CN111748619A - 抑制肿瘤细胞GSK-3β双靶点的抑制剂或抑制剂体系及其筛选方法 - Google Patents
抑制肿瘤细胞GSK-3β双靶点的抑制剂或抑制剂体系及其筛选方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及靶向抑制肿瘤细胞内GSK‑3β双靶点活性而产生抑癌效果的抑制剂或抑制剂体系及其筛选方法。本发明公开了一种抑制(阻断/失活)肿瘤细胞内GSK‑3β的GSK‑3βY216和GSK‑3βSer9双靶点活性；或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制该双靶点活性，从而产生抑癌效果的抑制剂或抑制剂体系及其筛选方法。该抑制(阻断/失活)双靶点的抑癌效果，显著优于抑制(阻断/失活)其中任一单一靶点的抑癌效果。本发明为筛选或研发临床靶向治疗肿瘤(优选肝癌及消化系统肿瘤)的新靶向药提供新方法、新思路、新策略；为临床治疗肿瘤提供新双靶点组合和新药物。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤学、分子生物学、生物化学、细胞生物学及药学交叉领域，更具体地，本发明涉及一种抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的Y216(GSK-3βY216)和Ser9(GSK-3βSer9)双靶位点活性；或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制该双靶点活性；从而产生抑癌效果的抑制剂或抑制剂体系及其筛选方法。而抑制(阻断/失活)Y216、Ser9双靶点产生的抑癌效果，显著优于抑制(阻断/失活)Y216、Ser9其中任一单一靶点的抑癌效果。本发明为筛选或研发临床靶向治疗肿瘤(优选肝癌及消化系统肿瘤)的新靶向药提供新方法、新思路、新策略；为临床治疗肿瘤提供新双靶点组合和新药物。
背景技术
环境污染和生命延长等原因使国内外肿瘤的发病率和致死率逐年增加。据世卫组织报告，2012年全球约有1.41千万新发癌症病例，820万患者死于癌症，其中中国约占新发病例的25％，死亡病例的34％。
在中国，肝癌是五大致死性恶性肿瘤之一，男性仅次于肺癌，女性仅次于肺癌和胃癌。男性肝癌死亡率较高为37.4/100000，女性为14.3/100000肝癌是一种复杂性疾病，与多种危险因素密切相关。如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黄曲霉毒素、饮酒和吸烟等危险因素都有助于肝癌的发生发展。由于肝癌恶性程度高，发展速度快，转移能力强，治疗后易复发。单纯的手术治疗、肝动脉结扎插管治疗、介入治疗、局部治疗、放射治疗等治疗手段均难以取得满意的效果。索拉非尼是唯一被批准治疗肝癌的药物。而最新研究表明，索拉菲尼辅助治疗并不能提高无复发生存率和总生存率。因此，寻找治疗肝癌的新靶点及其靶向抑制剂迫在眉睫。
糖原合成酶激酶3(Glycogen Synthase Kinase 3，GSK-3)是细胞内主要的丝氨酸/苏氨酸家族激酶，其活性异常与多种疾病的发生发展密切相关。GSK-3主要具有两种亚型，即GSK-3α(51kD)和GSK-3β(47Kd)，二者在催化区域具有98％的同源性，因此它们具有相似的功能。目前研究较多的是GSK-3β，它不仅参与细胞内多条信号通路的调节(如Wnt/β-catenin通路、PI3K/AKT/mTOR通路、Hedgehog通路、Notch通路)，而且还参与细胞的分化、增殖、存活和凋亡。
目前研究较多的是GSK-3β，它不仅参与细胞内多条信号通路的调节(如Wnt/β-catenin通路、PI3K/AKT/mTOR通路、Hedgehog通路、Notch通路)，而且还参与细胞的分化、增殖、存活和凋亡。越来越多的证据表明，GSK-3β相关信号通路的异常与2型糖尿病、神经系统疾病(阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病)、精神类疾病(抑郁症、躁狂症)、等密切相关；近年来，也有文献报道GSK-3β与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。因此GSK-3β可作为治疗多种疾病的潜在靶点。
GSK-3β有两个磷酸化位点phospho-GSK3βY216(P-GSK-3βY216)和phospho-GSK3βSer9(P-GSK-3βSer9)。目前认为对其Y216位点磷酸化(P-GSK-3βY216)是激活GSK-3β，或者说GSK-3β的活性形式是GSK-3βY216被磷酸化(phospho-GSK3βY216)；而其Ser9位点磷酸化(P-GSK-3βSer9)则被认为是让GSK-3β失活。
有文献报道，GSK-3β及其活性形式p-GSK3βY216的水平在肝癌、肠癌和胰腺癌等组织中高于癌旁组织。相反，GSK-3β其非活性形式p-GSK3βSer9只在癌旁组织高表达；但在肝癌中也有报道GSK3β及其非活性形式p-GSK3βSer9在肝癌组织中高表达，并与手术后病人的转归呈负相关关系。因此，GSK-3β及其活性形式phosphor-GSK3βY216和非活性形式phosphor-GSK3βSer9在肝癌中的表达情况，以及对肿瘤发生发展的调控机制及其相互间的关系一直不太清楚。目前大多研究认为：GSK-3β其活性形式p-GSK3βY216高表达有促进肿瘤发生发展的作用，抑制肿瘤细胞内GSK-3β及其活性形式p-GSK3βY216的表达，即抑制p-GSK3βY216的活性，可以起到抑制肿瘤的效果。但同时抑制肿瘤细胞内GSK-3β的两个位点Y216和Ser9的活性，或抑制该两个位点的磷酸化活性，对肝癌及其他肿瘤的发生发展有何影响，则未见任何文献报道。
发明内容
本发明公开了一种同时抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的Y216(GSK-3βY216)和Ser9(GSK-3βSer9)双靶位点活性；或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制该双靶点活性；从而产生抑癌效果的抑制剂或抑制剂体系及其筛选方法。而抑制(阻断/失活)Y216、Ser9双靶点产生的抑癌效果，显著优于抑制(阻断/失活)Y216、Ser9其中任一单一靶点的抑癌效果。该双靶点抑制剂或抑制剂体系包括：靶向抑制(阻断/失活)该双靶点的化学小分子抑制剂或小分子抑制组合物(已有的或者正在开发的，以及市场上可购到的GSK-3β抑制剂)；靶向抑制(阻断/失活)该双靶点的生物学靶向抑制剂或抑制剂体系，如突变基因导入抑制，基因编辑抑制，蛋白抑制等；靶向抑制(阻断/失活)该双靶点的化学-生物混合靶向组合物抑制体系。
本发明为筛选或研发临床靶向治疗肿瘤(优选肝癌及消化系统肿瘤)的新靶向药提供新方法、新思路、新策略；为临床治疗肿瘤提供新双靶点组合和新药物。
在本发明的第一方面，提供用于靶向抑制肿瘤发生发展的抑制剂或抑制剂体系，其靶向抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的Y216位点(GSK-3βY216)和Ser9位点(GSK-3βSer9)双靶点的活性；或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制该双靶点活性，从而抑制肿瘤的发生发展，其包括：
(a)靶向于肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的Y216位点(GSK-3βY216)和Ser9位点(GSK-3βSer9)并发挥抑制(阻断/失活)其活性作用，或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制(阻断/失活)其活性的抑制剂或抑制剂体系；或
(b)由两种或两种以上组分混合的组合物或组合物体系，所述组分分别或同时靶向于肿瘤细胞糖原合成酶激酶3(GSK-3β)的Y216位点(GSK-3βY216)和Ser9位点(GSK-3βSer9)，并抑制(阻断/失活)其活性；或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制(阻断/失活)其活性的抑制剂或抑制剂体系。
在一个优选例中，所述的抑制剂或抑制剂体系，其抑制物质或组分包括选自下组的物质或组分：化学小分子或小分子组合物，或基于生物学方法(如基因导入，基因编辑，蛋白抑制等)的抑制剂、阻断剂、失活剂、突变剂、干扰剂；较佳地，所述的抑制物质或组分靶向抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的y216位点(GSK-3βY216)和Ser9位点(GSK-3βSer9)；或通过突变所述双靶位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制(阻断/失活)其活性；或抑制(阻断/失活/突变)所述双靶位点的磷酸化活性；
在另一优选例中，所述抑制剂或抑制剂体系，其物质或组分包括：化学小分子或小分子组合物；其中，靶向于肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的Y216位点(GSK-3βY216)并发挥抑制(阻断/失活)其活性作用的化学小分子包括：CHIR-99021，BIO、IM-12、TWS119、CHIR-98014、1-Azakenpaullone、AR-A014418、SB216763、LY2090314等。
在另一优选例中，靶向于肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)Ser9位点(GSK-3βSer9)并发挥抑制(阻断/失活)其活性作用的小分子包括：BIO、LY2090314、IM-12、TWS119、CHIR-98014、1-Azakenpaullone、AR-A014418、SB216763等。
在另一优选例中，同时靶向于肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的Y216位点(GSK-3βY216)和Ser9位点(GSK-3βSer9)并发挥抑制(阻断/失活)其活性作用的小分子或小分子组合物包括：小分子：BIO、LY2090314，小分子组合物：CHIR-99021和BIO；CHIR-99021和LY2090314。
在另一优选例中，所述抑制剂或抑制剂体系，其物质或组分包括：通过靶向突变Y216位点(GSK-3βY216)和Ser9位点(GSK-3βSer9)的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制(阻断/失活)该双靶位点活性的化学或生物学抑制剂、阻断剂、失活剂、突变剂、干扰剂；其中，靶向抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的Ser9(GSK-3βSer9)酶蛋白位点，或通过突变所述位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制(阻断/失活)其活性的抑制剂或抑制剂体系，其物质包括：抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的Ser9酶蛋白位点；或突变抑制其相应的基因编码位点的化学物质或生物物质；生物物质如编码核酸而设计构建的突变基因及其导入突变基因的载体工具，如：过表达GSK-3βSer9突变质粒包装的慢病毒表达载体、过表达GSK-3βSer9突变质粒包装的腺相关病毒表达载体；结合分子(如抗体或配体)、阻滞分子(如基于氨基酸修饰的阻滞剂)、各种RNA干扰分子、基因编辑试剂、核酸抑制物、氨基酸定向突变试剂(如定向突变第9位氨基酸编码的试剂)等靶向抑制剂或靶向抑制剂体系；或
靶向抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的Y216位点(GSK-3βY216)酶蛋白位点，或通过突变所述位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制(阻断/失活)其活性的物质包括：抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的Y216酶蛋白位点，或通过突变所述位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制(阻断/失活)其活性的化学物质或生物物质；生物物质如编码核酸而设计构建的突变基因及其导入突变基因的载体工具，如：过表达GSK-3βY216突变质粒包装的慢病毒表达载体、过表达GSK-3βY216突变质粒包装的腺相关病毒表达载体；结合分子(如抗体或配体)、阻滞分子(如基于氨基酸修饰的阻滞剂)、各种RNA干扰分子、基因编辑试剂、核酸抑制物、氨基酸定向突变试剂(如定向突变第216位氨基酸编码的试剂)等靶向抑制剂或靶向抑制剂体系；或
同时靶向抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9酶蛋白双靶位点活性，或通过突变所述双靶位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制(阻断/失活)其活性的物质包括：抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的Y216和Ser9双靶点酶蛋白位点，或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制(阻断/失活)其活性的化学物质或生物物质；生物物质如编码核酸而设计构建的突变基因及其导入突变基因的载体，如：过表达GSK-3βY216和Ser9双突变质粒包装的慢病毒表达载体、过表达GSK-3βY216和Ser9双突变质粒包装的腺相关病毒表达载体；结合分子(如抗体或配体)、阻滞分子(如基于氨基酸修饰的阻滞剂)、各种RNA干扰分子、基因编辑试剂、核酸抑制物、氨基酸定向突变试剂(如定向突变第9位和第216位氨基酸编码的试剂)等靶向抑制剂或靶向抑制剂体系。
在另一优选例中，所述的抑制剂或抑制剂体系是包括化学靶向抑制剂与生物学靶向抑制剂的混合靶向抑制剂组合或体系，能够分别或同时靶向抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶位点活性，或通过突变所述双靶位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制(阻断/失活)其双靶点活性；或发挥抑制(阻断/失活)其磷酸化活性作用的化学-生物学混合靶向抑制剂体系，如CHIR-99021和GSK-3βSer9点突变慢病毒表达载体；BIO和GSK-3βY216点突变的慢病毒表达载体；所构成的化学-生物混合抑制体系。
在本发明的另一方面，提供所述抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶位点活性的靶向抑制剂或抑制剂体系的用途，用于制备抑制肿瘤发生发展的药物或药物组合物。
在本发明的另一方面，提供一种药物或药物组合物，其包含任一所述的抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶位点活性的靶向抑制剂或靶向抑制剂体系，其还包含药学上可接受的载体或赋形剂；较佳地，其载体或赋形剂包括：水、盐水、磷酸缓冲液或其它水性溶剂；DMSO、甘油和乙醇或其它有机溶剂；微球、脂质体、微乳液或高分子表面活性剂；胶体型载药系统或高分子载药系统；或防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、pH缓冲物质，黏合剂、填充剂、润滑剂或其它药物赋形剂。
在本发明的另一方面，提供，药物剂型包括：固体剂型，包括粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂，或其他固体剂型；液体剂型，包括注射剂、输液剂、混悬剂，或其它液体剂型；气体剂型；或半固体剂型。
在本发明的另一方面，提供一种筛选抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶位点活性的靶向抑制剂或靶向抑制剂体系的方法，包括：
步骤(1)：测试组或处理组：将候选物质处理含有(如表达有)糖原合成酶激酶3的肿瘤细胞或肿瘤细胞系；
步骤(2)：检测处理组肿瘤细胞的糖原合成酶激酶3的第9位和第216位点活性或磷酸化活性、体内外致瘤性、生长增殖特性、迁移性以及相关肿瘤细胞特异性指标，并与对照组比较。其中所述的对照组是使用与处理组相同的肿瘤细胞或肿瘤细胞系，不进行所述候选物质处理(空白对照)；和/或只抑制(阻断/失活)肿瘤细胞的糖原合成酶激酶3的第9位和第216中任一位点(抑制单靶点对照)；
与对照组相比较，如果测试组中糖原合成酶激酶3的第9位和第216位点的活性或磷酸化活性在统计学上低于(显著低30％以上；较佳的显著低50％以上；更佳的显著低75％以上)对照组；
且，体内外致瘤性、生长增殖特性、迁移性以及相关肿瘤细胞特异性指标与对照组相比较，处理组分别或同时抑制(阻断/失活)肿瘤细胞GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶点的抑癌效果显著优于抑制其中任一单靶点的抑癌效果，就表明该候选物质是抑制肿瘤细胞发生发展的靶向抑制剂或靶向抑制剂体系。
步骤(3)，体内抑癌效果验证。构建荷瘤动物模型；用初步筛选出的抑制(阻断/失活)肿瘤细胞GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶点活性的抑制剂或抑制剂体系处理荷瘤动物模型，验证其在荷瘤动物模型上的抑癌效果明显有效。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的靶向抑制剂或靶向抑制剂体系进行进一步的细胞实验和/或动物试验，进一步完善靶向抑制剂或靶向抑制剂体系的抑癌效果。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括人肿瘤，较佳地，包括消化系统肿瘤，更佳地地为肝脏肿瘤，如肝癌。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、GSK-3β基因序列及其突变位点图；
A、GSK-3β基因序列及其突变位点；其中，方框标记的为S9位点，双下划线标记的为Y216位点；突变位点S9TCC→TTT(丝氨酸变为苯丙氨酸)；Y216TAT→TTT(酪氨酸变为苯丙氨酸)；
B、GSK-3β基因结构及酶切位点图。
图2、GSK-3β过表达，GSK-3βY216点突变(抑制Y216位点活性)；Ser9点突变(抑制Ser9位点活性)；Y216和Ser9双突变(抑制Y216和Ser9双靶位点活性)的HCC细胞的生长增殖结果。96小时结果显示：Y216和Ser9双突变(抑制Y216和Ser9双靶位点活性)的HCC细胞的生长增殖能力，较其中任一单一靶点突变(抑制Y216或Ser9任一单靶点活性)的HCC细胞的生长增殖能力都显著降低。
图3、GSK-3β过表达，GSK-3βY216点突变；GSK-3βSer9点突变；Y216/Ser9双突变对HCC细胞的克隆形成能力的影响。图左为实验结果图，图右为图左的实验结果的统计分析结果。结果显示，Y216和Ser9双突变(抑制Y216和Ser9双靶位点活性)的HCC细胞的形成克隆能力(致瘤性)较其中任一单一靶点突变(抑制Y216或Ser9任一单靶点活性)的HCC细胞的形成克隆能力(致瘤性)都显著降低。
图4、GSK-3β过表达，GSK-3βY216点突变；GSK-3βSer9点突变；Y216/Ser9双突变对HCC细胞的迁移能力的影响。图左为实验结果图，图右为图左的实验结果的统计分析结果。Y216和Ser9双突变(抑制Y216和Ser9双靶位点活性)的HCC细胞的迁移能力较其中任一单一靶点突变(抑制Y216或Ser9任一单靶点活性)的HCC细胞的迁移能力都显著降低。
图5、GSK-3β过表达，GSK-3βY216点突变；GSK-3βSer9点突变；Y216/Ser9双突变HCC细胞注射到裸鼠体内的成瘤情况。图左为实验结果图，图右分别为图左的肿瘤的重量、体积以及不同时间点的肿瘤体积的统计分析结果。实验结果显示：Y216和Ser9双突变(抑制Y216和Ser9双靶位点活性)的HCC细胞在实验动物体内成瘤能力(致瘤性)较其中任一单一靶点突变(抑制Y216或Ser9任一单靶点活性)的HCC细胞在实验动物体内成瘤能力(致瘤性)都显著降低。
图6、靶向抑制肿瘤细胞GSK-3βY216和Ser9位点双靶点活性而产生抑癌效果的小分子抑制剂或抑制剂组合物筛选实验结果。A:磷酸化位点活性结果(western结果)；B:HCC细胞生长增殖曲线；C：HCC细胞单克隆形成实验结果，右侧是统计分析结果；D:HCC细胞迁移实验结果，右侧是统计分析结果。实验结果表明，小分子Ly2090314；小分子组合物：CHIR-99021和BIO；是具有同时抑制GSK-3βY216位点和S9位点活性或其磷酸化活性，而产生抑癌效果的抑制剂或抑制剂组合物。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示了一种同时抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的Y216(GSK-3βY216)和Ser9(GSK-3βSer9)双靶位点活性；或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制该双靶点活性，从而产生抑癌效果的抑制剂或抑制剂体系及其筛选方法。而抑制(阻断/失活)Y216、Ser9双靶点产生的抑癌效果，显著优于抑制(阻断/失活)其中任一单一靶点的抑癌效果。本发明可为筛选或研发临床防治肿瘤(表达GSK-3β的肿瘤，包括消化系统肿瘤，如肝癌)新靶向药物提供新方法、新思路、新策略；为临床治疗肿瘤提供新双靶点组合和新药物。
GSK-3β-Y216和Ser9双突变或单突变细胞系
如本文所用，除非另外说明，所述的GSK-3βY216突变(抑制Y216位点活性)；Ser9突变(抑制Ser9位点活性)；Y216和Ser9双突变(抑制抑制Y216和Ser9双靶位点活性)是指对应于野生型GSK-3β(如SEQ ID NO:2)，包含以下基因编码位置的突变：第9位(Ser9)，第216位(Y216)。
本发明的具体实施方式中，所述的GSK-3β-Y216和Ser9双突变或单突变是GSK-3β第9位(Ser9)和第216位(Y216)位点同时突变为Phe；或其中一个位点突变为Phe的突变体。能够使得GSK-3β-Y216和Ser9位点或其磷酸化位点失去活性的其它氨基酸编码也可以用于突变体构建。
本发明的具体实施例中使用慢病毒的生物学方法构建GSK-3βY216突变(抑制Y216位点活性)；Ser9突变(抑制Ser9位点活性)；Y216和Ser9双突变(抑制Y216和Ser9双靶位点活性)的HCC细胞系。其他基因导入方式或基因突变方式和其他肿瘤细胞系也可以构建GSK-3βY216突变(抑制Y216位点活性)；Ser9突变(抑制Ser9位点活性)；Y216和Ser9双突变(抑制Y216和Ser9双靶位点活性)的肿瘤细胞系。
上述分子生物学技术及细胞生物学技术为本领域专业技术人员熟知。
本发明也提供了所述构建GSK-3βY216突变(抑制Y216位点活性)；Ser9突变(抑制Ser9位点活性)；Y216和Ser9双突变(抑制Y216和Ser9双靶位点活性)的肿瘤细胞系的用途，用于筛选抑制肿瘤细胞内GSK-3β双靶点,从而抑制肿瘤细胞发生发展的靶向抑制剂或靶向抑制剂体系；或用于在筛选抑制肿瘤细胞内GSK-3β双靶点而产生抑癌效果的靶向抑制剂或靶向抑制剂体系时，作为阳性对照。
基于肿瘤细胞GSK-3β双靶点的靶向抑制剂或靶向抑制剂体系的筛选
根据本发明人的新发现，提供一种抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的GSK-3β-Y216和Ser9双靶点活性，或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制该双靶点活性；从而抑制肿瘤细胞发生发展的靶向抑制剂或靶向抑制剂体系的筛选方法，包括：
步骤(1)，测试组或处理组：将候选物质处理肿瘤细胞(包括肝癌细胞或其他肿瘤细胞，作为处理组：
A、筛选抑制(阻断/失活)肿瘤细胞GSK-3βY216和Ser9双靶点活性；或通过突变所述双靶位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制(阻断/失活)其活性的生物学靶向抑制剂或抑制剂体系：使用候选生物物质或生物组合体系，处理肿瘤细胞(包括肝癌细胞或其他肿瘤细胞)，如本实施例使用慢病毒或腺相关病毒等相关基因载体(载有GSK-3βY216和Ser9双突变基因)，使用感染方法处理肿瘤细胞(包括肝癌细胞或其他细胞)，构建GSK-3βY216和Ser9双突变(抑制/阻断/失活)的肿瘤细胞系(包括肝癌细胞或其他肿瘤细胞系)；
B、筛选抑制(阻断/失活)肿瘤细胞GSK-3βY216和Ser9双靶点活性的化学小分子靶向抑制剂或小分子靶向抑制组合物：使用候选化学小分子GSK-3β抑制剂或小分子GSK-3β抑制组合物，处理肿瘤细胞(包括肝癌细胞或其他肿瘤细胞)；
C、筛选抑制(阻断/失活)肿瘤细胞GSK-3βY216和Ser9双靶点活性的化学-生物混合靶向抑制剂体系：使用候选化学小分子靶向GSK-3βY216或Ser9抑制剂和候选生物靶向GSK-3βY216或Ser9抑制剂处理肿瘤细胞(包括肝癌细胞或其他肿瘤细胞)。
并设对照组：
①空白对照：无候选物质处理的，与处理组相同的肿瘤细胞(包括肝癌细胞或其他肿瘤细胞)；
②抑制单一靶点对照：使用慢病毒或腺相关病毒等相关基因载体的基因导入方法构建GSK-3βY216突变(抑制Y216位点活性)；和/或Ser9突变(抑制Ser9位点活性)的肿瘤细胞或肿瘤细胞系(与处理组相同的肿瘤细胞或肿瘤细胞系)；
步骤(2)，检测和观察：(a)检测处理组和对照组的肿瘤细胞糖原合成酶激酶3的第9位和第216位点活性或磷酸化活性；
(b)检测和观察处理组和对照组的肿瘤细胞(包括肝癌细胞或其他肿瘤细胞)的体内外肿瘤生物学行为；包括：
①检测和观察处理组和对照组肿瘤细胞的生长增殖行为差异；
②检测和观察处理组和对照组肿瘤细胞的克隆形成能力差异；
③检测和观察处理组和对照组肿瘤细胞的迁移侵袭能力差异；
④检测和观察处理组和对照组肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤性差异；
步骤(3)，体内抑癌效果验证：
①包括但不限于通过上述方法或其他药学/生化/化学方法，初步筛选出来的上述抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶点活性的靶向抑制剂或靶向抑制剂组合物，或抑制剂体系；
②用肿瘤细胞制作荷瘤实验动物模型。
处理组：使用①初步筛选的双靶点抑制剂或抑制组合物，或抑制剂体系处理该荷瘤实验动物模型；
对照组：对该荷瘤实验动物模型不使用①的抑制剂或抑制剂体系处理；
③观察抑癌效果。与对照组比较，体内验证①靶向抑制剂或抑制组合物，或抑制剂体系的抑癌效果。
以肝细胞癌(HCC)细胞系为例，根据不同的HCC细胞系，单独的GSK-3βY216突变抑制(阻断/失活)，产生有效的抑癌效果；单独的GSK-3βSer9突变抑制(阻断/失活)，产生从微弱到无效的抑癌作用；而同时突变抑制(阻断/失活)GSK-3βY216和Ser9，则产生显著优于单独抑制(阻断/失活)P-GSK-3βY216或P-GSK-3βSer9任一单独靶点的抑癌效果。
因此，如果同时抑制(阻断/失活)GSK-3βY216和Ser9双靶点活性，能够产生优于单独抑制(阻断/失活)其中任一靶点活性的抑癌效果，则表明该候选物质是本方法筛选出来的抑制肿瘤细胞内GSK-3βY216和Ser9双靶点活性；或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制该双靶点活性的靶向抑制剂或靶向抑制剂体系。
同时，还提供一种仅基于第9位氨基酸作为靶点的抑制肿瘤细胞内GSK-3βSer9单靶点的靶向抑制剂筛选方法：将候选物质处理GSK-3βY216突变(抑制/阻断/失活)的HCC系，作为处理组；其他实验步骤与筛选抑制肿瘤细胞内GSK-3β-Y216和Ser9双靶点抑制剂相同；
而筛选抑制肿瘤细胞内GSK-3β-Y216单靶点抑制剂方法，则将候选物质处理GSK-3βSer9突变(抑制/阻断/失活)的HCC系，作为处理组；其他实验步骤与筛选抑制肿瘤细胞内GSK-3β-Y216和Ser9双靶点抑制剂相同；
所述的靶向抑制剂体系包括(但不限于)：化学物质体系、化学物质和生物物质混合体系、生物物质体系如突变基因体系、RNA体系、蛋白质体系、基因载体体系(载有GSK-3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9的突变失活位点基因)、细胞体系(载有GSK-3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9的突变失活位点基因)，和/或
所述的表达GSK-3β的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达GSK-3β的细胞；或可以是重组表达GSK-3β的细胞。所述的表达GSK-3β的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。所述的动物体系如动物模型；例如但不限于非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到GSK-3β的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达GSK-3β的体系。
在本发明的优选方式中，候选物质可以包括但不限于：小分子化合物或小分子组合物，或使用生物学方法(如基因导入，基因编辑，RNA干扰、蛋白抑制等)的抑制剂、阻断剂、失活剂、突变剂、干扰剂；如抑制(阻断/失活)肿瘤细胞内GSK-3β的Y216和Ser9双靶点活性或其磷酸化活性，或其编码核苷酸而设计构建的突变基因及其导入基因载体、结合分子(如抗体或配体)、阻滞分子(如基于氨基酸修饰的阻滞剂)、各种RNA干扰分子、基因编辑试剂、核酸抑制物、氨基酸定向突变试剂(如定向突变第9位和第216位氨基酸编码的试剂)等。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的候选物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于治疗肿瘤真正有用的物质；进一步完善靶向抑制剂或靶向抑制剂体系的抑癌效果。。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的治疗肿瘤的候选物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制肿瘤细胞内GSK-3β的Y216和Ser9双靶点活性或磷酸化活性的靶向抑制剂或抑制剂体系，进而筛选或研发出用于治疗肿瘤的新药物。
如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
在得知了所述的靶向性抑制剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的靶向性抑制剂或含有其的药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释、口服给予等。
所述的靶向性抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的靶向性抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
技术效果
本发明公开了一种同时抑制(阻断/失活)肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的Y216(GSK-3βY216)和Ser9(GSK-3βSer9)双靶位点活性(或磷酸化活性)；或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制该双靶点活性；从而产生抑癌效果的抑制剂或抑制剂体系及其筛选方法。而抑制(阻断/失活)Y216、Ser9双靶点产生的抑癌效果，显著优于抑制(阻断/失活)Y216、Ser9其中任一单一靶点的抑癌效果。该双靶点抑制剂或抑制剂体系包括：靶向抑制(阻断/失活)该双靶点的化学小分子抑制剂或小分子抑制组合物(已有的或者正在开发的，以及市场上可购到的GSK-3β抑制剂)；靶向抑制(阻断/失活)该双靶点的生物学靶向抑制剂或抑制剂体系，如突变基因导入抑制，基因编辑抑制，蛋白抑制等；靶向抑制(阻断/失活)该双靶点的化学-生物混合靶向组合物抑制体系。
本发明为筛选或研发临床靶向治疗肿瘤(优选肝癌及消化系统肿瘤)的新靶向药提供新方法、新思路、新策略；为临床治疗肿瘤提供新双靶点组合和新药物。
在本发明的具体实施方式中，本发明使用慢病毒的生物学方法构建GSK-3βY216突变(抑制Y216位点活性)；Ser9突变(抑制Ser9位点活性)；Y216和Ser9双突变(抑制Y216和Ser9双靶位点活性)的HCC细胞系。本发明人的研究发现，根据不同的HCC细胞系，单独的GSK-3βY216突变，产生30-60％的抑癌效果；单独的GSK-3βSer9突变，产生从微弱到无效的抑癌作用；而同时突变GSK-3βY216和Ser9，则产生最好的抑制肝癌作用(60-90％的抑癌效果)。GSK-3βSer9突变对GSK-3βY216突变的抑癌效果有增强或促进作用，推测phosphor-GSK-3βSer9是通过调控GSK-3βY216发挥调控肿瘤发生发展作用。同样机理，同时抑制(阻断/失活)肿瘤细胞内GSK-3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶点活性或其磷酸化活性，治疗其他与GSK-3β信号通路密切相关的肿瘤也会产生最好的抑癌效果。
因此，同时突变GSK-3βY216和Ser9位点，其抗肿瘤效果比单独突变他们任何其中的一个位点更有效。这可为筛选或研发临床治疗肝癌及其他肿瘤的新靶向药物，提供新方法、新手段、新思想、新策略；为临床治疗肿瘤提供新双靶点组合和新药物以及相应的科研用试剂。
现在市场上或在研发中的基于靶向肿瘤细胞GSK-3β激酶靶点的GSK-3β化学小分子靶向药，或生物靶向药，基本都是抑制GSK-3βY216单靶点位点活性，其抑癌效果只能够达到30-60％；而本发明的双靶点抑制剂或抑制剂体系及技术方法是同时抑制肿瘤细胞内GSK-3β激酶活性位点Y216和非激酶活性位点Ser9双靶点活性或其磷酸化活性，其抑癌效果将达到60-90％左右；远远优于现有或正在研究的基于GSK-3β激酶的靶向药及其技术方法。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、GSK-3β序列突变的设计
野生型的GSK-3β的编码序列如下(SEQ ID NO:1)：
野生型的GSK-3β的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)如下：
上述氨基酸基因编码序列中，第9位为丝氨酸(Ser)，第216位为酪氨酸(Tyr)。本发明人经过反复研究后，确定将其第9位Ser突变为苯丙氨酸(Phe)，将其第216位Tyr突变为苯丙氨酸(Phe)。
在编码序列中，相应的突变位点为(图1)：
S9位点：TCC→TTT；
Y216位点：TAT→TTT。
实施例2、载体构建和转化
1、慢病毒载体构建及包装
(1)扩增野生型的GSK-3β，以慢病毒载体pLenti-CMV-PGK-blasticidin(购自和源生物公司)为骨架载体，在其XhoI/SwaI酶切位点插入其扩增产物，构建GSK-3β过表达质粒载体。通过定点突变的方式，获得表达GSK-3β的Y216点突变的表达质粒载体；表达Ser9点突变的表达质粒载体；表达Y216和Ser9双突变的表达质粒载体。酶切鉴定获得成功构建的慢病毒质粒。
(2)将构建的GSK-3β过表达，GSK-3βY216点突变、Ser9点突变、Y216和Ser9双突变质粒包装为慢病毒。
2、构建携带不同GSK-3β基因的肝癌细胞系
将前述制备的慢病毒分别感染处理人肝细胞癌细胞(HCC)系Hep3B和CSQT-2，从而获得过表达野生型以及GSK-3βY216点突变、Ser9点突变、Y216和Ser9双突变HCC细胞。
3、将上述感染GSK-3β过表达HCC细胞作为对照；分别感染GSK-3βY216点突变、GSK-3βSer9点突变的HCC细胞作为抑制单一靶点对照；感染GSK-3βY216和Ser9双突变的HCC细胞作为处理组，观察其体内外肿瘤生物学行为的差异。
实施例3、Y216点突变、Ser9点突变、Y216和Ser9双突变的HCC细胞系的生长增殖能力比较
1、将上述感染过表达GSK-3β的慢病毒的HCC细胞作为对照；分别感染过表达GSK-3βY216点突变、GSK-3βSer9点突变的HCC细胞作为抑制单一靶点对照；感染过表达GSK-3βY216和Ser9双突变的慢病毒的HCC细胞系作为处理组(实验步骤同实施例2)；
2、HCC细胞用高糖DMEM(含10％FBS)，放置于37℃、5％CO2孵箱中培养，保持饱和湿度。将对数生长期细胞，0.5％胰酶消化3-5分钟，室温下800转离心3分钟，加入适量培养基后，吹打成单细胞悬液，用计数板进行细胞计数，传孔至96孔板，每孔5000个细胞，每孔200ul培养基，37℃、5％CO2培养，细胞处理24小时、48小时，加入CCK-8试剂10ul/孔，相同条件下培养1hr，用分光光度计测其在450nm时的吸光度值(OD值)。
GSK-3β过表达，GSK-3βY216点突变(Y216-)；Ser9点突变(Ser9-)；Y216和Ser9双突变(Double-)的Hep3B和CSQT-2细胞的生长增殖结果见图2。
图2中，对GSK-3β过表达，GSK-3βY216点突变(抑制Y216位点活性)；Ser9点突变(抑制Ser9位点活性)；Y216和Ser9双突变(抑制Y216和Ser9双位点活性)的HCC细胞的生长增殖进行了比较，96小时结果显示：Y216和Ser9双突变(抑制Y216和Ser9双靶位点活性)的HCC细胞的生长增殖能力，较其中任一单一靶点突变(抑制Y216或Ser9任一单靶点活性)的HCC细胞以及对照组细胞的生长增殖能力都显著降低。
实施例4、Y216点突变、Ser9点突变、Y216和Ser9双突变的HCC细胞的体外克隆形成能力(致瘤性)比较
1、将上述感染过表达GSK-3β的慢病毒的HCC细胞作为对照；分别感染GSK-3βY216点突变、GSK-3βSer9点突变作为抑制单一靶点对照；感染GSK-3βY216和Ser9双突变的慢病毒的HCC细胞作为处理组(实验步骤同实施例2)；
2、分别接种HCC细胞至6孔板中，1000个/孔，摇匀后于用高糖DMEM(含10％FBS)，放置于37℃、5％CO2孵箱中培养两周，10％福尔马林固定，结晶紫染色，取照片，用imageJ软件分析各组克隆数，统计分析不同条件下细胞的克隆形成的差异。
GSK-3β过表达，GSK-3βY216点突变；GSK-3βSer9点突变；Y216/Ser9双突变对HCC细胞的克隆形成能力比较见图3所示，其中，左图为实验结果图，右图为左图的实验结果的统计分析结果。
图3实验结果显示，Y216和Ser9双突变(抑制Y216和Ser9双靶位点活性)的HCC细胞的形成克隆能力(致瘤性)较其中任一单一靶点突变(抑制Y216或Ser9任一单靶点活性)的HCC细胞的形成克隆能力(致瘤性)都显著降低。
实施例5、Y216点突变、Ser9点突变、Y216和Ser9双突变的HCC细胞的体外克迁移能力比较
1、将上述感染过表达GSK-3β的慢病毒的HCC细胞作为对照；分别感染GSK-3βY216点突变、GSK-3βSer9点突变的HCC细胞作为抑制单一靶点对照；感染GSK-3βY216和Ser9双突变的慢病毒的HCC细胞系作为处理组(实验步骤同实施例2)；
2、分别接种HCC细胞至24孔板的小室中，5000个/孔，小室中的培养条件为高糖DMEM(含1％FBS)，24孔板中的培养条件为高糖DMEM(含20％FBS)，37℃、5％CO2孵箱中培养24小时，10％福尔马林固定细胞，结晶紫染色，取照片，用imageJ软件分析各组穿过小室的HCC细胞，统计分析不同条件下迁移的细胞的差异。
GSK-3β过表达，GSK-3βY216点突变；GSK-3βSer9点突变；Y216/Ser9双突变对HCC细胞的迁移能力比较结果见图4。
图4中，对GSK-3β过表达，GSK-3βY216点突变；GSK-3βSer9点突变；Y216/Ser9双突变HCC细胞的迁移能力进行了比较。图左为实验结果图，图右为图左的实验结果的统计分析结果。Y216和Ser9双突变(抑制Y216和Ser9双靶位点活性)的HCC细胞的迁移能力较其中任一单一靶点突变(抑制Y216或Ser9任一单靶点活性)的HCC细胞的迁移能力都显著降低。
实施例6、Y216点突变、Ser9点突变、Y216和Ser9双突变的HCC细胞的动物体内成瘤能力比较
1、将上述感染过表达GSK-3β的慢病毒的HCC细胞作为对照；分别感染GSK-3βY216点突变、GSK-3βSer9点突变的HCC细胞作为抑制单一靶点对照；感染GSK-3βY216和Ser9双突变GSK-3β的慢病毒的HCC细胞系作为处理组(实验步骤同实施例2)；
2、将各组细胞注射到裸鼠(n＝5，2点/只裸鼠)体内，采用皮下注射的方式。继续喂养裸鼠30天，观测裸鼠体内的成瘤情况。
GSK-3β过表达，GSK-3βY216点突变；GSK-3βSer9点突变；Y216/Ser9双突变HCC细胞注射到裸鼠体内的成瘤情况见图5。
图5显示了GSK-3β过表达，GSK-3βY216点突变；GSK-3βSer9点突变；Y216/Ser9双突变HCC细胞注射到裸鼠体内的成瘤情况。图左为实验结果图，图右分别为图左的肿瘤的重量、体积以及不同时间点的肿瘤体积的统计分析结果。实验结果显示：Y216和Ser9双突变(抑制/阻断/失活)的HCC细胞在实验动物体内成瘤能力(致瘤性)较其中任一单一靶点突变(抑制/阻断/失活)的HCC细胞在实验动物体内成瘤能力(致瘤性)都显著降低。
综上，实施例1-6的系列筛选实验结果表明，表达GSK-3βY216和Ser9双突变质粒包装的慢病毒表达载体，可作为通过突变GSK-3βY216和Ser9双靶点的基因编码，而抑制该双靶点活性的抑制剂或抑制剂体系。
实施例7、靶向抑制(阻断/失活)肿瘤细胞GSK-3βY216和Ser9位点双靶点的活性或磷酸化活性的化学小分子抑制剂或抑制剂组合物筛选
实验原理：将人肝细胞癌细胞(HCC)系Hep3B和CSQT-2肝癌细胞经过GSK-3β抑制剂(CHIR-99021、BIO、LY2090314)处理或者经shGSK3β干扰和OVGSK-3β过表达后，分别采用CCK8、平板克隆、Migration实验检测GSK-3β对肝癌细胞增殖、致瘤性、侵袭转移的影响。实验方法为常规方法，为本专业人员熟知。
1、对照组和处理组设置
①处理组1：用CHIR-99021(抑制Y216位点)处理人肝细胞癌细胞(HCC)系Hep3B和CSQT-2；
②处理组2：用BIO(抑制Ser9位点)处理人肝细胞癌细胞(HCC)系Hep3B和CSQT-2；
③处理组3：用Ly2090314(抑制Y216位点和Ser9位点)处理人肝细胞癌细胞(HCC)系Hep3B和CSQT-2；
④处理组4：用CHIR-99021(抑制Y216位点)和BIO(抑制Ser9位点)处理人肝细胞癌细胞(HCC)系Hep3B和CSQT-2；
⑤对照组：用相同剂量的DMSO处理人肝细胞癌细胞(HCC)系Hep3B和CSQT-2；
2、按照上述实施例3-5实验步骤进行各项检查和观察对比实验。
实验结果见图6。
比较实验结果1：CHIR-99021抑制GSK-3βY216位点的磷酸化活性，同时抑制了HCC细胞的肿瘤生物学行为；
比较实验结果2：BIO抑制GSK-3βS9位点的磷酸化活性，同时抑制了HCC细胞的肿瘤生物学行为；
比较实验结果3：Ly2090314抑制GSK-3βY216位点和S9位点的磷酸化活性，同时抑制了HCC细胞的肿瘤生物学行为；
比较实验结果4：CHIR-99021和BIO联合使用，同时抑制了GSK-3βY216位点和S9位点的磷酸化活性，HCC细胞的肿瘤生物学行为也被抑制；
上述实验结果表明，同时抑制GSK-3βY216位点和S9位点的磷酸化活性的小分子或者小分子组合，对HCC细胞的肿瘤生物学行为的抑制显著优于单一抑制GSK-3βY216位点或S9位点的磷酸化活性而产生的抑癌效果。
因此，小分子Ly2090314；小分子组合物：CHIR-99021和BIO；是具有同时抑制GSK-3βY216位点和S9位点活性，或其磷酸化活性而产生抑癌效果的抑制剂或抑制剂组合物。
实施例8、靶向抑制(阻断/失活)肿瘤细胞GSK-3βY216和Ser9位点双靶点的活性或磷酸化活性的化学-生物混合抑制剂体系筛选
1、处理组和对照组：
按照实施例1、2相同步骤：
(1)构建GSK-3β过表达，GSK-3βY216点突变、GSK-3βSer9点突变质粒包装的慢病毒表达载体。
(2)将前述制备的慢病毒分别感染处理人肝细胞癌细胞(HCC)系Hep3B和CSQT-2，从而获得过表达野生型以及GSK-3βY216点突变、Ser9点突变HCC细胞系；
(3)对照组：
对照组1：将感染过表达GSK-3β野生型HCC细胞作为空白对照；
对照组2：感染GSK-3βY216点突变的慢病毒的HCC细胞作为抑制单一靶点对照；
对照组3：感染GSK-3βSer9点突变的慢病毒的HCC细胞作为抑制单一靶点对照；
对照组4：感染GSK-3βY216和Ser9双突变的慢病毒的HCC细胞系作为抑制双靶点活性的阳性对照；
(4)处理组(测试组)：
①处理组1：用CHIR-99021(抑制Y216位点)处理GSK-3βS9点突变HCC细胞；
②处理组2：用BIO(抑制Ser9位点)处理GSK-3βY216点突变HCC细胞。
2、按照上述实施例3-5实验步骤进行各项检查和观察对比实验。
比较实验结果1：将处理组1实验结果与对照组1、3比较，CHIR-99021抑制GSK-3βY216位点的磷酸化活性；CHIR-99021与感染GSK-3βSer9点突变的慢病毒载体，同时抑制HCC细胞的GSK-3βY216和Ser9双突变位点活性或磷酸化活性，而产生显著优于对照组1、3的抑癌效果；且与对照组4的抑癌效果相近。
比较实验结果2：将处理组2实验结果与对照组1、2比较，BIO抑制GSK-3βS9位点的磷酸化活性；BIO与感染GSK-3βY216点突变的慢病毒载体同时抑制了HCC细胞的GSK-3βY216和Ser9双突变位点活性或磷酸化活性，从而产生显著优于对照组1、2的抑癌效果；且与对照组4的抑癌效果相近。
综上，上述实验结果表明，CHIR-99021和GSK-3βSer9点突变的慢病毒表达载体；BIO和GSK-3βY216点突变的慢病毒表达载体；是两组靶向抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9酶蛋白双靶位点活性(或磷酸化活性)；或通过突变所述双靶位点的基因编码而抑制(阻断/失活)其活性，从而产生抑癌效果的化学-生物混合抑制剂体系。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 海军军医大学第三附属医院
<120> 抑制肿瘤细胞GSK-3β双靶点的抑制剂或抑制剂体系及其筛选方法
<130> 190295
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1263
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
atgtcagggc ggcccagaac cacctccttt gcggagagct gcaagccggt gcagcagcct 60
tcagcttttg gcagcatgaa agttagcaga gacaaggacg gcagcaaggt gacaacagtg 120
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gtgattggaa atggatcatt tggtgtggta tatcaagcca aactttgtga ttcaggagaa 240
ctggtcgcca tcaagaaagt attgcaggac aagagattta agaatcgaga gctccagatc 300
atgagaaagc tagatcactg taacatagtc cgattgcgtt atttcttcta ctccagtggt 360
gagaagaaag atgaggtcta tcttaatctg gtgctggact atgttccgga aacagtatac 420
agagttgcca gacactatag tcgagccaaa cagacgctcc ctgtgattta tgtcaagttg 480
tatatgtatc agctgttccg aagtttagcc tatatccatt cctttggaat ctgccatcgg 540
gatattaaac cgcagaacct cttgttggat cctgatactg ctgtattaaa actctgtgac 600
tttggaagtg caaagcagct ggtccgagga gaacccaatg tttcgtatat ctgttctcgg 660
tactataggg caccagagtt gatctttgga gccactgatt atacctctag tatagatgta 720
tggtctgctg gctgtgtgtt ggctgagctg ttactaggac aaccaatatt tccaggggat 780
agtggtgtgg atcagttggt agaaataatc aaggtcctgg gaactccaac aagggagcaa 840
atcagagaaa tgaacccaaa ctacacagaa tttaaattcc ctcaaattaa ggcacatcct 900
tggactaagg tcttccgacc ccgaactcca ccggaggcaa ttgcactgtg tagccgtctg 960
ctggagtata caccaactgc ccgactaaca ccactggaag cttgtgcaca ttcatttttt 1020
gatgaattac gggacccaaa tgtcaaacta ccaaatgggc gagacacacc tgcactcttc 1080
aacttcacca ctcaagaact gtcaagtaat ccacctctgg ctaccatcct tattcctcct 1140
catgctcgga ttcaagcagc tgcttcaacc cccacaaatg ccacagcagc gtcagatgct 1200
aatactggag accgtggaca gaccaataat gctgcttctg catcagcttc caactccacc 1260
tga 1263
<210> 2
<211> 420
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Ser Gly Arg Pro Arg Thr Thr Ser Phe Ala Glu Ser Cys Lys Pro
1 5 10 15
Val Gln Gln Pro Ser Ala Phe Gly Ser Met Lys Val Ser Arg Asp Lys
20 25 30
Asp Gly Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro
35 40 45
Asp Arg Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn
50 55 60
Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu Cys Asp Ser Gly Glu
65 70 75 80
Leu Val Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Asp Lys Arg Phe Lys Asn Arg
85 90 95
Glu Leu Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His Cys Asn Ile Val Arg Leu
100 105 110
Arg Tyr Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys Lys Asp Glu Val Tyr Leu
115 120 125
Asn Leu Val Leu Asp Tyr Val Pro Glu Thr Val Tyr Arg Val Ala Arg
130 135 140
His Tyr Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Lys Leu
145 150 155 160
Tyr Met Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Leu Ala Tyr Ile His Ser Phe Gly
165 170 175
Ile Cys His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Asn Leu Leu Leu Asp Pro Asp
180 185 190
Thr Ala Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ser Ala Lys Gln Leu Val
195 200 205
Arg Gly Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala
210 215 220
Pro Glu Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr Thr Ser Ser Ile Asp Val
225 230 235 240
Trp Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu Leu Leu Gly Gln Pro Ile
245 250 255
Phe Pro Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu Val Glu Ile Ile Lys Val
260 265 270
Leu Gly Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg Glu Met Asn Pro Asn Tyr
275 280 285
Thr Glu Phe Lys Phe Pro Gln Ile Lys Ala His Pro Trp Thr Lys Val
290 295 300
Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Cys Ser Arg Leu
305 310 315 320
Leu Glu Tyr Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Ala Cys Ala
325 330 335
His Ser Phe Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro Asn Val Lys Leu Pro Asn
340 345 350
Gly Arg Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe Thr Thr Gln Glu Leu Ser
355 360 365
Ser Asn Pro Pro Leu Ala Thr Ile Leu Ile Pro Pro His Ala Arg Ile
370 375 380
Gln Ala Ala Ala Ser Thr Pro Thr Asn Ala Thr Ala Ala Ser Asp Ala
385 390 395 400
Asn Thr Gly Asp Arg Gly Gln Thr Asn Asn Ala Ala Ser Ala Ser Ala
405 410 415
Ser Asn Ser Thr
420
Claims (10)
1.用于靶向抑制肿瘤发生发展的抑制剂或抑制剂体系，其靶向抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的Y216位点和Ser9位点双靶点的活性；或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制该双靶点活性，从而抑制肿瘤的发生发展，其包括：
(a)靶向于肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的Y216位点和Ser9位点并发挥抑制其活性作用，或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制其活性的抑制剂或抑制剂体系；或
(b)由两种或两种以上组分混合的组合物或组合物体系，所述组分分别或同时靶向于肿瘤细胞糖原合成酶激酶3的Y216位点和Ser9位点，并抑制其活性；或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制其活性的抑制剂或抑制剂体系。
2.如权利要求1所述的抑制剂或抑制剂体系，其特征在于，所述的抑制剂或抑制剂体系，其抑制物质或组分包括选自下组的物质或组分：化学小分子或小分子组合物，或基于生物学方法的抑制剂、阻断剂、失活剂、突变剂、干扰剂；较佳地，所述的抑制物质或组分靶向抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的y216位点和Ser9位点；或通过突变所述双靶位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制其活性；或抑制所述双靶位点的磷酸化活性。
3.如权利要求2所述的抑制剂或抑制剂体系，其特征在于，所述抑制剂或抑制剂体系，其物质或组分包括：化学小分子或小分子组合物；其中，靶向于肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的Y216位点并发挥抑制其活性作用的化学小分子包括：CHIR-99021，BIO、IM-12、TWS119、CHIR-98014、1-Azakenpaullone、AR-A014418、SB216763、LY2090314等；
靶向于肿瘤细胞糖原合成酶激酶3βSer9位点并发挥抑制其活性作用的小分子包括：BIO、LY2090314、IM-12、TWS119、CHIR-98014、1-Azakenpaullone、AR-A014418、SB216763等；或
同时靶向于肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的Y216位点和Ser9位点并发挥抑制其活性作用的小分子或小分子组合物包括：小分子：BIO、LY2090314；或小分子组合物：CHIR-99021和BIO；CHIR-99021或LY2090314。
4.如权利要求2所述的抑制剂或抑制剂体系，其特征在于，所述抑制剂或抑制剂体系，其物质或组分包括：通过靶向突变Y216位点和Ser9位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制该双靶位点活性的化学或生物学抑制剂、阻断剂、失活剂、突变剂、干扰剂；其中，
靶向抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的Ser9酶蛋白位点，或通过突变所述位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制其活性的抑制剂或抑制剂体系，其物质包括：抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的Ser9酶蛋白位点；或突变抑制其相应的基因编码位点的化学物质或生物物质；生物物质如编码核酸而设计构建的突变基因及其导入突变基因的载体工具，如：过表达GSK-3βSer9突变质粒包装的慢病毒表达载体、过表达GSK-3βSer9突变质粒包装的腺相关病毒表达载体；结合分子、阻滞分子、各种RNA干扰分子、基因编辑试剂、核酸抑制物、氨基酸定向突变试剂等靶向抑制剂或靶向抑制剂体系；或
靶向抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的Y216位点酶蛋白位点，或通过突变所述位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制其活性的物质包括：抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的Y216酶蛋白位点，或通过突变所述位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制其活性的化学物质或生物物质；生物物质如编码核酸而设计构建的突变基因及其导入突变基因的载体工具，如：过表达GSK-3βY216突变质粒包装的慢病毒表达载体、过表达GSK-3βY216突变质粒包装的腺相关病毒表达载体；结合分子、阻滞分子、各种RNA干扰分子、基因编辑试剂、核酸抑制物、氨基酸定向突变试剂等靶向抑制剂或靶向抑制剂体系；
同时靶向抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9酶蛋白双靶位点活性，或通过突变所述双靶位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制其活性的物质包括：抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的Y216和Ser9双靶点酶蛋白位点，或通过突变所述双靶点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制其活性的化学物质或生物物质；生物物质如编码核酸而设计构建的突变基因及其导入突变基因的载体，如：过表达GSK-3βY216和Ser9双突变质粒包装的慢病毒表达载体、过表达GSK-3βY216和Ser9双突变质粒包装的腺相关病毒表达载体；结合分子、阻滞分子、各种RNA干扰分子、基因编辑试剂、核酸抑制物、氨基酸定向突变试剂等靶向抑制剂或靶向抑制剂体系。
5.如权利要求1所述的抑制剂或抑制剂体系，其特征在于，其是包括化学靶向抑制剂与生物学靶向抑制剂的混合靶向抑制剂组合或体系，能够分别或同时靶向抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶位点活性，或通过突变所述双靶位点的基因编码，或干扰其基因转录、翻译而抑制其双靶点活性；或发挥抑制其磷酸化活性作用的化学-生物学混合靶向抑制剂体系，如CHIR-99021和GSK-3βSer9点突变慢病毒表达载体；BIO和GSK-3βY216点突变的慢病毒表达载体；所构成的化学-生物混合抑制体系。
6.权利要求1～5任一所述抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶位点活性的靶向抑制剂或抑制剂体系的用途，用于制备抑制肿瘤发生发展的药物或药物组合物。
7.一种药物或药物组合物，其特征在于，其包含权利要求1-5任一所述的抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶位点活性的靶向抑制剂或靶向抑制剂体系，其还包含药学上可接受的载体或赋形剂；较佳地，其载体或赋形剂包括：
水、盐水、磷酸缓冲液或其它水性溶剂；
DMSO、甘油和乙醇或其它有机溶剂；
微球、脂质体、微乳液或高分子表面活性剂；
胶体型载药系统或高分子载药系统；或
防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、pH缓冲物质，黏合剂、填充剂、润滑剂或其它药物赋形剂。
8.如权利要求7所述的药物或药物组合物，其特征在于，药物剂型包括：
固体剂型，包括粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂，或其他固体剂型；
液体剂型，包括注射剂、输液剂、混悬剂，或其它液体剂型；
气体剂型；或
半固体剂型。
9.一种筛选抑制肿瘤细胞糖原合成酶激酶3β的GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶位点活性的靶向抑制剂或靶向抑制剂体系的方法，包括：
步骤(1)：测试组或处理组：将候选物质处理含有糖原合成酶激酶3的肿瘤细胞或肿瘤细胞系；
步骤(2)：检测处理组肿瘤细胞的糖原合成酶激酶3的第9位和第216位点活性或磷酸化活性、体内外致瘤性、生长增殖特性、迁移性以及相关肿瘤细胞特异性指标，并与对照组比较，其中所述的对照组是使用与处理组相同的肿瘤细胞或肿瘤细胞系，不进行所述候选物质处理；和/或只抑制肿瘤细胞的糖原合成酶激酶3的第9位和第216中任一位点；
与对照组相比较，如果测试组中糖原合成酶激酶3的第9位和第216位点的活性或磷酸化活性在统计学上低于对照组；
且，体内外致瘤性、生长增殖特性、迁移性以及相关肿瘤细胞特异性指标与对照组相比较，处理组分别或同时抑制肿瘤细胞GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶点的抑癌效果显著优于抑制其中任一单靶点的抑癌效果，就表明该候选物质是抑制肿瘤细胞发生发展的靶向抑制剂或靶向抑制剂体系；
步骤(3)，体内抑癌效果验证，构建荷瘤动物模型；用初步筛选出的抑制肿瘤细胞GSK-3βY216和GSK-3βSer9双靶点活性的抑制剂或抑制剂体系处理荷瘤动物模型，验证其在荷瘤动物模型上的抑癌效果明显有效。
10.权利要求1～5任一所述抑制剂或抑制剂体系、权利要求6所述的用途或权利要求7～8任一所述的药物或药物组合物、权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤包括人肿瘤，较佳地，包括消化系统肿瘤，更佳地地为肝脏肿瘤，如肝癌。
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