防または治療方法。
　パノビノスタット又はその塩とチューブリン阻害剤とを併用すれば、相乗的に優れた抗癌効果が得られる。特にパノビノスタットと組み合わせることにより、チューブリン阻害剤の投与量は、劇的に低減させることができるため、本発明の併用によると、特にチューブリン阻害剤に起因する副作用を大幅に低減または全く生じさせずに、長期間投与が継続でき、その結果としてさらに優れた抗癌効果が得られる。また、パノビノスタット及びチューブリン阻害剤の２成分を内包するリポソーム製剤を用いれば、２成分を効率よく同時に投与できるので、優れた抗癌効果が得られる。
パノビノスタットとチューブリン阻害剤との併用による抗癌作用を示す。 パノビノスタットとビンクリスチン併用時の微小管の観察結果を示す。 パノビノスタットとビンクリスチン併用時の微小管の観察結果を示す（特徴的な細胞）。 パノビノスタットとビンクリスチン併用時のＨＣＴ１１６細胞の細胞死のタイムラプス解折結果を示す。 パノビノスタット単独投与及びビンクリスチン単独投与の場合におけるＨＣＴ１１６細胞増殖抑制効果を示す。 パノビノスタット０．００３μＭとビンクリスチンの併用によるＨＣＴ１１６に対する効果を示す。 パノビノスタット０．０１μＭとビンクリスチンの併用によるＨＣＴ１１６に対する効果を示す。 ビンクリスチン０．００３μＭとパノビノスタットとの併用によるＨＣＴ１１６に対する効果を示す。 ビンクリスチン０．０１μＭとパノビノスタットとの併用によるＨＣＴ１１６に対する効果を示す。 ビンクリスチン０．０３μＭとパノビノスタットとの併用によるＨＣＴ１１６に対する効果を示す。 ＨＣＴ１１６細胞に対するビンクリスチン単独（ｎＭオーダー）の効果を示す。 ＨＣＴ１１６細胞に対するパノビノスタット０．０１μＭとビンクリスチン（ｎＭオーダー）の併用による効果を示す。 ＨＣＴ１１６細胞に対するパノビノスタット０．０１μＭとビンクリスチン（ｎＭオーダー以下）の併用による効果を示す。 ＨＣＴ１１６細胞に対するパノビノスタット０．０１μＭとビンクリスチン（ｐＭオーダー以下）の併用による効果を示す。 ＨＴ１０８０細胞に対するビンクリスチン単独の効果を示す。 ＨＴ１０８０細胞に対するパノビノスタット０．０１μＭとビンクリスチンの併用による効果を示す。 ＨｅＬａ細胞に対するパノビノスタット単独投与の効果を示す。 ＨｅＬａ細胞に対するビンクリスチン単独投与の効果を示す。 ＨｅＬａ細胞に対するビンクリスチンとパノビノスタット（０．００３μＭ）の併用投与の効果を示す。 ＨｅＬａ細胞に対するビンクリスチンとパノビノスタット（０．０１μＭ）の併用投与の効果を示す。 ＨｅＬａ細胞に対するビンクリスチンとパノビノスタット（０．０３μＭ）の併用投与の効果を示す。 ＨｅＬａ細胞に対するビンクリスチンとパノビノスタット（０．０５μＭ）の併用投与の効果を示す。 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するビンクリスチンとパノビノスタット（０．０３μＭ）の併用投与の効果を示す。 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するビンクリスチンとパノビノスタット（０．０５μＭ）の併用投与の効果を示す。 正常細胞に対するビンクリスチン単独投与の作用を示す。 正常細胞に対するビンクリスチンとパノビノスタット併用投与の作用を示す。 ＨＣＴ１１６細胞に対するパノビノスタットとビンクリスチンの併用による効果を示す。 ＨＣＴ１１６細胞に対するボリノスタットとビンクリスチンの併用による効果を示す。 ＨＣＴ１１６細胞に対するベリノスタットとビンクリスチンの併用による効果を示す。 ＨＣＴ１１６細胞に対するモセチノスタットとビンクリスチンの併用による効果を示す。 マウス白血病細胞株ｐ３８８細胞に対するパノビノスタットとビンクリスチンの併用による効果を示す。 パノビノスタットとビンクリスチンのリポソームへの内封率を示す。 Ｃｏｌｏｎ２６　ＮＬ－１７細胞皮下担がんマウスに対するパノビノスタットとビンクリスチンの併用による効果を示す。 ｐ３８８担がんマウスにおける体重の推移を示す。 ｐ３８８担がんマウスに対するパノビノスタットとビンクリスチンの併用による生存率向上効果を示す。
　本発明の癌の予防または治療剤の有効成分は、（Ａ）パノビノスタット又はその塩と、（Ｂ）チューブリン阻害剤との組み合わせである。
　（Ａ）パノビノスタット又はその塩
　パノビノスタットは、前述のようにＨＤＡＣ阻害剤の１種であり、化学名（２Ｅ）－Ｎ－ヒドロキシ－３－〔４－（｛［２－（２－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル〕プロプ－２－エナミドである。また、パノビノスタットの塩としては、乳酸塩、酢酸塩、塩酸塩、硫酸塩等の酸付加塩が挙げられるが、乳酸塩が好ましい。本明細書において、「（Ａ）パノビノスタット又はその塩」は、「成分（Ａ）」ともいう。
　（Ｂ）チューブリン阻害剤
　チューブリン阻害剤は、微小管の重合反応を阻害する成分であり、その例としては特に限定されないが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン等のビンカアルカロイド系化合物又はその塩、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン系化合物、コルヒチン、オキシベンダゾール等が挙げられる。このうち、ビンカアルカロイド系化合物又はその塩が好ましく、ビンクリスチン又はその塩が特に好ましい。ビンクリスチンは、化学名メチル（３ａＲ，４Ｒ，５Ｓ，５ａＲ，１０ｂＲ，１３ａＲ）－４－アセトキシ－３ａ－エチル－９－［（５Ｓ，７Ｓ，９Ｓ）－５－エチル－５－ヒドロキシ－９－メトキシカルボニル－１，４，５，６，７，８，９，１０－オクタヒドロ－３，７－メタノ－３－アザシクロウンデシノ［５，４－ｂ］インドール－９－イル］－６－ホルミル－５－ヒドロキシ－８－メトキシ－３ａ，４，５，５ａ，６，１１，１２，１３ａ－オクタヒドロ－１Ｈ－インドリジノ［８，１－ｃｄ］カルバゾール－５－カルボキシレートとしても表すことができる。ここで、ビンカアルカロイド系化合物及びビンクリスチンの塩としては、硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酒石酸塩等の酸付加塩が挙げられる。本明細書において、「（Ｂ）チューブリン阻害剤」は、「成分（Ｂ）」ともいう。
　本発明の癌の予防または治療剤は、前記成分（Ａ）と成分（Ｂ）とを組み合わせてなる医薬であり、これらの成分を併用できる形態であればよい。具体的には、各成分の好ましい投与形態や投与スケジュールに基づき、各成分をそれぞれの剤形に分けて製剤化してもよく、一つの剤形にまとめて製剤化（すなわち、配合剤として製剤化）してもよく、さらに各製剤を併用に適した１個のパッケージにまとめて製造販売してもよく、各製剤を別個のパッケージに分けて製造販売してもよい。各製剤を１個のパッケージとするか別個のパッケージとする場合、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を併用投与することを記載した使用説明書を含むキット製剤とすることもできる。ここで「使用説明書」とは、投与量が記載されたものであればよい。具体的には、添付文書、パンフレット等が例示される。また、使用説明書を含むキット製剤とは、キット製剤のパッケージに使用説明書が印刷・添付されているものであっても、キット製剤のパッケージに本発明の癌の予防または治療剤とともに使用説明書が同封されているものであってもよい。
　各成分をそれぞれ別の剤形に分けて製剤化する場合には、例えばパノビノスタットは経口投与製剤として既に販売されているのでそのままの形態でよく、ビンクリスチンは経静脈投与製剤として既に販売されているのでそのままの形態でよい。一方、一つの剤形にまとめて製剤化する場合には、成分（Ａ）と成分（Ｂ）とを含有する医薬組成物、例えば後述のように２成分を内包したリポソームを含有する製剤としてもよいし、他の剤形としてもよい。
　成分（Ａ）は、０．１ｍｇ～１００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ～５０ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ～２５ｍｇ、更に好ましくは１０ｍｇ～２０ｍｇの量で本発明の医薬に含ませることができる。成分（Ａ）が上記範囲であることにより、本発明は、好ましい抗癌作用を発揮することができ、かつ、成分（Ｂ）との相乗効果がより顕著に発揮される。また、成分（Ａ）は、成分（Ｂ）と併用することにより、成分（Ａ）単独で抗癌効果を示す量よりも少ない量（例えば、１／１０～１／２）で、抗癌効果を示す可能性がある。従って、成分（Ａ）の副作用は、成分（Ｂ）と併用することにより、低減できる可能性がある。
　成分（Ａ）は、インビトロ又はエクスビボの系において、好ましくは０．０００１μＭ～１μＭ、より好ましくは０．００１μＭ～０．１μＭ、更に好ましくは０．００１μＭ～０．０５μＭの濃度で治療対象の細胞に接触する量で、本発明の医薬に含ませることができる。
　成分（Ａ）は、インビボの系において、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬの血中濃度となる量で、本発明の医薬に含ませることができる。
　成分（Ａ）が上記範囲であることにより、本発明は、好ましい抗癌作用を発揮することができ、かつ、成分（Ｂ）との相乗効果がより顕著に発揮される。成分（Ａ）は、成分（Ｂ）と併用することにより、成分（Ａ）単独で抗癌効果を示す濃度よりも少ない濃度（例えば、１／１０～１／２）で、抗癌効果を示す可能性がある。従って、成分（Ａ）の副作用は、成分（Ｂ）と併用することにより、低減できる可能性がある。
　成分（Ｂ）は、１０ｍｇ以下、好ましくは１ｍｇ以下、１００μｇ以下、１０μｇ以下、１μｇ以下、１００ｎｇ以下、１０ｎｇ以下、１ｎｇ以下、１ｐｇ以下、１ｆｇ以下、１ａｇ以下の量で本発明の医薬に含ませることができる。また、成分（Ｂ）は、０ｇ超、好ましくは１ａｇ以上、１ｆｇ以上、１ｐｇ以上、１ｎｇ以上、１０ｎｇ以上、１００ｎｇ以上、１μｇ以上、１０μｇ以上、１００μｇ以上、１ｍｇ以上の量で本発明に含ませることができる。成分（Ｂ）は、例えば１ａｇ～１０ｍｇ、好ましくは１ｆｇ～１ｍｇ、より好ましくは１ｎｇ～１００μｇ、更に好ましくは１００ｎｇ～１０μｇの量で本発明の医薬に含ませることができる。
　成分（Ｂ）は、インビトロ又はエクスビボの系において、０Ｍ超１０μＭ以下、好ましくは１ｆＭ～１μＭ、より好ましくは１ｐＭ～１ｎＭの濃度で治療対象の細胞に接触する量で、本発明の医薬に含ませることができる。
　成分（Ｂ）は、インビボの系において、０ｇ／ｍＬ超１００ｎｇ／ｍＬ以下、好ましくは１ａｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｆｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、更に好ましくは１ｐｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬの血中濃度となる量で、本発明の医薬に含ませることができる。
　成分（Ｂ）が上記範囲であることにより、本発明は、好ましい抗癌作用を発揮することができ、かつ、成分（Ａ）との相乗効果がより顕著に発揮される。また、成分（Ｂ）は、成分（Ａ）と併用することにより、成分（Ｂ）単剤で用いられる場合の１０2分の１以下、例えば１０3分の１以下、１０4分の１以下、１０5分の１以下、１０6分の１以下、１０7分の１以下、１０8分の１以下の量で、抗癌作用を示すことができる。従って、成分（Ｂ）の副作用は、成分（Ａ）と併用することにより、大幅に低減でき、又は全く示されないレベルにまで低減させることができる。
　成分（Ａ）及び成分（Ｂ）は、成分（Ａ）：成分（Ｂ）＝１：１以下、成分（Ａ）：成分（Ｂ）＝１０2：１以下、成分（Ａ）：成分（Ｂ）＝１０3：１以下、成分（Ａ）：成分（Ｂ）＝１０6：１以下、成分（Ａ）：成分（Ｂ）＝１０9：１以下、成分（Ａ）：成分（Ｂ）＝１０12：１以下、のモル比で、本発明の医薬に含ませることができる。
　成分（Ａ）及び成分（Ｂ）のモル比が上記範囲であることにより、本発明は、好ましい抗癌作用を発揮することができ、かつ、成分（Ａ）と成分（Ｂ）との相乗効果がより顕著に発揮される。従って、成分（Ｂ）の副作用は、成分（Ａ）と併用することにより、大幅に低減でき、又は全く示されないレベルにまで低減させることができる。
　本発明の実施態様において、成分（Ｂ）は、成分（Ａ）の抗癌作用を増強させる。本発明の別の実施態様において、成分（Ａ）は、成分（Ｂ）の抗癌作用を増強させる。
　成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を投与することにより、癌の予防または治療方法を提供することができる。成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の投与は、同時であってよく、同時でなくてもよい。
　本発明において成分（Ａ）及び成分（Ｂ）は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトに投与される。
　また、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の投与経路は、同じであってよく、異なっていてもよい。投与経路は、経口、経静脈、経動脈、皮下、筋肉内、経肺を含む任意の経路であってよい。
　一実施態様において、成分（Ａ）の投与は、経口投与であり、かつ、成分（Ｂ）の投与は、経静脈投与である。別の実施態様において、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）は、ともに経口投与である。別の実施態様において、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）は、ともに経静脈投与である。
　本発明において、成分（Ｂ）は、成分（Ａ）と併用することで、成分（Ｂ）単剤の場合よりも非常に低い量（例えば、１０2分の１以下、１０3分の１以下、１０4分の１以下、１０5分の１以下、１０6分の１以下、１０7分の１以下、１０8分の１以下）で抗癌作用を示すことから、成分（Ａ）とともに製剤化することができる。本発明の医薬は、経口、経静脈、経動脈、皮下、筋肉内、経肺を含む任意の経路に適するように製剤化することができる。本発明の製剤は、例えば、エアゾール剤、液剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、坐剤、錠剤、注射剤、粉剤を含む、任意の剤形に製剤化できる。
　好ましくは、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を含む本発明の製剤は、リポソーム製剤である。本発明は、リポソーム製剤であることにより、溶解度の異なる成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を効率よく含むことができる。
　本発明の癌の予防または治療剤の対象となる癌種には血液癌だけでなく固形癌が含まれる。血液癌としては、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫が挙げられる。固形癌としては、具体的には、頭頸部癌、消火器癌（食道癌、胃癌、十二指腸癌、肝臓癌、胆道癌（胆嚢・胆管癌など）、膵臓癌、小腸癌、大腸癌（結腸直腸癌、結腸癌（結腸腺癌を含む）、直腸癌など）、消化管間質腫瘍など）、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、乳癌、卵巣癌、子宮癌（子宮頸癌、子宮体癌など）、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、肉腫（線維肉腫、滑膜肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫など）等が挙げられる。なお、ここで癌には、原発巣のみならず、他の臓器（肝臓など）に転移した癌も含む。
　成分（Ａ）又は成分（Ｂ）、それぞれ単独では固形癌に有効性は認められないが、本発明の成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を組み合わせてなる癌の予防または治療剤は、後記実施例に示すように多くの固形癌に対して優れた増殖抑制効果を示す。
　本発明の癌の予防または治療剤の投与形態は、各成分が通常採用されている投与形態でもよいが、両成分を含有する医薬組成物（配合剤）とするのが好ましい。成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を含有する医薬組成物の形態としては、経口投与製剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示できるが、経口投与製剤又は経静脈投与製剤が好ましい。
　これらの投与形態は、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）に加えて、薬学的に許容される担体を用いて、通常公知の方法により調製することができる。斯かる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。
　成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を含有する医薬組成物とするにあたっては、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を含むカプセル製剤とするのが好ましい。本発明は、カプセル剤であることにより、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を好ましい量比又はモル比で含ませることができ、本発明の抗癌効果を効率的に発揮させることができる。カプセルは、硬カプセルでも軟カプセルでもよいが、硬カプセルが好ましい。カプセルの内封物は、例えば、粉末として、成分（Ａ）が１ｍｇ～２０ｍｇ（好ましくは１０ｍｇ又は１５ｍｇ）、成分（Ｂ）が１００ｎｇ～１０μｇ（好ましくは１μｇ又は１．５μｇ）、Ｄ－マンニトール１０ｍｇ～１０００ｍｇ（好ましくは１００ｍｇ）、セルロース１ｍｇ～５０ｍｇ（好ましくは３５ｍｇ）、部分α化デンプン１ｍｇ～３ｍｇ（好ましくは２．５ｍｇ）、及びステアリン酸マグネシウム１ｍｇ～５ｍｇ（好ましくは３ｍｇ）であってよい。
　成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を含有する医薬組成物とするにあたっては、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）がリポソームに内包されているリポソーム製剤とするのも好ましい。リポソーム製剤は、リポソーム、すなわち脂質二分子膜内に成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を内包した形態の製剤である。
　リポソームを形成するリン脂質類としては、リン脂質およびポリエチレングリコール修飾リン脂質から選ばれる１種または２種以上が挙げられる。また、これらのリン脂質類に加えて膜安定化作用を有するコレステロールを併用することもできる。
　リポソームを形成するリン脂質としては、（１）卵黄レシチン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、水素化ダイズホスファチジルコリン等のジアシル基が飽和又は不飽和のリン脂質、（２）親水基がエタノールアミン、セリン、イノシトール、グリセロールであるアシル基が飽和又は不飽和のリン脂質、（３）アシル基がリソ体であるリン脂質のいずれでも良く、もちろん上記複数の組み合わせでも良い。
　また、ポリエチレングリコール修飾リン脂質としては、ポリエチレングリコール修飾ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ポリエチレングリコール修飾ジアシルホスファチジルグリセロール等が挙げられる。ここでリン脂質へのポリエチレングリコール修飾形態は、メトキシポリエチレングリコール修飾ジアシルホスファチジルエタノールアミン、またはポリエチレングリコールオキシカルボニルジアシルホスファチジルエタノールアミドが挙げられる。ポリエチレングリコール修飾リン脂質を用いるとリポソームの血中滞留性が向上するため好ましい。
　ポリエチレングリコール修飾リン脂質の具体例としては、ポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、メトキシポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ポリエチレングリコール修飾水素化ダイズホスファチジルエタノールアミンおよびポリエチレングリコール修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。
　これらのリポソーム形成脂質としては、成分（Ａ）と成分（Ｂ）の内封率の点から、リン脂質とコレステロールの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾リン脂質とコレステロールの組み合わせ、またはリン脂質とポリエチレングリコール修飾リン脂質とコレステロールの組み合わせが好ましい。さらには、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ジパルミトイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾水素化ダイズホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾水素化ダイズホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとの組み合わせがより好ましい。さらには、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンと、ポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルとエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせがさらに好ましく、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンと、ポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルとエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせが最も好ましい。
　また、リン脂質とコレステロールとのモル比は、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の内封率の点から、１０：１～１０：１０が好ましく、５：１～５：５がより好ましく、２：１～４：３がさらに好ましく、特に３：２が好ましい。また、ポリエチレングリコール修飾リン脂質を用いる場合には、当該ポリエチレングリコール修飾リン脂質とコレステロールとのモル比は、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の内封率の点およびリポソームの血中滞留性向上の点から、０．００５：１～１：１が好ましく、０.０１：１～０．５：１がより好ましく、０.１：１～０．２：１が更に好ましい。
　このようにリポソーム製剤とすることにより、溶解性の異なる成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を好ましいモル比で効率よく治療部位に送達することができる。
　リポソーム製剤の製造法としては、水和法、逆相蒸発法、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、凍結融解法等が挙げられる。ここで、リポソーム中に成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を内封させる場合、成分（Ａ）を内封させ、次いで成分（Ｂ）を内封させる手段を採用することにより、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の両者の内封率が向上する。具体的には、リン脂質およびポリエチレングリコール修飾リン脂質からなる群から選ばれる１種又は２種以上と、コレステロールとを用いてリポソームを調製する工程、および、
　前記リポソームに成分（Ａ）を混合する工程の後に、成分（Ｂ）を混合する工程を採用することにより、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）の両者の内封率が向上したリポソーム製剤が得られる。
　本発明の成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を内包したリポソーム製剤は、有効成分の内封率が高いため、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を効率よく投与することができる。好ましくは、本発明の成分（Ａ）及び成分（Ｂ）を内包したリポソーム製剤は、経口投与及び経静脈投与を含む様々な投与手段に使用可能であり、癌の予防または治療剤として有用である。
　本発明の癌の予防または治療剤の製剤例としては、（Ａ－１）～（Ａ－３）から選ばれる製剤と（Ｂ－１）及び（Ｂ－２）から選ばれる製剤の組み合わせ、又は（Ｃ－１）若しくは（Ｃ－２）の製剤が挙げられる。これらの製剤は、本発明の方法又は当業者に周知の方法に従って製剤化できる。
（Ａ－１）パノビノスタット含有カプセル
　パノビノスタットに、糖類（例えばＤ－マンニトール）、セルロース、（部分アルファ化）デンプン及びステアリン酸マグネシウムを含有する粉末又は顆粒をゼラチンカプセル（例えば酸化チタン、青色１号及び三二酸化鉄含有）に充填したカプセル。
（Ａ－２）パノビノスタット含有錠
　パノビノスタットに、糖類（例えばＤ－マンニトール）、セルロース、（部分アルファ化）デンプン及びステアリン酸マグネシウムを含有する錠剤。
（Ａ－３）パノビノスタット含有注射剤（静脈内投与用）
　パノビノスタットを含むリポソーム（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン、コレステロール及びメトキシポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン含有）含有製剤。
（Ｂ－１）ビンクリスチン含有注射剤（静脈内投与用）
　ビンクリスチン及び乳糖水和物を含有する凍結乾燥製剤。
（Ｂ－２）ビンクリスチン含有注射剤（静脈内投与用）
　ビンクリスチンを含むリポソーム（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン、コレステロール及びメトキシポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン含有）含有製剤。
（Ｃ－１）２剤封入リポソーム製剤
　パノビノスタット及びビンクリスチンを含むリポソーム（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン及びコレステロール含有）含有製剤。
（Ｃ－２）２剤封入リポソーム製剤
　パノビノスタット及びビンクリスチンを含むリポソーム（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン、コレステロール及びメトキシポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン含有）含有製剤。
　次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されない。
実施例１（パノビノスタットとの併用抗癌剤の探索）
１．実験方法
（スクリーニング１）パノビノスタットとの２剤併用による癌細胞の生存率の低下を指標として、併用抗癌剤のスクリーニングを実施した。
　使用ライブラリー：ＬＴＴバイオファーマ既承認薬ライブラリー（株式会社ＬＴＴバイオファーマから入手した）
　使用細胞：Ｃｏｌｏｎ２６　ＮＬ－１７マウス結腸癌細胞株（（財）癌研究会　癌化学療法センターから入手した）
　ＨＤＡＣ阻害剤：パノビノスタット
　陰性コントロール：未処理
　コントロール：パノビノスタット単独添加（１．０μＭ）
　サンプル群：パノビノスタット（０．０１μＭ、０．１μＭ、１．０μＭ）および既承認薬ライブラリー化合物（１．０μＭ）併用添加群
　評価：Ｃｏｌｏｎ２６　ＮＬ－１７マウス結腸癌細胞株を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ－ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。Ｃｏｌｏｎ２６　ＮＬ－１７マウス結腸癌細胞株を播種（３，０００細胞／ウェル、３７℃）してから２４時間後に、未処理、パノビノスタット単独（１．０μＭ）、またはパノビノスタット（１．０μＭ）と既承認薬ライブラリー化合物（１．０μＭ）との併用でそれぞれ処理し、その４８時間後にＷＳＴ－８アッセイにて前記細胞の生存率の低下を評価した。この結果、パノビノスタット単独添加の生存率の７割以下になっている併用添加群の既承認薬ライブラリー化合物を選別した。
　次に、併用添加群についてパノビノスタットの最終濃度０．０１μＭおよび０．１μＭを追加した以外は上記と同様の方法で再評価を行い、全ての濃度を通じてパノビノスタット単独添加群の生存率の５割以下になっている併用添加群の既承認薬ライブラリー化合物を選別した。
（スクリーニング２）細胞をＨＣＴ１１６ヒト結腸腺癌細胞株に代えた以外はスクリーニング１と同様の方法で、パノビノスタットとの２剤併用による癌細胞の生存率の低下を指標として、併用抗癌剤のさらなるスクリーニングを実施した。
（スクリーニング３）スクリーニング１および２によりスクリーニングされた既承認薬ライブラリーの化合物について、２種類の細胞でパノビノスタットとの２剤併用による癌細胞の生存率の低下を評価して、併用抗癌剤をスクリーニングした。
　使用細胞：ＨＣＴ１１６ヒト結腸腺癌細胞株（ＨＣＴ１１６）（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した）
　Ｃｏｌｏｎ２６　ＮＬ－１７マウス結腸癌細胞株（Ｃ２６ＮＬ１７）
　サンプル群：パノビノスタット（１μＭ）および既承認薬ライブラリー化合物（１μＭ）
　併用添加群
　　　＋‥パノビノスタット（１μＭ）添加した併用群
　　　－‥パノビノスタット未添加のライブラリー化合物群
　評価：スクリーニング１と同様にして、上記細胞における生存率の低下を評価した。
２．実験結果
（スクリーニング１）
　パノビノスタット（１μＭ）単独添加群の生存率の７割以下になっている併用添加群の既承認薬ライブラリー化合物を選別した。その結果、９２化合物に絞り込まれた。
　その９２化合物を用い、併用添加群におけるパノビノスタットの最終濃度を０．０１μＭ、０．１μＭ、１．０μＭと変更して再評価を行い、全ての濃度を通じてそれぞれパノビノスタット単独添加群の生存率の５割以下になっている併用添加群の既承認薬ライブラリー化合物を選別した。その結果、３４化合物に絞り込まれた。
（スクリーニング２、３）
　ＨＣＴ１１６ヒト結腸腺癌細胞株を用いたスクリーニングにおいて高い併用効果を示した化合物を選択した結果、４化合物のチューブリン阻害薬が含まれていた（図１）。
実施例２（α－チューブリン染色によるパノビノスタットとビンクリスチン併用時の微小管の観察）
１．実験材料
　パノビノスタット　０．０１μＭ
　ビンクリスチン　０．０１μＭ
　Ａｎｔｉ－α－ｔｕｂｕｌｉｎ　ｐＡｂ（ＭＢＬ）
　Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
　マウント剤（Ｐｅｒｍａ　Ｆｌｕｏｒ：Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
　ＤＡＰＩ（１ｍｇ／ｍＬ）（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
２．実験方法
　ＨＣＴ１１６ヒト結腸腺癌細胞株を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ－ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。ＨＣＴ１１６細胞をノンコートガラスプレート（松浪硝子工業）に７．０×１０4細胞／１５０μＬずつ播種し、コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）（薬剤無添加群）、パノビノスタット（ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）０．０１μＭ、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）０．０１μＭ、パノビノスタット０．０１μＭとビンクリスチン０．０１μＭとの併用（併用）の終濃度となるようそれぞれ１０μＬ添加した後、１２時間、３７℃、５％ＣＯ2にてインキュベートした。
　これを８時間インキュベートしたものを染色用サンプルとした。その後、薬液をアスピレートし、ＰＢＳ（－）にて２回洗浄し、－２０℃の冷凍庫で冷やしたメタノールにプレートを浸し、１０分間固定した。１５０μＬの３％ウシ血清アルブミン－ＰＢＳ溶液（ＢＳＡ－ＰＢＳ）で室温にて６０分間ブロッキングし、ブロッキング液をアスピレートした後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで１０００倍希釈したａｎｔｉ－α－ｔｕｂｕｌｉｎ抗体を７５μＬ添加し、室温で１時間反応させた。次にＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで１０００倍希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８を７５μＬ添加し、遮光下室温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、マウント剤を１滴ずつ滴下し、１μＬのＤＡＰＩを加えてピペッティングし、カバーガラス（松浪硝子工業）をかぶせ封入した。マウント剤が十分乾燥した後、共焦点レーザースキャン顕微鏡（Ａ１Ｒ+、Ｎｉｋｏｎ）で観察した。
３．実験結果
　図２及び図３に示すように、コントロールと比べて、パノビノスタット添加群では微小管が伸長したものが多いという点が特徴的であった。ビンクリスチン添加群では細胞周期がＭ期で停止し、微小管が２つに分裂したものが多数見られた。パノビノスタットとビンクリスチン併用群ではこの２つの特徴が混在したものやパノビノスタットだけの特徴を反映したもの、ビンクリスチンだけの特徴を反映したもの、さらには多極紡錘体（ｍｕｌｔｉ－ｐｏｌａｒ　ｓｐｉｎｄｌｅ）が見られた。
実施例３（タイムラプス　イメージングを用いた死細胞の観察）
１．実験方法
（細胞播種）
　ＥＺＶＩＥＷ培養２４－穴プレートＬＢ　カバーガラスボトム（ＩＷＡＫＩ）に１．５×１０4細胞／５００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう細胞を播種し、ＨＣＴ１１６細胞培養メディウム中で、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間インキュベートした。
（タイムラプスによる細胞の観察）
　まず、カバーガラスボトムを埋め込むためのステージを取り付けた。ＩＮＵ、Ｔｅｒｍｏ　ｐｌａｔｅ、ＭＩＸ　ＧＡＳ、ＬＥＮＳ　ＰＯＷＥＲの電源を全てつけた後、ＣＯ2のボンベの栓を開けた。ステージの隙間に水２０ｍＬを流し込ませた。共焦点レーザースキャン顕微鏡（Ａ１Ｒ＋，Ｎｉｋｏｎ）の電源をつけ、ライブモードで細胞とピントを合っているのかを確認した。ピントが合うのを入念に確認後、パノビノスタットは１０ｎＭ、ビンクリスチンは３ｎＭとなるように２剤併用を細胞に添加した。
２．実験結果
　２剤を添加後、共焦点レーザー顕微鏡を用いてタイムラプスによる細胞の観察を行った。その結果、２剤を添加後のおよそ６時間ごろに、細胞内で核の凝集している様子が観察され、それ以降にＤＮＡの断片化が起きている様子が観察された（図４）。これにより、２剤併用によってＨＣＴ１１６細胞のアポトーシスが引き起こされることが分かった。
実施例４（細胞増殖抑制効果の検討）
（１）ヒト結腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞
１．実験方法
（サンプルの調製）
　パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ１０μＬ、Ｌ－（＋）－アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ－（＋）－アルギニンで希釈し、０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭおよび１０μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭおよび１０μＭとなるようにＬ－（＋）－アルギニンで希釈し調製した。
（ＨＣＴ１１６細胞の細胞調製）
　ＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ－ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ－ＰＢＳ（－）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．単剤による細胞増殖抑制試験
　ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタットまたはビンクリスチンの終濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭまたは１μＭとなるようそれぞれ２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
　ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１６０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタット単独で最終濃度０．００３μＭ、あるいはパノビノスタット最終濃度０．００３μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭまたは１μＭの併用となるように２０μＬずつ添加し、それぞれ３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｃ．併用による細胞増殖抑制試験
　パノビノスタットの最終濃度を０．０１μＭにした以外は「Ａ．単剤による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で細胞を処理した後、生細胞数を算出した。
　細胞増殖抑制試験のデータを解析し、相乗効果の指標としてＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）値を求めた。ＣＩ値は、ＣｏｍｐｕＳｙｎ社の「ＣｏｍｐｕＳｙｎ　ｆｏｒ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｄｏｓｅ－Ｅｆｆｅｃｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　Ｔｉｎｇ－Ｃｈａｏ　Ｃｈｏｕ」を用いて算出した。
２．実験結果
Ａ．単剤による細胞増殖抑制効果を図５に示す。
Ｂ．パノビノスタット０．００３μＭとビンクリスチンの併用による効果を図６に示す。
Ｃ．パノビノスタット（Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）０．０１μＭとビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）の併用による効果を図７に示す。
　併用による効果を評価するため、パノビノスタット濃度は、単剤処理において細胞増殖抑制効果の低かった０．００３μＭと０．０１μＭに設定した。それぞれ濃度をふったビンクリスチンと併用し、細胞増殖抑制効果を検討した。
　パノビノスタット０．００３μＭ併用群では、パノビノスタット単独の場合に細胞生存率の低下が認められなかったところ、ビンクリスチン０．００３μＭ及び０．０１μＭとの併用群では、ビンクリスチン単独の場合よりも細胞生存率を低下させ、癌細胞増殖抑制効果を有することが示された。またその併用効果は、ビンクリスチンの濃度が低いほど、顕著に示された（図５～図６）。
　一方、パノビノスタット０．０１μＭ併用群では、０．３μＭのビンクリスチン単剤と同程度またはそれ以上の効果を、およそ１００倍濃度の薄い０．００３μＭのビンクリスチンで得ることができた（１μＭビンクリスチン単剤：８６．３％抑制、０．３μＭビンクリスチン単剤：８２．９％抑制、０．００３μＭビンクリスチン＋パノビノスタット０．０１μＭ：８４．４％抑制）。このことから、特に０．０１μＭのパノビノスタットを用いた場合、ビンクリスチンと併用することにより、癌細胞の細胞増殖抑制効果が劇的に向上することが示された。またその併用効果は、ビンクリスチンの濃度が低いほど、顕著に示された（図６及び図７）。
　ＣＩ値は、０に近いほど相乗効果が高いと評価でき、１付近の場合に相加効果ありと評価でき、１を上回って大きくなるほど相加及び相乗効果が小さいと評価できる。ＣＩ値は下記表の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＣＩ値から、パノビノスタットとビンクリスチンとは癌細胞（ＨＣＴ１１６）の細胞増殖抑制について相乗効果を示すこと、及びその相乗効果はビンクリスチンが低濃度の場合により顕著であったことが示された。
Ｄ．併用による細胞増殖抑制試験
　ビンクリスチン単独で最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭあるいは０．０３μＭとパノビノスタット最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭまたは０．３μＭの併用となるように２２．５μＬずつ添加した以外は「Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で細胞を処理した後、生細胞数を算出した。
　また、Ｄ．の結果より、癌細胞増殖抑制におけるパノビノスタットの併用効果は、パノビノスタット単剤である程度癌細胞増殖抑制効果が見られる濃度で発揮されることが示された（図８～図１０）。
　また、ＣＩ値は下記表の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　これらの結果から、癌細胞（ＨＣＴ１１６）の細胞増殖抑制について、パノビノスタットが所定の濃度範囲である場合にビンクリスチンとの相乗効果が発揮されること、及びパノビノスタットとビンクリスチンとの濃度比（モル比）が相加又は相乗効果の発揮に影響することが示された。
実施例５（ヒト結腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞（ビンクリスチン極低濃度（ｎＭオーダー）））
１．実験方法
（サンプルの調製）
　パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ１０μＬ、Ｌ－（＋）－アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ－（＋）－アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭまたは３０ｎＭとなるようにＬ－（＋）－アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
　ヒト結腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ－ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ－ＰＢＳ（－）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
　ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、または３ｎＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
　ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。最終濃度０．０１μＭのパノビノスタット単独（ｐａｎｏ　ｏｎｌｙ）、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、または３ｎＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
２．実験結果
　ビンクリスチン単独ではまったくあるいはほとんど癌細胞の増殖抑制効果が得られない低濃度域においても、パノビノスタットと併用することで、癌細胞の増殖抑制効果が観察された（図１１、図１２）。
実施例６（ヒト結腸腺がん細胞株ＨＣＴ１１６細胞（ビンクリスチン極低濃度（ｎＭオーダー以下）））
１．実験方法
（サンプルの調製）
　パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ　１０μＬ、Ｌ－（＋）－アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ－（＋）－アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．０３ｐＭ、０．１ｐＭ、０．３ｐＭ、１ｐＭ、３ｐＭ、１０ｐＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭまたは１０ｎＭとなるようにＬ－（＋）－アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
　ヒト結腸腺がん細胞株ＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ－ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ－ＰＢＳ（－）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
　ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．００３ｐＭ、０．０１ｐＭ、０．０３ｐＭ、０．１ｐＭ、０．３ｐＭ、１ｐＭ、０．００３ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭまたは１ｎＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
　ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。最終濃度０．０１μＭのパノビノスタット単独（ｐａｎｏ　ｏｎｌｙ）、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３ｐＭ、０．０１ｐＭ、０．０３ｐＭ、０．１ｐＭ、０．３ｐＭ、１ｐＭ、０．００３ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭまたは１ｎＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
　また、細胞増殖抑制試験のデータを解析し、相乗効果の指標としてＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）値を求めた。ＣＩ値は、ＣｏｍｐｕＳｙｎ社の「ＣｏｍｐｕＳｙｎ　ｆｏｒ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｄｏｓｅ－Ｅｆｆｅｃｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　Ｔｉｎｇ－Ｃｈａｏ　Ｃｈｏｕ」を用いて算出した。
２．実験結果
　ビンクリスチン単独ではまったくあるいはほとんど癌細胞の増殖抑制効果が得られない低濃度域においても、パノビノスタットと併用することで、癌細胞の増殖抑制効果が観察された（図１３、図１４）。
　また、ＣＩ値は下記表の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＣＩ値から、癌細胞（ＨＣＴ１１６）の細胞増殖抑制についてのパノビノスタットとビンクリスチンとの相乗効果は、ビンクリスチンがｎＭオーダー以下の極低濃度であっても発揮されることが示された。
実施例７（ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０細胞）
１．実験方法
（サンプルの調製）
　パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ　１０μＬ、Ｌ－（＋）－アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ－（＋）－アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭおよび０．３μＭとなるようにＬ－（＋）－アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
　ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ社から入手した）を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ－ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ－ＰＢＳ（－）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
　ＨＴ１０８０細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
　ＨＴ１０８０細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタット最終濃度０．０１μＭ（ｐａｎｏ　ｏｎｌｙ）、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭおよび０．０３μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
２．実験結果
　ビンクリスチン単剤で癌細胞の細胞増殖抑制効果がまったく見られなかった濃度で、パノビノスタットと併用することにより、癌細胞の細胞増殖抑制効果が示された。特に、低濃度のビンクリスチンを用いた場合に、パノビノスタットとの併用効果が高いことが示された。
　また、ビンクリスチン単剤で約７０％の癌細胞の細胞増殖抑制効果を示す濃度においても、パノビノスタットと併用することにより、癌細胞の細胞増殖抑制効果がさらに向上することが示された（図１５、図１６）。
実施例８（ヒト子宮癌由来細胞株ＨｅＬａ細胞）
１．実験方法
（サンプルの調製）
　パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ　１０μＬ、Ｌ－（＋）－アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ－（＋）－アルギニンで希釈し、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、０．５μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭおよび０．３μＭとなるようにＬ－（＋）－アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
　ヒト子宮癌由来細胞株ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから入手した）を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ－ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ－ＰＢＳ（－）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．ビンクリスチンおよびパノビノスタット単剤による細胞増殖抑制試験
　ＨｅＬａ細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。また、パノビノスタットの最終濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭおよび０．０５μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
　ＨｅＬａ細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタット最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭおよび０．０５μＭとビンクリスチン最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭおよび０．０３μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
　細胞増殖抑制試験のデータを解析し、相乗効果の指標としてＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）値を求めた。ＣＩ値は、ＣｏｍｐｕＳｙｎ社の「ＣｏｍｐｕＳｙｎ　ｆｏｒ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｄｏｓｅ－Ｅｆｆｅｃｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　Ｔｉｎｇ－Ｃｈａｏ　Ｃｈｏｕ」を用いて算出した。
２．実験結果
　パノビノスタットがほとんど殺癌細胞効果を示さない濃度とビンクリスチンが全く殺癌細胞効果を示さない濃度を併用しても劇的な殺癌細胞効果の増強が見られた（図１７～図２２）。
　またＣＩ値は下記表の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　これらの結果から、パノビノスタットとビンクリスチンとは癌細胞（ＨｅＬａ）の細胞増殖抑制について相乗効果を示すこと、及びその相乗効果はパノビノスタット及びビンクリスチンがそれぞれ低濃度である場合により顕著である傾向が示された。
実施例９（ヒト乳癌由来細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞）
１．実験方法
（サンプルの調製）
　パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ　１０μＬ、Ｌ－（＋）－アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ－（＋）－アルギニンで希釈し、０．３μＭ、０．５μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭおよび０．３μＭとなるようにＬ－（＋）－アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
　ヒト乳癌由来細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ＡＴＣＣから入手した）を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ－ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ－ＰＢＳ（－）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．ビンクリスチンおよびパノビノスタット単剤による細胞増殖抑制試験
　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。また、パノビノスタットの最終濃度が０．０３μＭおよび０．０５μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタット最終濃度０．０３μＭおよび０．０５μＭとビンクリスチン最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭおよび０．０３μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
２．実験結果
　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞においてもパノビノスタットに低濃度のビンクリスチンを併用させることで劇的な殺癌細胞効果の増強が見られた（図２３、図２４）。
実施例１０（正常細胞における細胞増殖抑制効果の検討）
１．実験方法
（サンプルの調製）
　パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ　１０μＬ、Ｌ－（＋）－アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ－（＋）－アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭおよび０．３μＭとなるようにＬ－（＋）－アルギニンで希釈し調製した。
（細胞調製）
　マウス内皮細胞株２Ｈ１１細胞（ＡＴＣＣから入手した）を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ－ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ－ＰＢＳ（－）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
　２Ｈ１１細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
　２Ｈ１１細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。最終濃度０．０１μＭパノビノスタット単独（ｐａｎｏ　ｏｎｌｙ）、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭまたは０．０３μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
２．実験結果
　正常細胞である２Ｈ１１細胞において、ビンクリスチンとパノビノスタットとの併用は、細胞増殖抑制効果をほとんどあるいはまったく示さなかった。これらの結果から、パノビノスタットとビンクリスチンの併用に係る細胞増殖抑制効果は、癌細胞特異的であるとともに、正常細胞に対する毒性が低いことが示された。なお、ビンクリスチン単独、およびパノビノスタット単独も同様に、正常細胞に対する毒性は低いことが示された（図２５、図２６）。
実施例１１（他のＨＤＡＣ阻害剤との比較）
１．実験方法
（サンプルの調製）
　パノビノスタット、ボリノスタット、ベリノスタット、あるいはモセチノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ　１０μＬ、Ｌ－(＋)－アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ－（＋）－アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液、５μＭのボリノスタット溶液、２μＭのベリノスタット溶液、１０μＭのモセチノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭまたは１０μＭとなるようにＬ－（＋）－アルギニンで希釈し調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（細胞調製）
　ヒト結腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。Ｄ－ＭＥＭ（高グルコース）に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ－ＰＢＳ（－）溶液で細胞を剥がし、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ.ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
　ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．パノビノスタット併用による細胞増殖抑制試験
　ＨＣＴ１１６細胞を３．０×１０3細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。最終濃度０．０１μＭのパノビノスタット単独、パノビノスタット最終濃度０．０１μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地を５％ＣＣＫ－８含有培地に交換し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｃ．ボリノスタット併用による細胞増殖抑制試験
　最終濃度０．５μＭのボリノスタット単独、ボリノスタット最終濃度０．５μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加した以外は「Ｂ．パノビノスタット併用による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で行い、生細胞数を算出した。
Ｄ．ベリノスタット併用による細胞増殖抑制試験
　最終濃度０．２μＭのベリノスタット単独、ベリノスタット最終濃度０．２μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加した以外は「Ｂ．パノビノスタット併用による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で行い、生細胞数を算出した。
Ｅ．モセチノスタット併用による細胞増殖抑制試験
　最終濃度１μＭのモセチノスタット単独、モセチノスタット最終濃度１μＭとビンクリスチン最終濃度０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、または１μＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加した以外は「Ｂ．パノビノスタット併用による細胞増殖抑制試験」と同様の方法で行い、生細胞数を算出した。
２．実験結果
　パノビノスタットとビンクリスチンの併用は、他のＨＤＡＣ阻害剤（ボリノスタット、ベリノスタット、モセチノスタット）とビンクリスチンを併用した場合と比較して顕著に高い併用効果を示し、効果的に癌細胞の増殖を抑制した（図２７～図３０）。
実施例１２（マウス白血病細胞株ｐ３８８細胞に対する併用効果）
１．実験方法
（サンプルの調製）
　パノビノスタット３００μｇに対しＤＭＳＯ　１０μＬ，Ｌ－（＋）－アルギニン９９０μＬの割合でパノビノスタットを溶解したのち、Ｌ－（＋）－アルギニンで希釈し、０．１μＭのパノビノスタット溶液を調製した。また、ビンクリスチンは、濃度が０．００３μＭ，０．０１μＭ，０．０３μＭ，０．１μＭおよび０．３μＭとなるようにＰＢＳで希釈し調製した。
（細胞調製）
　マウス白血病細胞株ｐ３８８細胞を３７℃、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2存在下で培養した。ＲＰＭＩ　１６４０培地に非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％となるように添加し、さらに１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとなるように添加した培地を用いて培養した。細胞を回収した後、４℃、２００ｇ、室温で５分間遠心した。再懸濁後、細胞数を計算し、継代または細胞調製を行った。
（細胞増殖抑制試験）
Ａ．ビンクリスチン単剤による細胞増殖抑制試験
　ｐ３８８細胞を１．０×１０4細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。ビンクリスチンの最終濃度が０．２５，０．５，１，２ｎＭまたは４ｎＭとなるように２０μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地にＣＣＫ－８を５％含有培地となるように添加し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ，対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
Ｂ．併用による細胞増殖抑制試験
　ｐ３８８細胞を１．０×１０4細胞／ウェルとなるように、９６－ウェルプレートに１８０μＬずつ播種し、５％ＣＯ2存在下３７℃で２４時間培養した。パノビノスタット最終濃度０．１μＭ（ｐａｎｏ　ｏｎｌｙ）、パノビノスタット最終濃度０．１μＭとビンクリスチン最終濃度０．２５，０．５，１，２ｎＭまたは４ｎＭの併用（併用群）となるように２２．５μＬずつ添加後、３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルの培地にＣＣＫ－８を５％含有培地となるように添加し、さらに３時間インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ，対照波長６３０ｎｍ）、生細胞数を算出した。
２．実験結果
　マウス白血病細胞においてもパノビノスタットとビンクリスチンの相乗効果が示された。このことから、２剤の併用は血液がんに対しても有効であることが示唆された（図３１）。
実施例１３（２剤内封リポソーム）
（１）脂質組成検討
１．実験方法
　パノビノスタットとビンクリスチンの定量法の確立
（リポソームの崩壊）
　パノビノスタットとビンクリスチンを内封したリポソームをメタノールで崩壊させ、内封率を測定した。
（ＨＰＬＣ条件）
ＨＰＬＣ装置：
　オートサンプラー　　　Ｌ－２２００　　ＨＩＴＡＣＨＩ
　ＵＶ検出器　　　　　　Ｌ－２４００　　ＨＩＴＡＣＨＩ
　ポンプ　　　　　　　　Ｌ－２１３０　　ＨＩＴＡＣＨＩ
　カラム　　　　　　　　Ｌ－２３５０　　ＨＩＴＡＣＨＩ
カラム：ＴＳＫ　ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０Ｔｓ　ＱＡ（４．６×１５０ｍｍ）
測定時間：４０ｍｉｎ
移動相：Ａ液　０．１％リン酸
　　　　Ｂ液　アセトニトリル
　　　　０　　　　　ｍｉｎ　　　Ａ／Ｂ＝１００／０
　　　　０→１０　　ｍｉｎ　　　Ａ／Ｂ＝１００／０→７０／３０
　　　　１０→２０　ｍｉｎ　　　Ａ／Ｂ＝７０／３０→２０／８０
　　　　２０→３０　ｍｉｎ　　　Ａ／Ｂ＝２０／８０→１００／０
　　　　３０→４０　ｍｉｎ　　　Ａ／Ｂ＝１００／０→１００／０
注入量：１０μＬ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３５℃
検出波長：２９５ｎｍ
　ＨＰＬＣ測定は、すべて上記条件で行った。
２剤内封リポソームの作製
（脂質の溶解）
　ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）は１００ｍＭとなるようにクロロホルムに溶解した。
（リポソーム組成（モル比））
　ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２
　ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２
　ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２
（２剤内封リポソームの調製）
　１００ｍＭのＤＰＰＣ、ＨＳＰＣあるいはＤＳＰＣ３００μＬと１００ｍＭのＣｈｏｌ２００μＬをナス型フラスコに分取し、ロータリーエバポレーターで減圧下クロロホルムを留去し、１時間以上真空ポンプにて減圧乾固した。２５０ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ３．０）を１ｍＬ加えて水和後、液体窒素を用いて凍結融解を３回行った。押出機（Ｌｉｐｅｘ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用し、１００ｎｍ孔径のポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ　Ｔｒａｃｋ－Ｔｅｃｈ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｗｈａｔｍａｎ　Ｌｔｄ．）を用いてエクストルージョンによりリポソームのサイズを約１００ｎｍに調整した。リン酸バッファ（ｐＨ７．４）にて希釈し、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）後、上清を除去し、沈殿したリポソームをビンクリスチン２００μｇを溶解したＰＢＳ８００μＬで再懸濁し、振盪インキュベート（８０℃、６５０ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）した。次に、パノビノスタット１．０４８ｍｇを溶解したＤＭＳＯ２０μＬを加えボルテックスし、振盪インキュベート（８０℃、６５０ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）し、室温で冷却した。その後、再び超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）し、上清を除去し、沈殿したリポソームをＰＢＳ１ｍＬで再懸濁した。リポソーム：メタノール＝２０μＬ：３８０μＬで混合し、ＨＰＬＣでパノビノスタットとビンクリスチンを定量した。
２．実験結果
　パノビノスタットおよびビンクリスチンの内封率は、リポソームの組成がＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２である場合に最も高く、リポソームの組成がＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２である場合に比較的高く、リポソームの組成がＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２である場合に比較的低いことが示された（図３２）。
実施例１４（２剤内封リポソームの作製法の改良）
１．実験方法
パノビノスタットとビンクリスチンの定量法の確立
　以下に記載する事項以外は実施例９と同様にしてリポソームを作製し、パノビノスタットおよびビンクリスチンの内封率を測定した。
２剤内封リポソームの作製
（脂質の溶解）
　ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）は１００ｍＭとなるようにクロロホルムに溶解した。
（リポソーム組成）
　ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／２（モル比）
（２剤内封リポソームの調製）
　１００ｍＭのＤＳＰＣ３００μＬと１００ｍＭのＣｈｏｌ２００μＬをナス型フラスコに分取し、ロータリーエバポレーターで減圧下クロロホルムを留去し、１時間以上真空ポンプにて減圧乾固した。２５０ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ３．０）を１ｍＬ加えて水和後、液体窒素を用いて凍結融解を３回行った。押出機（Ｌｉｐｅｘ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用し、１００ｎｍ孔径のポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ　Ｔｒａｃｋ－Ｔｅｃｈ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｗｈａｔｍａｎ　Ｌｔｄ．）を用いてエクストルージョンによりリポソームのサイズを約１００ｎｍに調整した。ＰＢＳにて希釈し、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）後、上清を除去し、沈殿したリポソームをＰＢＳ８００μＬで再懸濁した。パノビノスタット１．０４８ｍｇを２０μＬのＤＭＳＯに溶解したものにこのリポソーム再懸濁液を少量ずつボルテックスしながら加え、全量混和した後約２分間ボルテックスし、振盪インキュベート（８０℃、６５０ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）した後氷中で急冷した。その後、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）し、上清の体積を測定し、沈殿したリポソームをＰＢＳ７００μＬで再懸濁した（パノビノスタット内封リポソーム）。ビンクリスチン２４４μｇをＰＢＳ１５０μＬで溶解し、パノビノスタット内封リポソームを少量ずつボルテックスしながら加え、全量混和した後約２分間ボルテックスし、振盪インキュベート（８０℃、６５０ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）した後氷中で急冷した。その後、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）し、上清の体積を測定し、沈殿したリポソームをＰＢＳ８４０μＬで再懸濁した（２剤内封リポソーム）。２剤内封リポソーム：メタノール＝２０μＬ：３８０μＬで混合し、ＨＰＬＣでパノビノスタットとビンクリスチンを定量した。
２．実験結果
内封率
　パノビノスタット：６０．１７％
　ビンクリスチン：７４．２１％
実施例１５（ＰＥＧ修飾２剤内封リポソームの調製）
１．実験方法
（２剤内封リポソームの作製）
（脂質の溶解）
　ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ），コレステロール（Ｃｈｏｌ）は１００ｍＭとなるように、１，２－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンメチル結合ポリエチレングリコール－２０００（ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ）は１０ｍＭとなるようにクロロホルムに溶解した。
（リポソーム組成）
　ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ＝３／２／０．２７（モル比）
（２剤内封リポソームの調製）
　１００ｍＭのＤＳＰＣ３００μＬ、１００ｍＭのＣｈｏｌ２００μＬ、１０ｍＭのｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを２７０μＬナス型フラスコに分取し、ロータリーエバポレーターで減圧下クロロホルムを留去し、１時間以上真空ポンプにて減圧乾固した。２５０ｍＭ硫酸アンモニウム（ｐＨ３．０）を１ｍＬ加えて水和後、液体窒素を用いて凍結融解を３回行った。押出機（Ｌｉｐｅｘ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用し、１００ｎｍ孔径のポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ　Ｔｒａｃｋ－Ｔｅｃｈ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｗｈａｔｍａｎ　Ｌｔｄ．）を用いてエクストルージョンによりリポソームのサイズを約１００ｎｍに調整した。ＰＢＳにて希釈し、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）後、上清を除去し、沈殿したリポソームをＰＢＳ８００μＬで再懸濁した。パノビノスタット１．０４８ｍｇを２０μＬのＤＭＳＯに溶解したものにこのリポソーム再懸濁液を少量ずつボルテックスしながら加え、全量混和した後約２分間ボルテックスし、振盪インキュベート（８０℃，６５０ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）した後氷中で急冷した。その後、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）し、上清の体積を測定し、沈殿したリポソームをＰＢＳ７００μＬで再懸濁した（パノビノスタット　リポソーム）。ビンクリスチン２４４μｇをＰＢＳ１５０μＬで溶解し、パノビノスタット　リポソームを少量ずつボルテックスしながら加え、全量混和した後約２分間ボルテックスし、振盪インキュベート（８０℃，６５０ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）した後氷中で急冷した。その後、超遠心機（ＣＳ１２０ＥＸ，ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて遠心（４５３，０００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）し、上清の体積を測定し、沈殿したリポソームをＰＢＳ８４０μＬで再懸濁した（２剤内封リポソーム）。２剤内封リポソーム：メタノール＝２０μＬ：３８０μＬで混合し、ＨＰＬＣでパノビノスタットとビンクリスチンを定量した。
２．実験結果
内封率
　パノビノスタット：６０．２３％
　ビンクリスチン：６６．４８％
実施例１６（担がんモデルマウスを用いた治療効果の評価）
１．実験方法
（２剤内封リポソームの調製）
　実施例１５により、ＰＥＧ修飾２剤内封リポソームを調製した。
（Ｃｏｌｏｎ２６　ＮＬ－１７細胞皮下担がんマウスの作製）
　Ｃｏｌｏｎ２６　ＮＬ１７細胞をＤ－ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ）中に１×１０6ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬとなるように懸濁し、５週齢雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスの左腹側部に１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅとなるように皮下注射にて移植し、担がんマウスを作製した。
（がん治療実験）
　Ｃｏｌｏｎ２６　ＮＬ－１７細胞皮下担がんマウスに、ＰＢＳ、パノビノスタット内封ＰＥＧ修飾リポソーム（plip）、ビンクリスチン内封ＰＥＧ修飾リポソーム（vlip）、２剤内封ＰＥＧ修飾リポソーム（pvlip）をパノビノスタット濃度として１０ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍＬ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙとなるように、がん移植１１、１４、および１７日後に尾静脈内投与した。また、がん移植１１日後から、腫瘍体積および体重を測定し、治療効果の評価を行った。
　　腫瘍体積は、がんの短径および長径を測定し、以下に示す式に従って算出した。
　　腫瘍体積（ｃｍ3）＝０．４ｘａｘｂ2（ａ；長径（ｃｍ），ｂ；短径（ｃｍ））
　以下に治療実験のタイムスケジュールを記す。
２．実験結果
　二剤内封リポソーム投与群は、ＰＢＳ投与群と比較して腫瘍の増大が有意に抑制されたのに加えて、単剤内封リポソーム投与群と比較しても腫瘍の増大を有意に抑制する傾向が認められた（図３３）。
実施例１７（p388担がんマウス治療実験）
１．実験方法
（サンプルの調製）
　パノビノスタットをマウスの体重に対し１４．１９ｍｇ／ｋｇとなるようにＰＢＳに溶解させ、全量を２００μＬとした（パノビノスタット群１匹に対する１回投与分）。またビンクリスチンをマウスの体重に対し７５０μｇ／ｋｇとなるようにＰＢＳに溶解させ、全量を２００μＬとした（ビンクリスチン群1匹に対する1回投与分）。また、パノビノスタットとビンクリスチンをそれぞれマウスの体重に対し１４．１９ｍｇ／ｋｇと７５０μｇ／ｋｇなるようにＰＢＳに溶解させ、全量を２００μＬとした（併用群１匹に対する１回投与分）コントロールはＰＢＳを２００μＬ投与した。
（治療実験）
　ＣＤ２Ｆ１雄５週齢にＰ３８８を１×１０6ｃｅｌｌｓ／１００μＬ尾静脈注射により移植した。また、この日をＤａｙ０とした。Ｄａｙ０に体重の測定結果からマウスを分配し、群分けを行い、Ｄａｙ１，Ｄａｙ６，Ｄａｙ１１，Ｄａｙ１６に各サンプルを２００μＬ尾静脈注射により投与した。体重を測定し、マウスの生存期間を記録した。
２．実験結果
　体重推移を図３４に、生存率を図３５に示す。サンプル投与に基づく顕著な体重減少は、いずれの群においても確認されなかった。生存率に関しては、パノビノスタット及びビンクリスチン併用群において、最も高い生存率の向上効果が示された。
実施例１８（製剤）
　以下の組成を粉末の内封物として含むカプセル剤を当業者に公知の方法で製剤化する。
パノビノスタット　　　　　１０ｍｇ
ビンクリスチン　　　　　　　１μｇ
Ｄ－マンニトール　　　　１００ｍｇ
セルロース　　　　　    　３５ｍｇ
部分α化デンプン　　　　　　２．５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　３ｍｇ
カプセル　　　　　　　　　　硬カプセル
                           （長径：１５．９ｍｍ、短径：５．８ｍｍ）

Claims (20)

  1. 　（Ａ）パノビノスタット又はその塩と、（Ｂ）チューブリン阻害剤とを組み合わせてなる、癌の予防または治療剤。
  2. 　（Ａ）パノビノスタット又はその塩と、（Ｂ）チューブリン阻害剤とを併用投与するものである請求項１記載の癌の予防または治療剤。
  3. 　（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤とを含有する癌の予防または治療用医薬組成物である請求項１記載の癌の予防または治療剤。
  4. 　前記チューブリン阻害剤が、ビンクリスチン又はその塩である、請求項１～３のいずれか１項記載の癌の予防または治療剤。
  5. 　前記癌が、固形癌である、請求項１～４のいずれか１項記載の癌の予防または治療剤。
  6. 　前記癌が、血液癌である、請求項１～４のいずれか１項記載の癌の予防または治療剤。
  7. 　（Ａ）パノビノスタット又はその塩及び（Ｂ）チューブリン阻害剤がリポソームに内包されているリポソーム製剤である請求項３～６のいずれか１項記載の癌の予防または治療剤。
  8. 　前記リポソームの組成が、リン脂質とコレステロールの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾リン脂質とコレステロールの組み合わせ、およびリン脂質とポリエチレングリコール修飾リン脂質とコレステロールの組み合わせからなる群から選択される、請求項７記載の癌の予防または治療剤。
  9. 　リン脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン、水素化ダイズホスファチジルコリンおよびジパルミトイルホスファチジルコリンからなる群から選択されるものであり、ポリエチレングリコール修飾リン脂質が、ポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ポリエチレングリコール修飾水素化ダイズホスファチジルエタノールアミンおよびポリエチレングリコール修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択されるものである請求項８記載の癌の予防または治療剤。
  10. 　前記リポソームの組成が、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ジパルミトイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾水素化ダイズホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾水素化ダイズホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとの組み合わせからなる群から選択される請求項７記載の癌の予防または治療剤。
  11. 　前記リポソームの組成が、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせであり、前記水素化ダイズホスファチジルコリンと前記コレステロールとのモル比が３：２である、請求項９または１０記載の癌の予防または治療剤。
  12. 　前記リポソームの組成が、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせであり、前記ジステアロイルホスファチジルコリンと前記コレステロールとのモル比が３：２である、請求項９または１０記載の癌の予防または治療剤。
  13. 　経口投与製剤または経静脈投与製剤である、請求項３～６のいずれか１項記載の癌の予防または治療剤。
  14. 　経口投与製剤または経静脈投与製剤である、請求項７～１２のいずれか１項記載の癌の予防または治療剤。
  15. 　リン脂質およびポリエチレングリコール修飾リン脂質からなる群から選択される１種又は２種以上と、コレステロールとを用いてリポソームを調製する工程、および、
    　前記リポソームにパノビノスタットを混合する工程の後に、チューブリン阻害剤を混合する工程、
    を含む、リポソーム製剤の製造方法。
  16. 　前記チューブリン阻害剤が、ビンクリスチン又はその塩である、請求項１５記載の製造方法。
  17. 　前記リポソームを調製する工程において、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、水素化ダイズホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ジパルミトイルホスファチジルコリンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾水素化ダイズホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ポリエチレングリコール修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾水素化ダイズホスファチジルエタノールアミンとコレステロールとの組み合わせ、またはジステアロイルホスファチジルコリンとポリエチレングリコール修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンとの組み合わせを用いる、請求項１５または１６記載の製造方法。
  18. 　癌の予防または治療のための、（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤との組み合わせ。
  19. 　癌の予防または治療剤製造のための、（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤との組み合わせの使用。
  20. 　（Ａ）パノビノスタット又はその塩と（Ｂ）チューブリン阻害剤とを併用して投与することを特徴とする癌の予防または治療方法。
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