CN110652529B - 南湖菱壳多酚提取物在制备用于抗三阴型乳腺癌药物中的用途 - Google Patents
南湖菱壳多酚提取物在制备用于抗三阴型乳腺癌药物中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于天然药物技术领域，具体涉及南湖菱壳多酚提取物中的三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖组合物在制备用于抗三阴型乳腺癌药物中的用途。该南湖菱壳多酚提取物的制备包括以下步骤：（1）南湖菱壳粉碎、过筛；（2）乙醇超声提取，减压浓缩得到粗提取物；（3）粗提取物用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到菱壳多酚提取物。本发明发现南湖菱壳多酚提取物中的三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖组合物对MDA‑MB‑468细胞发挥协同作用，具有显著的抑制效果。本发明为进一步解释菱壳多酚提取物的抗乳腺癌功效提供一定依据，从而为开发和制备针对不同类型乳腺癌的抗乳腺癌药物提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于天然药物技术领域，具体涉及南湖菱壳多酚提取物及其制备方法和用途，更具体地，涉及南湖菱壳多酚提取物中的三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖组合物在制备用于抗三阴型乳腺癌药物中的用途。
背景技术
菱科(Trapaceae)菱属(Trapa)植物，全世界约有70余种，分布于欧、亚、非的温带至热带地区。菱属植物主要含有黄酮、多酚、甾淳、生物碱、多糖、挥发油、氨基酸等物质，具有抗癌、抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性、抗微生物、镇痛、护肝、免疫调节、抗动脉粥样硬化、降血糖等作用。
南湖菱(Trapa acornis Nakano.)又名无角菱、元宝菱、圆菱、团角菱、和尚菱，是我国特产的水生经济作物，因主产浙江嘉兴南湖而得名，并以其果实无角、壳薄、味美、营养丰富而闻名，已成为杭嘉湖平原水乡特有且具有较高种植效益的经济作物。菱食用时通常只选用菱肉部分，菱壳常被当作废料而丢弃，但大量研究表明，菱壳富含多酚、黄酮、生物碱等活性成分，具有广泛的生物活性。朱红薇等采用薄层层析和紫外光谱对南湖菱的各种提取物进行分析，发现南湖菱含有没食子酸和咖啡酸等主要次生代谢物，主要存在于菱壳中。陈百泉等对南湖菱壳不同提取部位采用色谱法分离，发现南湖菱壳总提取物、石油醚部位、醋酸乙酯部位等均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。宁颖研究发现南湖菱壳提取液取能够较高的抑制胃癌细胞增殖活性。
根据已有研究，南湖菱壳提取物对胃癌细胞具有显著的体外抑制作用，发挥抗胃癌作用的活性成分主要为多酚类物质、黄酮类物质和皂苷类物质，其中，多酚类和黄酮类的效果更为显著(林秋生，菱壳生物活性成分分析及抗胃癌机制研究，浙江大学博士学位论文)。然而，当前研究并没有对其中发挥作用的有效成分进行更加深入的研究，关于南湖菱壳多酚提取物在抗乳腺癌方面的作用机制还未见详细报道，尤其对不同类型乳腺癌的作用机制未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖组合物的用途。
本发明以南湖菱壳为原料，研究南湖菱壳多酚提取物对三阴型乳腺癌细胞MDA-MB-468的抑制作用，对南湖菱壳多酚提取物中的功能性成分及其潜在利用价值进行研究。
在一些优选方式中，南湖菱壳多酚提取物中的三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖组合物具有用于制备抗三阴型乳腺癌药物的用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种南湖菱壳多酚提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)剥开南湖菱果实，留下外壳，在通风阴凉的地方晾晒至干，然后用植物粉碎机粉碎后过60目筛，收集粉末即为原料，放置阴凉干燥处备用；
(2)按照料液比1:20(g/ml)加入浓度为60％的乙醇溶液，然后置于60℃的恒温水浴中提取2h，然后取出置于超声功率300KW的超声仪中超声20min，趁热过滤，收集滤液，滤渣再重复提取2次后合并滤液，滤液3000r/min离心10min，收集上清液，减压浓缩得到粗提取物。
(3)粗提取物用水回溶后，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩后的到菱壳多酚提取物。
本发明提供了上述方法制备而得的南湖菱壳多酚提取物，该提取物中总多酚的含量为54.5-60.4％。
作为本发明的用途，该提取物中的总多酚包括没食子酸、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖和五没食子酰葡萄糖。
作为本发明的用途，以提取物的总重量为基准，没食子酸含量为2.6-2.8％，三没食子酰葡萄糖含量为19.3-21.2％，四没食子酰葡萄糖含量为26.5-28.6％，五没食子酰葡萄糖含量为6.5-7.7％。
本发明具有如下优点：
(1)提供了一种三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖组合物在制备抗三阴型乳腺癌药物中的用途，该组合物来自于南湖菱壳多酚提取物，具有来源广阔、组成明晰、安全可靠的特点。
(2)本发明对南湖菱壳的有效成分进行了提取分离，获得了一种可有效抗三阴型乳腺癌的提取物，通过对南湖菱壳多酚提取物中发挥抗三阴型乳腺癌作用的活性成分进行进一步深入分析，明确了南湖菱壳多酚提取物中发挥抗三阴型乳腺癌作用的活性成分，以及各活性成分之间可能的作用方式。本发明发现三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖组合物对MDA-MB-468细胞发挥协同作用，显示出显著的抑制效果，而没食子酸、五没食子酰葡萄糖对MDA-MB-468细胞可能发挥拮抗作用，会降低三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖组合物的协同效果。本发明为进一步解释菱壳多酚提取物的抗乳腺癌功效提供一定依据，从而为开发和制备针对不同类型乳腺癌的抗乳腺癌药物提供技术支撑。在应用南湖菱壳多酚提取物制备抗乳腺癌药物时，应针对不同类型的乳腺癌，分离提取对不同乳腺癌细胞具有特异性抑制作用的活性成分，从而显著提高药物的抗癌活性及效果。
附图说明
图1是南湖菱壳多酚提取物的UPLC-MS分析图谱，其中，(A)为色谱扫描图谱，(B)为质谱扫描图谱。
图2是南湖菱壳多酚类物质的紫外吸收谱图和质谱图，其中，(A)为没食子酸的紫外吸收谱和质谱，(B)为三没食子酰葡萄糖的紫外吸收谱和质谱，(C)为四没食子酰葡萄糖的紫外吸收谱和质谱，(D)为五没食子酰葡萄糖的紫外吸收谱和质谱。
图3是不同浓度南湖菱壳多酚提取物3#对SK-BR-3细胞的细胞周期的影响。
图4是不同浓度南湖菱壳多酚提取物3#对SK-BR-3细胞的细胞凋亡的影响。
图5是不同浓度南湖菱壳多酚提取物1#对MDA-MB-468细胞的细胞周期的影响。
图6是不同浓度南湖菱壳多酚提取物1#对MDA-MB-468细胞的细胞凋亡的影响。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
实施例中选用的南湖菱采自浙江嘉兴。
实施例1南湖菱壳多酚提取物的制备及总多酚含量测定
1、南湖菱壳预处理：剥开南湖菱果实，留下外壳，在通风阴凉的地方晾晒至干，然后用植物粉碎机粉碎后过60目筛，收集粉末即为原料，放置阴凉干燥处备用。
2、提取物制备：按照料液比1:20(g/ml)加入浓度为60％的乙醇溶液，然后置于60℃的恒温水浴中提取2h，然后取出置于超声功率300KW的超声仪中超声20min，趁热过滤，收集滤液，滤渣再重复提取2次后合并滤液，滤液3000r/min离心10min，收集上清液，减压浓缩得到粗提取物。粗提取物用水回溶后，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩后的到菱壳多酚提取物。
3、提取物总多酚含量的测定
采用Folin-Ciocalteu法进行提取物中总多酚的含量测定。
(1)标准曲线的制备
精密称取8.5mg没食子酸标准品，用蒸馏水溶解并定容至50mL，摇匀。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6mL于25mL容量瓶内，用蒸馏水定容，配制成不同浓度的标准溶液。精密吸取不同浓度的标准溶液各1mL加入25mL容量瓶中，先加入10mL蒸馏水摇匀，再加入1.5mL福林试剂，充分混匀下，5min内加入10％Na2CO36mL，摇匀，加蒸馏水定容至刻度，摇匀。静置3h后于765nm处测定吸光度(A)，以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
(2)样品测定
称取待测提取物约10mg，定容于25mL容量瓶中，分别取0.5、1.0、2.0ml于25ml容量瓶中，先加入10mL蒸馏水摇匀，再加入1.5mL福林试剂，充分混匀下，5min内加入10％Na2CO36mL，摇匀，加蒸馏水定容至刻度，摇匀。静置3h后于765nm处测定吸光度(A)。待测样品平行测定三次。根据没食子酸标准曲线的线性回归方程，计算总多酚含量，总多酚含量(％)＝[(A-0.0387)/90.328*25/0.5*50/10.4]*100％，A为吸光度。
实施例2南湖菱壳多酚提取物的多酚类物质成分分析
利用UPLC-MS对南湖菱壳提取物中的多酚物质的主要成分进行分析。
其中，色谱条件如下：
液相为waters Acquity UPLC QSM；流动相为乙腈(A)和0.01％甲酸水溶液(B)；梯度洗脱程序为：0min，95％A+5％B；0.5min，95％A+5％B；10min，70％A+30％B；18min，1％A+99％B；22min，1％A+99％B；25min，95％A+5％B；流速为0.4ml/min；紫外检测器为watersAcquity PDA UPLC eLambda 800nm，扫描范围为190-600nm。
质谱条件如下：离子源-ESI负离子，离子检测器为waters ADC。
图谱分析结果如图1和图2所示，根据分析结果，可以推断南湖菱壳的多酚化合物中含有没食子酸([M-H]-169.0134，紫外吸收峰λmax 217.2nm和270.2nm)、三没食子酰葡萄糖([M-H]-635.0908；紫外吸收峰λmax为224.2nm和270.2nm)、四没食子酰葡萄糖([M-H]-787.1103；紫外吸收峰λmax为221.2nm和269.2nm)和五没食子酰葡萄糖([M-H]-939.1137；紫外吸收峰λmax为224.2nm和278.2nm)。
实施例3南湖菱壳多酚提取物多酚类物质含量测定
1、HPLC参数设置
实验所用仪器为Agilent 1200高效液相色谱仪；柱子为Eclipse XDB-C18(5μm，4.6*150mm)；洗脱剂为甲醇(A)和0.5％醋酸水溶液(B)；梯度洗脱条件：0min，12％A；5min，20％A；15min，20％A；25min，70％A；扫描波长为280nm；进样量为5μl；流速为1ml/min；柱温为30℃。
2、菱壳提取物处理
称取南湖菱壳提取物样品0.8mg，溶于1ml甲醇中，超声处理(50℃，P＝100w)1h后，用微孔滤膜过滤(0.45μm)备用，处理设置三次平行。
3、外标法标准曲线的制备
分别称取没食子酸、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖和五没食子酰葡萄糖标准品8mg，置于25ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，振荡摇匀，得标准品贮备液。分别移取一定量的标准品储备液于另一10ml容量瓶中，用甲醇定容，振荡摇匀后，得质量浓度为0.78125，3.125，12.5，50，100，150，200μg/ml的没食子酸标准溶液和质量浓度为12.5，25，50，100，200，400μg/ml的五没食子酰葡萄糖标准溶液，过0.45μm微孔滤膜除去杂质微粒后注入1.5ml的进样瓶中依次编号，进行HPLC分析，平行测定三次。以峰面积为纵坐标，进样的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，分别得回归方程。
4、多酚提取物中活性成分的测定
取提物按照步骤3的方法进样分析，得到提取物中没食子酸、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖和五没食子酰葡萄糖的峰面积，根据步骤3所得的标准曲线，分别计算得到菱壳提取物中没食子酸、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖和五没食子酰葡萄糖的含量。
实施例4一种南湖菱壳多酚提取物1#对乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-468的抑制
作用
按照料液比1:20(g/ml)向经过预处理的南湖菱壳中加入浓度为60％的乙醇溶液，置于60℃的恒温水浴中提取2h，然后取出置于超声功率300KW的超声仪中超声20min，趁热过滤，收集滤液，滤渣再重复提取2次后合并滤液，滤液3000r/min离心10min，收集上清液，减压浓缩得到粗提取物。粗提取物用水回溶后，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩后的到菱壳多酚提取物。测得本实施例所得提取物1#的多酚含量为54.5-60.4％，没食子酸含量为2.6-2.8％，三没食子酰葡萄糖含量为19.3-21.2％，四没食子酰葡萄糖含量为26.5-28.6％，五没食子酰葡萄糖含量为6.5-7.7％。
分别以提取物1#的浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml处理乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-468，检测处理24h、48h和72h对两种乳腺癌细胞的抑制作用，同时以顺铂作为阳性对照。
实施例5一种南湖菱壳多酚提取物2#对乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-468的抑制
作用
按照料液比1:20(g/ml)向经过预处理的南湖菱壳中加入浓度为60％的乙醇溶液，置于60℃的恒温水浴中提取2h，然后取出置于超声功率300KW的超声仪中超声20min，趁热过滤，收集滤液，滤渣再重复提取2次后合并滤液，滤液3000r/min离心10min，收集上清液，减压浓缩得到粗提取物。粗提取物用水回溶后，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩后的到菱壳多酚提取物。将此提取物用水回溶，上样于AB-8大孔吸附树脂柱，用2柱体积水溶液洗脱，收集流分，减压浓缩得到菱壳提取物。测得本实施例所得提取物2#的多酚含量为30.5-32.3％，没食子酸含量为10.5-11.6％，三没食子酰葡萄糖含量为4.5-5.8％，四没食子酰葡萄糖含量为3.9-5.0％，五没食子酰葡萄糖含量为6.3-8.5％。
分别以提取物2#的浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml处理乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-468，检测处理24h、48h和72h对两种乳腺癌细胞的抑制作用，同时以顺铂作为阳性对照。
实施例6一种南湖菱壳多酚提取物3#对乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-468的抑制
作用
按照料液比1:20(g/ml)向经过预处理的南湖菱壳中加入浓度为60％的乙醇溶液，置于60℃的恒温水浴中提取2h，然后取出置于超声功率300KW的超声仪中超声20min，趁热过滤，收集滤液，滤渣再重复提取2次后合并滤液，滤液3000r/min离心10min，收集上清液，减压浓缩得到粗提取物。粗提取物用水回溶后，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩后的到菱壳提取物。将此提取物用水回溶，上样于DM130大孔吸附树脂柱，用2柱体积30％乙醇溶液洗脱，收集流分，减压浓缩得到菱壳多酚提取物。测得本实施例所得提取物3#的多酚含量为81.5-84.9％，没食子酸含量为24.8-26.4％，三没食子酰葡萄糖含量为12.5-14.0％，四没食子酰葡萄糖含量为7.6-8.3％，五没食子酰葡萄糖含量为25.2-28.7％。
分别以提取物3#的浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml处理乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-468，检测处理24h、48h和72h对两种乳腺癌细胞的抑制作用，同时以顺铂作为阳性对照。
提取物1#～3#对乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-468抑制作用的测定过程及结果如下：
1、试剂和材料
HER-2过表达型乳腺癌细胞SK-BR-3和三阴性乳腺癌MDA-MB-468由浙江大学医学院惠赠，将其接种至含10％胎牛血清的新鲜DMEM不完全高糖培养液中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
CCK-8检测试剂盒和96孔板均为商业购买。
2、实验处理
(1)将乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-468悬液接种于96孔培养板中(1万个细胞/孔)，37℃、5％CO2培养箱培养，分别将上述提取物1#～3#加入细胞培养板，分别处理24h、48h、72h；
(2)处理细胞后，培养板上每孔各加入10μl CCK-8试剂，处理过的细胞与试剂混合均匀后，再放入5％CO2，37℃二氧化碳培养箱中孵育1h，接着用Thermo，MuLTiSKAN MK3酶标仪测定细胞悬液在450nm处的OD值；
(3)记录下酶标仪读取的待测样品和空白对照组在450nm处的OD值，并将各待测样品的OD值记为测量值，空白对照组的OD值记为空白值，终值＝测量值﹣空白值，每组实验设置三次平行；
(4)抑制率计算：抑制率＝100％﹣样品组(OD值)÷阴性对照组(OD值)×100％；
(5)分别测定实施例4～实施例6所述的南湖菱壳多酚提取物1#～3#对两种乳腺癌细胞的抑制作用，结果见下表所示：
表1不同浓度的样品处理SK-BR-3和MDA-MB-468细胞
从上述结果可以看出，对于SK-BR-3而言，提取物3#对其具有较强的抑制效果，可能是因为提取物3#的总多酚含量较高，而提取物2#的抑制效果高于提取物1#，虽然提取物2#的总多酚含量低于提取物1#，这可能是由于总多酚中的各活性成分含量不同导致发挥不同的抑制效果。对于MDA-MB-468而言，提取物1#的抑制效果远高于提取物2#和提取物3#。三种提取物的总多酚含量及四种多酚类活性成分的含量均有所不同，发明人发现对两种乳腺癌细胞的抑制作用并不是随着总多酚含量的增大而增大，即抑制效果并没有与总多酚含量呈正相关，而是与四种多酚物质的含量高低有关。
根据上述结果初步推断，虽然总多酚的含量高低对抑制乳腺癌细胞具有影响，但提取物中各活性成分的不同含量及配比可能在抑制不同癌细胞方面发挥更显著的影响。提取物中各活性成分的含量可能会影响提取物中各活性成分之间的作用效果，从而对提取物的抑制活性产生影响。接下来，发明人对活性成分之间具体通过何种方式发挥作用进行了进一步的研究。
实施例7四种多酚标准品对乳腺癌细胞抑制作用的比对试验
根据上述实施例，本发明分离出南湖菱壳多酚提取物中主要含有没食子酸、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖和五没食子酰葡萄糖这四种多酚物质。为了研究各活性成分在抑制不同分型乳腺癌细胞方面所发挥的作用，分别对比了这四种多酚的标准品，以及不同标准品配伍时对不同乳腺癌细胞的抑制效果，检测处理48h的抑制率。
表2四种多酚标准品对乳腺癌细胞抑制作用的比对试验
从实验数据可以看出，单独的没食子酸、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖标准品分别对乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-468具有一定的抑制作用。
对于SK-BR-3细胞而言，没食子酸和五没食子酰葡萄糖的抑制作用强于三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖；当没食子酸、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖和五没食子酰葡萄糖两两配合使用时，发现没食子酸与五没食子酰葡萄糖的配合使用显示出较强的抑制效果，抑制率远远高于其他组合，可以推断，没食子酸和五没食子酰葡萄糖组合物对SK-BR-3细胞抑制发生了协同作用，而其他组合物并没有显示出协同作用；分别采用三没食子酰葡萄糖+没食子酸+五没食子酰葡萄糖的组合物、四没食子酰葡萄糖+没食子酸+五没食子酰葡萄糖的组合物进行试验，发现三者组合使用的抑制率反而明显低于没食子酸和五没食子酰葡萄糖两者组合使用的抑制率，我们猜测可能是三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖与没食子酸和五没食子酰葡萄糖组合物之间具有拮抗作用，导致三者组合使用的抑制效果明显降低。
对于MDA-MB-468细胞而言，三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖的抑制作用强于没食子酸和五没食子酰葡萄糖；当没食子酸、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖和五没食子酰葡萄糖两两配合使用时，发现三没食子酰葡萄糖与四没食子酰葡萄糖的配合使用显示出较强的抑制效果，抑制率远远高于其他组合，可以推断，三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖组合物对MDA-MB-468细胞抑制发生了协同作用，而其他组合物并没有显示出协同作用；分别采用没食子酸+三没食子酰葡萄糖+四没食子酰葡萄糖的组合物、三没食子酰葡萄糖+四没食子酰葡萄糖+五没食子酰葡萄糖的组合物进行试验，发现三者组合使用的抑制率反而明显低于三没食子酰葡萄糖和五没食子酰葡萄糖两者组合使用的抑制率，我们猜测可能是没食子酸、五没食子酰葡萄糖与三没食子酰葡萄糖和五没食子酰葡萄糖组合物之间具有拮抗作用，导致三者组合使用的抑制效果明显降低。
而四种多酚物质同比例混合使用时，对SK-BR-3细胞和MDA-MB-468细胞的抑制率分别为75.7％和74.3％。可以看出，没食子酸和五没食子酰葡萄糖两者组合使用时其对SK-BR-3细胞的抑制率可以达到97.2％，三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖两者组合使用时其对MDA-MB-468细胞的抑制率可以达到95.6％，而四种多酚物质同比例混合使用时效果明显不如上述两种组合组。说明南湖菱壳多酚提取物中，不同的活性成分对不同类型的乳腺癌细胞株具有特异的抑制效果。针对不同的乳腺癌细胞，这四种活性成分之间可能通过发生协同或拮抗作用从而产生不同的抑制效果。
实施例8一种南湖菱壳多酚提取物3#对SK-BR-3的细胞周期和细胞凋亡的影响
采用实施例6所述的南湖菱壳多酚提取物3#处理乳腺癌细胞SK-BR-3，研究该提取物对细胞周期和细胞凋亡的影响。
1、细胞处理：
(1)将培养好的SK-BR-3细胞胰酶消化后，配制成细胞悬液。取出10ul细胞悬液进行细胞计数，后用完全培养基稀释成100000个/ml浓度大小。
(2)按照每孔2ml的体积加入6孔培养板中，待细胞生长达到40％融合度时弃去细胞培养液，除正常对照组细胞外，换成含不同浓度南湖菱壳提取物的完全培养液(提取物浓度分别为100μg/ml、400μg/ml、800μg/ml)，培养48h后收集细胞，得到处理后的细胞培养液。
表3不同浓度的样品处理SK-BR-3细胞
| 组别 | 提取物浓度 | 处理时间 |
| 处理组1 | 100μg/ml | 48h |
| 处理组2 | 400μg/ml | 48h |
| 处理组3 | 800μg/ml | 48h |
| 对照组 | 0 | 48h |
2、实验处理
(1)Annexin V-FITC细胞凋亡测定：
a、把细胞培养液吸出至离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。
b、稍混匀，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。
c、取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。
d、加入5μl Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀。
e、加入10μl碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀。
f、室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善标记效果。
g、随即进行流式细胞仪检测。
(2)细胞周期与细胞凋亡测定
a、收集细胞培养液到一离心管内，用胰酶消化细胞。1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底适当分散细胞，避免细胞成团。
b、细胞固定：加入1毫升冰浴预冷70％乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时。1000g离心3-5分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的70％乙醇，以避免吸走细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
c、染色：每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。随后可以4℃或冰浴避光存放。染色完成后在24小时内完成流式检测。
d、流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
3、实验结果
(1)提取物3#对SK-BR-3细胞周期分布的影响
碘化丙锭与DNA结合后发出红色荧光，通过流式细胞仪检测PI荧光强度可直接反映细胞内的DNA含量，进而通过DNA含量反映细胞周期。G0/G1期是合成前期，DNA含量为2N；G2/M期为合成后期和有丝分裂期，DNA含量为4N；S期的DNA含量介于二者之间。因此，通过流式检测DNA含量即可区分细胞周期。
从图3可以看出，不同浓度的南湖菱壳多酚提取物3#可以扰乱乳腺癌细胞SK-BR-3的细胞周期进程，将大部分细胞阻抑在S期，阻止细胞进一步分裂，诱导细胞凋亡。
(2)提取物对SK-BR-3凋亡的影响
利用FITC标记的Annexin V和PI作为双荧光探针，可以在流式细胞仪的直方图上将正常细胞、凋亡细胞与死细胞进行区分。从图4可以看出，乳腺癌细胞SK-BR-3在所有处理组都有大量的细胞凋亡，随着南湖菱壳提取物浓度的升高，凋亡细胞增多，当提取物浓度达到400ug/ml时，细胞凋亡的最为显著(注：B1区代表死亡细胞，B2+B4区代表凋亡细胞，B3区代表正常细胞)，这可能是提取物中的活性成分可诱导PARP断裂，从而促进凋亡的发生。
提取物3#的多酚含量为81.5-84.9％，没食子酸含量为24.8-26.4％，三没食子酰葡萄糖含量为12.5-14.0％，四没食子酰葡萄糖含量为7.6-8.3％，五没食子酰葡萄糖含量为25.2-28.7％，该提取物中没食子酸和五没食子酰葡萄糖的含量明显高于三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖的总量，因此对SK-BR-3细胞产生了较强的抑制作用，其IC50为81.0μg/ml(以处理48h计)。而该提取物对MDA-MB-468细胞的抑制效果不够显著，其IC50为242.5μg/ml。
实施例9一种南湖菱壳多酚提取物1#对MDA-MB-468的细胞周期和细胞凋亡的影响
采用实施例4所述的南湖菱壳多酚提取物1#处理乳腺癌细胞MDA-MB-468，研究该提取物对细胞周期和细胞凋亡的影响。细胞处理及实验处理过程同实施例8所述。实验结果如下：
(1)提取物1#对MDA-MB-468细胞周期分布的影响
从图5可以看出，不同浓度的南湖菱壳多酚提取物1#可以扰乱乳腺癌细胞MDA-MB-468的细胞周期进程，将大部分细胞阻抑在S期，阻止细胞进一步分裂，诱导细胞凋亡。
(2)提取物1#对MDA-MB-468细胞凋亡的影响
利用FITC标记的Annexin V和PI作为双荧光探针，可以在流式细胞仪的直方图上将正常细胞、凋亡细胞与死细胞进行区分。从图6可以看出，乳腺癌细胞MDA-MB-468在所有处理组都有大量的细胞凋亡，随着南湖菱壳提取物浓度的升高，凋亡细胞增多，当提取物浓度达到400ug/ml时，细胞凋亡的最为显著(注：B1区代表死亡细胞，B2+B4区代表凋亡细胞，B3区代表正常细胞)，这可能是提取物中的活性成分可诱导PARP断裂，从而促进凋亡的发生。
提取物1#的多酚含量为54.5-60.4％，没食子酸含量为2.6-2.8％，三没食子酰葡萄糖含量为19.3-21.2％，四没食子酰葡萄糖含量为26.5-28.6％，五没食子酰葡萄糖含量为6.5-7.7％，该提取物中三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖的含量显著较高，因此对MDA-MB-468细胞产生了较强的抑制作用，其IC50为105.3μg/ml(以处理48h计)。而该提取物对SK-BR-3细胞的抑制效果较差，其IC50为358.7μg/ml。
综合上述实施例，本发明提供了一种南湖菱壳多酚提取物在制备抗HER-2过表达型乳腺癌药物和制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用，该提取物主要含有没食子酸、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖和五没食子酰葡萄糖四种多酚物质。通过对发挥抗HER-2过表达型乳腺癌作用和抗三阴性乳腺癌作用的活性成分进行进一步分析，发现没食子酸和五没食子酰葡萄糖组合物对SK-BR-3细胞发挥协同作用，显示出显著的抑制效果，而三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖对SK-BR-3细胞可能发挥拮抗作用，会降低没食子酸和五没食子酰葡萄糖组合物的协同效果；同时发现三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖组合物对MDA-MB-468细胞发挥协同作用，显示出显著的抑制效果，而没食子酸、五没食子酰葡萄糖对MDA-MB-468细胞可能发挥拮抗作用，会降低三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖组合物的协同效果。本发明为进一步解释菱壳的抗乳腺癌功效提供一定的依据，从而为开发和制备针对不同类型乳腺癌的抗乳腺癌药物提供技术支撑。在应用南湖菱壳多酚提取物制备抗乳腺癌药物时，应针对不同类型的乳腺癌，分离提取对不同乳腺癌细胞具有特异性抑制作用的活性成分，从而显著提高药物的抗癌活性及效果。如何高效分离提取南湖菱壳多酚提取物中的活性单体是我们接下来需要进一步研究的方向。
Claims (4)
1.三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖组合物在制备用于抗三阴型乳腺癌药物中的用途，所述三没食子酰葡萄糖和四没食子酰葡萄糖组合物来自于南湖菱壳多酚提取物，该南湖菱壳多酚提取物的制备方法包括以下步骤：
（1）剥开南湖菱果实，留下外壳，在通风阴凉的地方晾晒至干，然后用植物粉碎机粉碎后过60目筛，收集粉末即为原料，放置阴凉干燥处备用；
（2）按照料液比1:20 g/ml加入浓度为60%的乙醇溶液，然后置于60℃的恒温水浴中提取2h，然后取出置于超声功率300KW的超声仪中超声20min，趁热过滤，收集滤液，滤渣再重复提取2次后合并滤液，滤液3000r/min离心10min，收集上清液，减压浓缩得到粗提取物；
（3）粗提取物用水回溶后，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩后得到菱壳多酚提取物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征是，南湖菱壳多酚提取物中总多酚的含量为54.5-60.4%。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征是，南湖菱壳多酚提取物中的总多酚包括没食子酸、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖和五没食子酰葡萄糖。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征是，以提取物的总重量为基准，所述没食子酸含量为2.6-2.8%，所述三没食子酰葡萄糖含量为19.3-21.2%，所述四没食子酰葡萄糖含量为26.5-28.6%，所述五没食子酰葡萄糖含量为6.5-7.7%。
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