CN108926713A

CN108926713A - 钙调磷酸酶调节蛋白1.4或其类似物在制备抑制肝癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN108926713A
Application number: CN201710384388.3A
Authority: CN
Inventors: 覃文新; 金浩杰
Original assignee: Shanghai Cancer Institute
Current assignee: Shanghai Cancer Institute
Priority date: 2017-05-26
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2018-12-04

Abstract

本发明涉及钙调磷酸酶调节蛋白1.4(RCAN1.4)或其类似物在制备抑制肝癌的药物中的应用。本发明揭示了RCAN1.4本身或其上调剂能够用于抑制肝癌；RCAN1.4功能类似药物如环孢菌素A，也能够显著降低肝癌细胞的体内肺转移能力。

Description

钙调磷酸酶调节蛋白1.4或其类似物在制备抑制肝癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及钙调磷酸酶调节蛋白1.4或其类似物在制备抑制肝癌的药物中的应用。

背景技术

原发性肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC，以下简称肝癌)是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，全球范围内其死亡率在男性中高居第二，在女性中位居第五。肝癌也是我国目前最常见的四种肿瘤之一，全球约50％以上的原发性肝癌发生在中国，发病率位居世界首位。肝癌早期诊治较难，病情进展快且预后差，其中绝大多数肝癌患者都死于肿瘤的转移和复发。据临床研究资料显示：即使是根治性手术，肝癌患者术后5年转移复发率仍高达60-70％，而局部治疗转移复发率则更高。因此，深入研究肝癌发生、发展的分子机制，寻找新的治疗靶点并设计合理有效的干预治疗手段，一直是肝癌研究领域的重点和难点。

钙调磷酸酶调节蛋白1(Regulator of calcineurin 1，RCAN1)是钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)的一类内源性调节因子，最早发现于唐氏综合症关键区域1(DownSyndrome Critical Region，DSCR1)的q22.12区域。RCAN1基因组有7个外显子，分别被6个内含子隔开，其中外显子1-4可被选择性剪切产生4种不同的mRNA转录产物。研究发现，在哺乳动物组织中只能检测到其中三种选择性剪接体的mRNA表达产物，且绝大多数转录产物都是以外显子1(RCAN1.1)或外显子4(RCAN1.4)起始。RCAN1的表达具有组织特异性：RCAN1.1大量表达于心脏、大脑、肌肉和胰腺中；RCAN1.2只表达于胎儿肝脏和大脑中；而RCAN1.4主要表达于心脏、肝脏、肌肉、胎盘、胰腺和肾脏中。RCAN1.4蛋白包含197个氨基酸，主要通过与CaN的调节亚基结合，调节CaN的活性进而影响下游信号通路和靶基因的表达。

CaN是目前已知的唯一受Ca²⁺和钙调素(Calmodulin，CaM)激活的磷酸酶，在免疫、神经、心血管和内分泌等系统中均发挥着重要的作用。RCAN1在细胞中能够通过与CaN结合而发挥抑制CaN活性的作用。CaN通过催化磷脂酰丝氨酸和磷脂酰苏氨酸脱磷酸化，活化底物蛋白T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFATs)。在不同的生理状态和疾病类型中，胞浆中的NFAT家族成员受CaN脱磷酸作用后进入细胞核，结合到某些与免疫、神经、心血管和内分泌等系统相关基因的启动子和增强子区域，诱导一系列功能不重叠基因的转录。

本领域中，目前尚不清楚CaN在原发性肝癌中的功能作用。

发明内容

本发明的目的在于提供钙调磷酸酶调节蛋白1.4或其类似物在制备抑制肝癌的药物中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种钙调磷酸酶调节蛋白1.4或其上调剂的用途，用于制备抑制肝癌的组合物。

在一个优选例中，所述的肝癌是钙调磷酸酶调节蛋白1.4低表达的肝癌；或所述的肝癌是钙调神经磷酸酶/底物蛋白T细胞核因子1(CaN/NFAT1)信号通路激活的肝癌。

在另一优选例中，所述的钙调磷酸酶调节蛋白1.4的上调剂包括：钙调磷酸酶调节蛋白1.4的表达载体。

在另一优选例中，所述的表达载体包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的表达载体包括(但不限于)：慢病毒载体，腺病毒载体。

在本发明的另一方面，提供钙调磷酸酶调节蛋白1.4的功能类似物的用途，用于制备抑制肝癌的组合物。

在一个优选例中，所述的钙调磷酸酶调节蛋白1.4的功能类似物包括(但不限于)：CaN外源性抑制剂环孢菌素A，FK506，匹美莫司。

在另一优选例中，所述的肝癌是钙调磷酸酶调节蛋白1.4低表达的肝癌；或所述的肝癌是钙调神经磷酸酶/底物蛋白T细胞核因子1(CaN/NFAT1)信号通路激活的肝癌。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肝癌的药物组合物，所述的药物组合物中包括：钙调磷酸酶调节蛋白1.4或其上调剂，或钙调磷酸酶调节蛋白1.4的功能类似物；和学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述的钙调磷酸酶调节蛋白1.4的上调剂包括：钙调磷酸酶调节蛋白1.4的表达载体；或所述的钙调磷酸酶调节蛋白1.4的功能类似物包括(但不限于)：环孢菌素A，FK506，匹美莫司。

在本发明的另一方面，提供一种筛选用于抑制肝癌的潜在物质的方法，所述的方法包括：

(1)将候选物质与表达钙调磷酸酶调节蛋白1.4的体系接触；

(2)检测候选物质对钙调磷酸酶调节蛋白1.4的影响；

若所述候选物质可提高(优选显著提高，如提高5倍以上，较佳的提高10倍；更佳的提高20倍以上)钙调磷酸酶调节蛋白1.4的表达、活性，则表明该候选物质是可用于抑制肝癌的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达钙调磷酸酶调节蛋白1.4的体系中；和/或步骤(2)包括：检测测试组的体系中钙调磷酸酶调节蛋白1.4的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达钙调磷酸酶调节蛋白1.4的体系；如果测试组中钙调磷酸酶调节蛋白1.4的表达、活性在统计学上高于(优选显著提高，如提高5倍以上，较佳的提高10倍；更佳的提高20倍以上)对照组，就表明该候选物质是可用于抑制肝癌的潜在物质。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系(或亚细胞培养物体系)、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于抑制肝癌有用的组合物。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对钙调磷酸酶调节蛋白1.4或其片段或变异体或其编码基因设计的过表达构建体，活性促进分子等。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、RCAN1.4在肝癌组织中表达下调。

(A)定量PCR检测RCAN1三种选择剪接体RCAN1.1、RCAN1.2和RCAN1.4的mRNA在肝癌组织及配对癌旁肝组织中的表达水平(n＝108)；

(B)108例肝癌病人RCAN1.4mRNA的倍数变化。其中，***代表p<0.001。

图2、过表达RCAN1.4抑制肝癌细胞体外运动和侵袭能力。

(A)CCK-8实验检测过表达RCAN1.4后肝癌细胞的增殖能力；

(B)细胞迁移实验检测过表达RCAN1.4后肝癌细胞的迁移能力；

(C)细胞侵袭实验检测过表达RCAN1.4后肝癌细胞的侵袭能力。其中，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。

图3、过表达RCAN1.4抑制肝癌细胞体内生长和转移。

(A)裸鼠肝原位成瘤模型中各组裸鼠肿瘤照片和瘤体体积的统计图(MHCC97H-Vector vs MHCC97H-RCAN1.4；HCCLM3-Vector vs HCCLM3-RCAN1.4)；

(B)裸鼠肝原位成瘤模型中各组裸鼠肺转移灶HE染色照片及肺转移灶数量统计图。其中，*代表p<0.05，**代表p<0.01。

图4、抑制CaN磷酸酶活性可抑制肝癌体内转移。

(A)过表达RCAN1.4抑制肝癌细胞中CaN的磷酸酶活性；

(B)裸鼠体内转移模型中，CsA药物注射可以治疗低表达RCAN1.4肝癌细胞的体内转移。其中，*代表p<0.05，**代表p<0.01。

具体实施方式

本发明人经过深入研究，首次揭示一种钙调磷酸酶调节蛋白1.4(RCAN1.4蛋白)在治疗肝癌药物中的应用。RCAN1.4其本身或其上调剂能够用于抑制肝癌；也可基于RCAN1.4的上述功能，筛选抑制肝癌的物质。并且，RCAN1.4功能类似药物如环孢菌素A，也能够显著降低肝癌细胞的体内肺转移能力。

RCAN1.4

本发明人首先通过定量PCR测定发现，肝癌组织及配对癌旁组织中RCAN1.4 mRNA的表达量降低。之后，通过一系列的体内外功能实验研究RCAN1.4对肝癌细胞生长、运动和转移的抑制作用发现，提高RCAN1.4的表达有利于抑制肝癌。

因此，RCAN1.4是一种新的对于抑制肝癌、特别是CaN/NFAT1信号通路激活的肝癌或以RCAN1.4表达下降为特点的肝癌有效的治疗物质。

基于本发明人的新发现，本发明提供了RCAN1.4蛋白的用途，用于制备肝癌、特别是CaN/NFAT1信号通路激活的肝癌或以RCAN1.4表达下降为特点的肝癌的组合物；或用于筛选抑制肝癌、特别是CaN/NFAT1信号通路激活的肝癌或以RCAN1.4表达下降为特点的肝癌的物质。

在本发明中，所用的RCAN1.4蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的RCAN1.4蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组RCAN1.4蛋白。优选的，本发明可采用重组的RCAN1.4蛋白。

任何适合的RCAN1.4蛋白均可用于本发明。所述的RCAN1.4蛋白包括全长的RCAN1.4蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的RCAN1.4蛋白的氨基酸序列可以与SEQ IDNO:2所示的序列基本上相同。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的RCAN1.4蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。RCAN1.4蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种RCAN1.4蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，RCAN1.4蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的RCAN1.4蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长RCAN1.4蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长RCAN1.4蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的RCAN1.4蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的RCAN1.4蛋白。所述经过修饰或改良的RCAN1.4蛋白可以是一种RCAN1.4蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的RCAN1.4蛋白可以是与天然存在的RCAN1.4蛋白具有较小的共同点，但也能抑制肝癌，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响RCAN1.4蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

根据RCAN1.4蛋白的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。优选的，所述的RCAN1.4蛋白的核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1所示的序列基本上相同。

RCAN1.4上调剂

基于本发明人的上述新发现，本发明还提供了一种RCAN1.4的上调剂的用途，用于制备抑制肝癌，特别是钙调神经磷酸酶/底物蛋白T细胞核因子1信号通路激活的肝癌或以RCAN1.4表达下降为特点的肝癌的组合物(药物组合物)。

如本文所用，所述的RCAN1.4的上调剂包括了促进剂、激动剂等。任何可提高RCAN1.4蛋白的活性、维持RCAN1.4蛋白的稳定性、促进RCAN1.4蛋白的表达、促进RCAN1.4蛋白的分泌、延长RCAN1.4蛋白有效作用时间、或促进RCAN1.4的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于抑制肝癌的有效物质。

作为本发明的优选方式，所述的RCAN1.4蛋白的上调剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)RCAN1.4的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码RCAN1.4的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

本发明中，RCAN1.4多核苷酸序列可插入到重组表达载体中，从而可将之转入到细胞中，过表达产生RCAN1.4蛋白。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。例如，所述的表达载体包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的表达载体包括(但不限于)：慢病毒载体，腺病毒载体等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含RCAN1.4的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

RCAN1.4功能类似物

本发明人发现，RCAN1.4主要通过抑制钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)发挥作用，而其它具有该功能的物质，本发明人将之称为RCAN1.4蛋白的功能类似物，也具有抑制肝癌的功能。所述的RCAN1.4蛋白的功能类似物包括：环孢菌素A。

环孢菌素A(CyclosporineA，CsA)是一种从丝状真菌(Tolypocladiuminflatum)培养液中分离出的由11个氨基酸组成的环肽。CsA以往主要用于肝、肾以及心脏移植的抗排异反应，可与肾上腺皮质激素同用，也可用于一些免疫性疾病的治疗，如对类风湿关节炎及白塞(Behet’S disease，贝赫切特综合征)，取得了较为满意的疗效，对I型糖尿病、牛皮癣和寄生虫病如疟疾、血吸虫等有一定疗效。此外，CsA还具有广泛的其它生物学活性如抗真菌、抗寄生虫、抗HIV、抗炎、逆转肿瘤细胞多药耐药等作用。环孢菌素A发挥作用的主要机制是环孢菌素A与亲环孢素(Cyclophilins，CyP)形成复合物再与依赖钙/钙结合蛋白的钙调磷酸酶(CaN)作用，抑制NF-AT(nuclear factors of activated T cell，活化T细胞核因子)的去磷酸化使其不能进入核内。

而本发明中，将CsA的应用扩展到抑制肝癌，并论证其具有显著效果。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-20wt％；较佳的0.00001-10wt％)的所述的RCAN1.4蛋白、或其上调剂(如过表达该RCAN1.4蛋白的表达载体)、或其类似物，以及药学上可接受的载体。

本发明的组合物可直接用于抑制肝癌，特别是钙调神经磷酸酶/底物蛋白T细胞核因子1信号通路激活的肝癌或以RCAN1.4表达下降为特点的肝癌。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的组合物含有安全有效量的RCAN1.4蛋白、或其上调剂(如过表达该RCAN1.4蛋白的表达载体)、或其类似物，以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述的RCAN1.4蛋白或其上调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的RCAN1.4蛋白或其上调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的RCAN1.4蛋白或其上调剂每天以约0.00001mg-10mg/kg动物体重1的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明还提供了一种抑制肝癌的方法，包括给予受试者有效量的RCAN1.4蛋白、或其上调剂(如过表达该RCAN1.4蛋白的表达载体)、或其类似物。

本发明的RCAN1.4蛋白或其上调剂、或其类似物的给药方式没有特别的限制，可以是全身的或局部的。例如，本发明的RCAN1.4蛋白或其上调剂可通过腹腔注射、静脉注射、口服、皮下注射、脊髓鞘内注射、皮内注射等的方式给予动物。

在得知了所述的RCAN1.4蛋白的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的RCAN1.4蛋白或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行，比如可直接将RCAN1.4蛋白通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带RCAN1.4基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的RCAN1.4蛋白。

作为本发明的一种实施方式，可将所述的RCAN1.4蛋白直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码RCAN1.4蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如常规原核或真核表达载体、或病毒载体如疱疹病毒载体或腺病毒载体)中，将所述的载体导入到可表达所述RCAN1.4蛋白的细胞中，使所述的细胞表达RCAN1.4蛋白。可通过将适量的所述细胞引入到哺乳动物身体的适当部位，实现RCAN1.4蛋白的表达。

RCAN1.4蛋白的上调剂或类似物的给药方式主要取决于所述上调剂的类型和特性，这是本领域人员可以评估的。

筛选药物

在得知了所述的RCAN1.4蛋白在抑制肝癌后，可以基于该特征来筛选促进RCAN1.4的表达或活性的物质。

因此，本发明提供一种筛选可用于抑制肝癌的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达RCAN1.4的体系接触；和检测候选物质对RCAN1.4的影响；若所述候选物质可提高RCAN1.4的表达或活性或分泌，则表明该候选物质是可用于抑制肝癌的潜在物质。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到RCAN1.4的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达RCAN1.4的体系。

所述的表达RCAN1.4的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达RCAN1.4的细胞；或可以是重组表达RCAN1.4的细胞。所述的表达RCAN1.4的体系还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型)等。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肝癌真正有用的物质。

本发明对于RCAN1.4蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：SDS-PAGE法，Western-Blot法，ELISA等。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于抑制肝癌的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制肝癌真正有用的物质，从而用于临床。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料和方法

一、临床组织样品的收集

108对人原发性肝癌患者的癌组织(Cancerous tissues from humanhepatocellular carcinomas，简称C)及癌旁肝组织(Non-cancerous liver tissues，简称N)标本于2000年至2003年期间收集自中国上海东方肝胆医院。

二、定量PCR(Real-time PCR)

1.总RNA的提取

1).取新鲜肝癌组织及配对癌旁组织，液氮中研磨成粉末状，用Trizol试剂抽提取总RNA，每个6cm皿加入1mL Trizol，用移液器反复吹打几次，然后转移至1.5mL EP管中；

2).每1mL Trizol加0.2mL氯仿，剧烈震荡15秒，室温孵育5～10分钟；

3).4℃，11,000g离心15分钟并将上清转移至新的1.5mL EP管中，按每1mL Trizol加0.5mL异丙醇，室温孵育10分钟；

4).11,000g，4℃离心10min并弃去上清，用75％乙醇，按每1mL Trizol至少用1mL75％乙醇洗涤1～2次；

5).4℃，7,500g离心5分钟并室温干燥RNA沉淀5～10分钟；

6).用DEPC-H₂O溶解沉淀，用分光光度计定量RNA后取少量总RNA进行1％琼脂糖电泳，检查RNA是否溶解。

2.逆转录反应

逆转录反应体系如表1所示。

表1

逆转录反应条件：37℃逆转录15分钟，85℃失活逆转录酶5秒钟，4℃，取出备用。

3.实时定量PCR反应

以逆转录反应产物稀释30倍得到的cDNA作为模板。反应体系如表2。

表2

按以上体系加样(总体积20μL)置ABI 7500PCR仪上进行反应，设定反应条件为：95℃预变性15秒，然后95℃5秒，60℃31秒，40次循环；融解曲线条件为95℃15秒，60℃30秒，95℃15秒。以β-actin作为内参，并分析融解曲线以确定得到的扩增产物是否为单一特异性目的片段。采用2^-△△Ct的方法，计算每个基因的相对表达量。

4.定量PCR引物

定量PCR引物采用Primer Premier 5.0设计，引物信息具体如表3。

表3

三、RCAN1.4过表达细胞株的构建

1.pWPXL-RCAN1.4过表达载体构建

以胎盘cDNA为模板进行PCR扩增反应，获取RCAN1.4的编码区(codingsequence，CDS)序列。

引物序列为：

正向(5’-3’)：GCCGTTTAAACATGCATTTTAGAAACTT(SEQ ID NO:11)；

反向(5’-3’)：CGGGAATTCTCAGCTGAGGTGG(SEQ ID NO:12)。

按表4的反应体系进行扩增。

表4

PCR反应条件：98℃，10秒钟；68℃，1分钟/kb；该条件下进行30次循环。

分别以核酸内切酶EcoR I和BamH I对扩增片段和pWPXL载体质粒(Addgene)进行双酶切处理，以T4DNA连接酶连接片段和载体，并将其转化入感受态细菌HB101，挑单克隆送Invitrogen公司测序鉴定，鉴定正确后保藏菌种并进行扩大培养，并提取该重组质粒保存。

2.pWPXL-RCAN1.4慢病毒载体的包装

1).转染前一天，在10cm培养皿中接种6×10⁶个293T细胞，细胞接种均匀，转染时细胞密度为50～70％；

2).分别将12μg pWPXL-RCAN1.4慢病毒表达载体或对照载体同9μgpsPAX2和3.6μgpMD2.G包装质粒混合；

3).以1.5mL的DMEM培养基稀释质粒混合物，轻轻混匀；

4).以1.5mL的DMEM培养基稀释60μL Lipofectamine 2000^TM，轻轻混匀；

5).静置5分钟后混匀两者，室温孵育25分钟；

6).同时以DMEM培养基洗293T细胞1～2次，然后加入7mL的DMEM培养基；

7).将质粒/Lipofectamine 2000^TM混合物加至293T细胞中，CO₂培养箱中37℃培养；

9).培养6～8小时后，弃去培养液，加入10mL含10％FBS且含抗生素的DMEM培养基；

10).继续培养48小时后，用Millex-HV 0.45μm的PVDF滤膜过滤，收取病毒-80℃保存。

3.慢病毒感染

1).病毒转染前，将生长状态良好的人高转移肝癌细胞MHCC97H和HCCLM3细胞分别接种到6孔板中(4×10⁵个/孔)，加2mL含有10％FBS和抗生素的DMEM培养基置于CO₂培养箱中37℃培养过夜；

2).培养24小时后，在各孔细胞中加入含有10％FBS和Polybrene的DMEM培养基2mL。

3).孵育2小时后，加入2～4×10⁶单位病毒；

4).转染8～12小时后，每孔加入2mL含10％FBS且含抗生素的DMEM培养基；

5).培养48小时后，荧光显微镜观察绿色荧光，确定细胞感染效率。

构建完成的稳定细胞株将其分别命名为：MHCC97H-RCAN1.4(过表达)和MHCC97H-Vector(对照)，HCCLM3-RCAN1.4(过表达)和HCCLM3-Vector(对照)。

四、细胞生长检测

细胞生长实验采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒进行检测。CCK-8法是基于WST-8染料的一种计数方法。化合物WST-8可被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan，细胞数越多，则颜色越深，可通过酶标仪检测450nm吸光度值(OD₄₅₀)，OD₄₅₀与活细胞数量呈正比。96孔板每孔种植2000或4000个细胞，同时每孔加CCK-8试剂10μL，37℃孵育2小时，检测OD₄₅₀。接种细胞当天的结果标记为Day 0。

五、细胞迁移实验

Transwell小室是一种用于检测细胞运动能力的膜滤器，其外形类似杯子，可放于24孔板中，底层为一张有通透性的8μm孔径滤膜。实验过程中需将待检测细胞接种至Transwell小室内，在小室外的空间中加入含20～30％FBS的DMEM培养基，检测细胞的趋化能力。具体操作步骤如下：

1.检查Transwell小室滤膜的完整性，将其放入24孔板中；

2.将细胞状态良好的肝癌细胞用PBS洗3遍，胰酶消化后用无血清的DMEM培养基重悬，细胞计数并调整浓度至2.5×10⁵cell/mL，每个Transwell内室接种200μL细胞悬液，每个Transwell外室中加800μL含20～30％FBS的DMEM培养基，37℃培养；

3.根据不同细胞株运动能力的差异及实验设计目的不同，选取不同时间点取出小室；

4.取出小室后，弃去内室的残余培养基，并用棉签擦净内室滤膜上的细胞；

5.用含0.1％结晶紫和20％甲醇的PBS对小室染色30分钟；

6.用PBS清洗小室3～5次，再用棉签擦净小室内表面和滤膜，倒置显微镜观察小室滤膜上的细胞并计数(100×倍镜下随机选择五个视野并计数)，同类实验至少重复三次。

六、细胞侵袭实验

1.提前将贮存于-20℃的Matrigel基质胶置于4℃解冻，当其由凝固状态变为液态时，用预冷的无血清DMEM将Matrigel基质胶按一定比例(1:5或1:6)混合至于冰上备用；

2.取80μL稀释好的Matrigel基质胶均匀铺在Transwell小室内膜上，37℃放置约4小时，确保去凝成胶体；

3.将细胞状态良好的肝癌细胞用PBS洗3遍，胰酶消化后用无血清的DMEM培养基重悬，细胞计数并调整浓度至4.0×10⁵cell/mL，每个Transwell内室接种200μL细胞悬液，每个Transwell外室中加800μL含20～30％FBS的DMEM培养基，37℃培养；

4.根据不同细胞株运动能力的差异及实验设计目的不同，选取不同时间点取出小室；

5.取出小室后，弃去内室的残余培养基，并用棉签擦净内室滤膜上的凝胶和细胞；

6.用含0.1％结晶紫和20％甲醇的PBS对小室染色30分钟；

7.用PBS清洗小室3～5次，再用棉签擦净小室内表面和滤膜，倒置显微镜观察小室滤膜上的细胞并计数(100×倍镜下随机选择五个视野并计数)，同类实验至少重复三次。

七、动物实验

1.裸鼠肝原位成瘤模型

所用裸鼠为4～6周龄雄性裸鼠(BalB/c-nu/nu)，每个实验组8只。严格按照上海交通大学实验动物伦理委员会的规定进行裸鼠的饲养及处理等操作。每只裸鼠原位肝注入的细胞量为：24μL PBS细胞混悬液(含2×10⁶个细胞)和24μLMatrigel胶。肝原位接种完细胞后，根据裸鼠的生存状态选择合适时间点处死裸鼠，同时取其完整的肝和肺，拍照后取肝肿瘤组织计算体积，然后放入含4％甲醛的PBS中固定2～3天后，送至蓝点生物公司进行石蜡切片，每个肝肿瘤样本连续切12张切片(2张进行苏木精伊红HE染色和10张白片)，每个肺样本连续切30张切片进行HE染色，同时每组选取肺转移灶个数多的2个样本切10张白片；HE染色切片进行显微镜拍照以及转移灶个数统计。白片根据实验设计后续进行相应分子的免疫组化染色。肺转移灶的统计方法：每个肺转移灶个数为任意10张HE切片转移灶个数的总和。

2.裸鼠尾静脉注射转移模型

所用裸鼠为4～6周龄雄性裸鼠(BalB/c-nu/nu)，每个实验组8只。严格按照上海交通大学实验动物伦理委员会的规定进行裸鼠的饲养及处理等操作。每只裸鼠尾静脉注射的细胞量为：200μL PBS细胞混悬液(含2×10⁶个细胞)。尾静脉接种完肿瘤细胞后，腹腔注射CsA药物(20mg/kg)，根据裸鼠的生存状态选择合适时间点处死裸鼠，取其肺，经拍照后，放入含4％甲醛的PBS中固定2～3天，然后送至蓝点生物公司进行石蜡切片。每个肺组织样本连续切30张切片进行HE染色，同时每个样本切10张白片。HE染色切片进行组织病理学观测拍照并统计转移灶个数。白片根据实验设计后续进行相应分子的免疫组化染色。肺转移灶个数的统计方法：每个肺转移灶个数为任意10张HE切片转移灶个数的总和。

3.裸鼠皮下成瘤治疗模型

所用裸鼠为4～6周龄雄性裸鼠(BalB/c-nu/nu)，每个实验组8只。严格按照上海交通大学实验动物伦理委员会的规定进行裸鼠的饲养及处理等操作。每只裸鼠侧背部皮下注射的细胞量为：200μL PBS细胞混悬液(含4×10⁶个细胞)。以瘤体直径超过0.5cm为成瘤标准，l周左右成瘤，成瘤率为100％(24/24)。将荷瘤裸鼠随机分为3组，每组8只，进行瘤体内给药，(1)治疗组：注射pWPXL-RCAN1.4治疗慢病毒50μL(6×10⁸TU/mL)；(2)阴性对照组：注射pWPXL-Vector对照慢病毒50μL(6×10⁸TU/mL)；(3)空白对照组：注射PBS 50μL。每2天测量荷瘤裸鼠体重和肿瘤体积。

八、RCAN1.4表达受干扰的肝癌细胞株的构建

1、shRNA慢病毒载体的构建

根据RCAN1.4mRNA的序列设计针对RCAN1.4的特异性shRNA序列(两端分别带BamHI和EcoRI两个酶切位点)，并由上海生工进行片段合成。利用BamHI酶和EcoRI酶分别对shRNA片段和载体pGreenPuro(System Biosciences，CA)进行双酶切。酶切片段回收后，将RCAN1.4的shRNA靶向序列以及对照的无义序列克隆到慢病毒载体pGreenPuro中，后续通过测序验证。

shRNA序列的设计及合成见表1。

RCAN1.4shRNA序列为：

正向：5’-GATCCGGCCCTTACTGCTTTATAACTTCCTGTCAGATTATAAAGCAGTAAGGGCCTTTTTG-3’(SEQ ID NO:13)；

反向：5’-AATTCAAAAAGGCCCTTACTGCTTTATAATCTGACAGGAAGTTATAAAGCAGTAAGGGCCG-3’(SEQ ID NO:14)；

对照shRNA序列为：

正向：5’-GATCCTTCTCCGAACGTGTCACGTCTTCCTGTCAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3’(SEQ ID NO:15)；

反向：5’-GTTCTCCGAACGTGTCACGTGAAGGACAGTCTACGTGACACGTTCGGAGAAAAAAACTTAA-3’(SEQ ID NO:16)。

2.shRNA慢病毒载体的包装

2).分别将2μg RCAN1.4shRNA慢病毒表达载体同5μg pPACK-GAG、2.5μg pPACK-REV、2.5μg pVSV-G包装质粒混合物混合；

3).以400μL DMEM培养基稀释质粒混合物，混匀后室温孵育15分钟；

4).以400μL DMEM培养基稀释30μL Lipofectamine 2000^TM试剂，轻轻混匀；

5).将稀释好的Lipofectamine 2000^TM试剂缓慢加入到质粒/DMEM混合液中，轻轻混匀，室温孵育15分钟；

6).同时用DMEM培养基洗293T细胞1～2次，然后加入9mL无抗生素含2％FBS的DMEM培养基；

7).将质粒/Lipofectamine 2000^TM混合物加至293T细胞，CO₂培养箱中37℃培养；

8).6～8h后，弃去培养基，加入10mL含2％FBS且含抗生素的DMEM培养基；

9).继续培养48小时后，以Millex-HV 0.45μm的PVDF滤膜过滤，收取病毒-80℃保存。

3.慢病毒感染

1).病毒转染前，将生长状态良好的Huh7和SMMC7721细胞分别接种到6孔板中(4×10⁵个/孔)，加2mL含有10％FBS和抗生素的DMEM培养基置于CO₂培养箱中37℃培养过夜；

3).孵育2小时后，加入2～4×10⁶单位病毒；

5).培养48小时后，荧光显微镜观察绿色荧光，确定细胞感染效率。后续通过Real-time PCR和Western Blots方法验证干扰效果。

6).构建完成的稳定细胞株将其分别命名为：Huh7-shRCAN1.4(干扰)和Huh7-shNC(对照)，SMMC7721-shRCAN1.4(干扰)和SMMC7721-shNC(对照)。

II.实施例

实施例1、肿瘤组织中RCAN1.4的表达水平显著下调

在哺乳动物组织中存在3种RCAN1的可检测选择剪接体(RCAN1.1、RCAN1.2和RCAN1.4)。通过对东方肝胆医院收集的108对肝癌组织(Cancerous tissues from humanhepatocellular carcinomas，简称C)及配对癌旁肝组织(Non-cancerous liver tissues，简称N)进行定量PCR检测，结果发现：剪接体RCAN1.1和RCAN1.2mRNA在肝癌组织及配对癌旁肝组织中的表达水平都极低，且无统计学差异(图1，A)；RCAN1.4mRNA在癌旁肝组织中的表达水平很高，而在配对肝癌组织样本中显著表达下调(图1，A)，最低下调倍数有约20倍(图1，B)，其中表达下调1.5倍以上的病例数占88.9％(96/108)(图1，B)。

以上结果证明，RCAN1.4在绝大多数肝癌患者的肿瘤组织中的表达水平会发生显著下调。

实施例2、提高RCAN1.4表达可抑制肝癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭

为了研究RCAN1.4对肝癌细胞体外功能的影响，本发明人在肝癌细胞中利用慢病毒转染构建RCAN1.4过表达稳转细胞及其对照细胞(MHCC97H和HCCLM3)，并检测肝癌细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的变化。

CCK-8实验结果显示：过表达RCAN1.4后，肝癌细胞的增殖能力显著降低(图2，A)。

细胞迁移实验结果显示，过表达RCAN1.4后，肝癌细胞的迁移能力显著降低(图2，B)。

Matrigel细胞侵袭实验结果显示，过表达RCAN1.4后，肝癌细胞的侵袭能力显著降低(图2，C)。

以上结果证实，在细胞水平上，提高RCAN1.4的表达可抑制肝癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力。

实施例3、过表达RCAN1.4可以有效抑制肝癌的进展

为了研究RCAN1.4对肝癌细胞体内生长和转移的影响，本发明人在肝癌细胞中利用慢病毒转染构建RCAN1.4过表达稳转细胞及其对照细胞(MHCC97H和HCCLM3)，并建立裸鼠肝原位成瘤模型。

在裸鼠肝原位成瘤模型中，肝原位接种过表达RCAN1.4的肝癌细胞(MHCC97H-RCAN1.4和HCCLM3-RCAN1.4)及其对照细胞(MHCC97H-Vector和HCCLM3-Vector)，饲养一定时间后，取裸鼠原位肝肿瘤，计算各组肝肿瘤体积，同时对各组肺组织进行HE染色统计肺转移灶数量。

结果显示，接种过表达RCAN1.4肝癌细胞组的裸鼠的肝原位肿瘤体积显著减小(图3A)、肺转移灶数目显著少于对照组(图3B)。

以上结果证实，RCAN1.4可以有效抑制肝癌的进展，起到肿瘤治疗作用。

实施例4、RCAN1.4功能类似药物的药物有效性

在免疫细胞和血管内皮细胞中，RCAN1.4主要通过抑制钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)发挥作用。利用细胞钙调磷酸酶活性检测试剂盒(Enzo Life Science，BML-AK816)，本发明人研究了RCAN1.4对肝癌细胞CaN磷酸酶活性的影响。结果发现，过表达RCAN1.4显著抑制肝癌细胞中CaN磷酸酶活性(图4A)。

环孢菌素A(CyclosporineA，CsA)也可以抑制CaN的磷酸酶活性，其RCAN1.4具有类似的功能，为RCAN1.4的功能类似物。为了研究CsA是否具有肝癌治疗作用，特别是针对低表达RCAN1.4或高度激活CaN磷酸酶活性的肝癌，本发明人通过尾静脉将稳定干扰了RCAN1.4表达的肝癌细胞株(SMMC7721-shRCAN1.4和Huh7-shRCAN1.4)注射到裸鼠尾静脉，然后通过腹腔注射CsA药物(20mg/kg)，饲养一定时候后处死裸鼠，取各组裸鼠肺组织进行H&E染色，统计分析肺转移灶数目。结果发现，CsA药物治疗对照组肝癌细胞株(高表达RCAN1.4)，没有显著的抑制肝癌转移的治疗效果；而当CsA药物治疗稳定干扰了RCAN1.4表达的肝癌细胞株(低表达RCAN1.4)，具有显著的抑制肝癌细胞转移的治疗效果(图4B)。

以上结果证实，CaN磷酸酶抑制剂CsA对低表达RCAN1.4或具有高CaN磷酸酶活性的肝癌患者具有治疗效果。

在裸鼠皮下成瘤治疗实验中，本发明人观察到RCAN1.4慢病毒治疗组裸鼠的肿瘤体积较对照病毒组和空白对照组显著缩小约55％，提示RCAN1.4慢病毒治疗药物对肝癌具有治疗效果。

实施例5、药物筛选

选择细胞筛选模型：肝细胞，其表达RCAN1.4。

测试组：用候选物质处理的上述细胞的培养物；

对照组：不用候选物质处理的上述细胞的培养物。

在处理后适当时间，采用常规方法测定所述细胞的RCAN1.4蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况。如果与对照组相比，测试组中的RCAN1.4蛋白的表达、活性、存在量或分泌显著上升2倍以上，则说明该候选物质是潜在的抑制肝癌的物质。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市肿瘤研究所

<120> 钙调磷酸酶调节蛋白1.4或其类似物在制备抑制肝癌的药物中的应用

<130> 172807

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 594

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

atgcatttta gaaactttaa ctacagtttt agctccctga ttgcctgtgt ggcaaacagt 60

gatatcttca gcgaaagtga aaccagggcc aaatttgagt ccctctttag gacgtatgac 120

aaggacatca cctttcagta ttttaagagc ttcaaacgag tcagaataaa cttcagcaac 180

cccttctccg cagcagatgc caggctccag ctgcataaga ctgagtttct gggaaaggaa 240

atgaagttat attttgctca gaccttacac ataggaagct cacacctggc tccgccaaat 300

ccagacaagc agtttctgat ctcccctccc gcctctccgc cagtgggatg gaaacaagtg 360

gaagatgcga ccccagtcat aaactatgat ctcttatatg ccatctccaa gctggggcca 420

ggggaaaagt atgaattgca cgcagcgact gacaccactc ccagcgtggt ggtccatgta 480

tgtgagagtg atcaagagaa ggaggaagaa gaggaaatgg aaagaatgag gagacctaag 540

ccaaaaatta tccagaccag gaggccggag tacacgccga tccacctcag ctga 594

<210> 2

<211> 197

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met His Phe Arg Asn Phe Asn Tyr Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ala Cys

1 5 10 15

Val Ala Asn Ser Asp Ile Phe Ser Glu Ser Glu Thr Arg Ala Lys Phe

20 25 30

Glu Ser Leu Phe Arg Thr Tyr Asp Lys Asp Ile Thr Phe Gln Tyr Phe

35 40 45

Lys Ser Phe Lys Arg Val Arg Ile Asn Phe Ser Asn Pro Phe Ser Ala

50 55 60

Ala Asp Ala Arg Leu Gln Leu His Lys Thr Glu Phe Leu Gly Lys Glu

65 70 75 80

Met Lys Leu Tyr Phe Ala Gln Thr Leu His Ile Gly Ser Ser His Leu

85 90 95

Ala Pro Pro Asn Pro Asp Lys Gln Phe Leu Ile Ser Pro Pro Ala Ser

100 105 110

Pro Pro Val Gly Trp Lys Gln Val Glu Asp Ala Thr Pro Val Ile Asn

115 120 125

Tyr Asp Leu Leu Tyr Ala Ile Ser Lys Leu Gly Pro Gly Glu Lys Tyr

130 135 140

Glu Leu His Ala Ala Thr Asp Thr Thr Pro Ser Val Val Val His Val

145 150 155 160

Cys Glu Ser Asp Gln Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Met Glu Arg Met

165 170 175

Arg Arg Pro Lys Pro Lys Ile Ile Gln Thr Arg Arg Pro Glu Tyr Thr

180 185 190

Pro Ile His Leu Ser

195

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 3

tggagcttca ttgactgcga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

acgtcctaaa gagggactca 20

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 5

ggcgacgtga ctcagtgttc 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 6

ggtgatgtcc ttgtcatacg tc 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 7

tttagctccc tgattgcctg t 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 8

aaaggtgatg tccttgtcat acg 23

<210> 9

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<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 9

ttgttacagg aagtcccttg cc 22

<210> 10

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<223> 引物

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atgctatcac ctcccctgtg tg 22

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<223> 引物

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gccgtttaaa catgcatttt agaaactt 28

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<223> 引物

<400> 12

cgggaattct cagctgaggt gg 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 13

gatccggccc ttactgcttt ataacttcct gtcagattat aaagcagtaa gggccttttt 60

g 61

<210> 14

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

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aattcaaaaa ggcccttact gctttataat ctgacaggaa gttataaagc agtaagggcc 60

g 61

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<213> 人工序列

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gatccttctc cgaacgtgtc acgtcttcct gtcagaacgt gacacgttcg gagaattttt 60

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<213> 人工序列

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<223> 引物

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gttctccgaa cgtgtcacgt gaaggacagt ctacgtgaca cgttcggaga aaaaaactta 60

a 61

Claims

1.一种钙调磷酸酶调节蛋白1.4或其上调剂的用途，用于制备抑制肝癌的组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝癌是钙调磷酸酶调节蛋白1.4低表达的肝癌；或所述的肝癌是钙调神经磷酸酶/底物蛋白T细胞核因子1信号通路激活的肝癌。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的钙调磷酸酶调节蛋白1.4的上调剂包括：钙调磷酸酶调节蛋白1.4的表达载体。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的表达载体包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的表达载体包括：慢病毒载体，腺病毒载体。

5.钙调磷酸酶调节蛋白1.4的功能类似物的用途，用于制备抑制肝癌的组合物。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的钙调磷酸酶调节蛋白1.4的功能类似物包括：CaN外源性抑制剂环孢菌素A，FK506，匹美莫司。

7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的肝癌是钙调磷酸酶调节蛋白1.4低表达的肝癌；或所述的肝癌是钙调神经磷酸酶/底物蛋白T细胞核因子1信号通路激活的肝癌。

8.一种用于抑制肝癌的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中包括：

钙调磷酸酶调节蛋白1.4或其上调剂，或钙调磷酸酶调节蛋白1.4的功能类似物；和

药学上可接受的载体。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的钙调磷酸酶调节蛋白1.4的上调剂包括：钙调磷酸酶调节蛋白1.4的表达载体；或

所述的钙调磷酸酶调节蛋白1.4的功能类似物包括：环孢菌素A，FK506，匹美莫司。

10.一种筛选用于抑制肝癌的潜在物质的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)将候选物质与表达钙调磷酸酶调节蛋白1.4的体系接触；

(2)检测候选物质对钙调磷酸酶调节蛋白1.4的影响；

若所述候选物质可提高钙调磷酸酶调节蛋白1.4的表达、活性，则表明该候选物质是可用于抑制肝癌的潜在物质。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达钙调磷酸酶调节蛋白1.4的体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中钙调磷酸酶调节蛋白1.4的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达钙调磷酸酶调节蛋白1.4的体系；

如果测试组中钙调磷酸酶调节蛋白1.4的表达、活性在统计学上高于对照组，就表明该候选物质是可用于抑制肝癌的潜在物质。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。