CN111973594A - 他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组织再生技术领域，具体涉及一种他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途。在本发明的斑马鱼尾鳍切除实验中，加入他克莫司能够重启不可再生的远端尾鳍组织再生。本发明首次发现他克莫司能够抑制钙调磷酸酶的活性，首次发现他克莫司具有启动不可再生的组织实现组织再生的新用途，开拓了他克莫司的应用领域，具有重要应用价值。

Description

他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途
技术领域
本发明属于组织再生技术领域，具体涉及一种他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途。
背景技术
再生指对损失的身体部分进行重建，以恢复其质量和功能的过程。不同动物的再生能力是不同的，这是动物长期进化过程形成的。一般来说，低等动物的组织再生能力比高等动物更强。比如涡虫可以切割成多段后，身体部位再生的独特能力，这些部位包括头部和大脑，每段都可再生成一个新的个体。蝾螈的四肢，斑马鱼尾鳍及各种组织器官部分切除后仍可再生，然而人类的组织再生能力极其有限，只能小伤口(皮肤或腺体等)损伤才可再生，较大面积的组织器官(四肢、心脏、头部等)损伤无法再生。
他克莫司(FK506)，商品名为普乐可复。它是日本藤泽药品工业株式会社从链霉菌属中分离出来的大环内酯类抗生素。在水溶液中极其不稳定，能迅速降解，在人体内的半衰期为10.7h。外科移植、移植物抗宿主病以及自身免疫疾病治疗中经常会出现免疫排斥反应，而FK506广泛的用于减少或阻断这些排斥反应。目前其主要应用于：1、抑制器官移植排斥反应的作用；2、促进神经再生；3、神经保护作用。然而，他克莫司在重启不可再生组织再生的应用并未发现。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途。
本发明的目的是提供一种他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，
优选的，上述他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，所述组织为斑马鱼远端尾鳍组织。
优选的，上述他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，他克莫司用于制备斑马鱼远端尾鳍组织再生剂。
优选的，上述他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，他克莫司用于制备钙调磷酸酶的活性抑制剂。
优选的，上述他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，将他克莫司溶于二甲亚砜中，制成能够重启组织再生或者抑制钙调磷酸酶的药剂。
优选的，上述他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，他克莫司的储存母液浓度为20mM，使用浓度为3μM。
优选的，上述他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，将他克莫司加入到斑马鱼的养殖液中。
与现有技术相比，本发明提供的他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，具有以下有益效果：
钙调磷酸酶是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，也是斑马鱼鳍成比例生长的已知调节因子。钙调磷酸酶的低活性水平与鳍再生率高相对应，钙调磷酸酶抑制通过促进维甲酸(RA)信号改变鳍位置信息，增强鳍再生。有证据表明钙调磷酸酶能够调节协调生长。本发明发现他克莫司能够抑制钙调磷酸酶的活性，具有启动不可再生的组织实现组织再生的新用途，开拓了他克莫司的应用领域，具有重要应用价值。在本发明的斑马鱼尾鳍切除实验中，加入他克莫司能够重启不可再生的远端尾鳍组织再生。
附图说明
图1为对照组和他克莫司处理组的近、远端组织再生情况；
图1A-C分别是对照组伤口模型构建后第1、3、5天的斑马鱼尾鳍组织；
图1D-F分别是他克莫司处理组伤口模型构建后第1、3、5天的斑马鱼尾鳍组织；
图2为对照组钙调磷酸酶的活性检测情况；
图3为他克莫司处理组钙调磷酸酶的活性检测情况。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1斑马鱼远端尾鳍组织再生实验
1、实验鱼系及养殖方法：实验用鱼为野生型(AB)鱼，它们保存在流动水箱中，温度为28±0.5℃，pH＝7±0.5，养殖水电导率为450±50S/m；光周期为14h光照-10h黑暗。每天三次喂食新鲜沙虫。饲养按照中华人民共和国科学技术部实验动物培养指导原则(2006)，在标准实验室条件下饲养所有鱼。
2、伤口模型构建：成年斑马鱼在添加三卡因的麻醉剂中轻度麻醉，置于1.5g/100mL琼脂糖槽中。使用手术刀片在尾鳍面上挖除一个长2-3个骨节、宽两根鳍条的组织，尾鳍面上露出一个孔，形成一个含有近端的伤口和远端的伤口的受损组织。每天去除近端的再生组织，以防止孔被填充。使用蔡司Discovery V20显微镜(Carl Zeiss，Germany)对尾鳍再生情况进行成像记录。
3、他克莫司(FK506)处理
他克莫司(质量纯度:99.93％)购自MCE(MedChemExpress，USA)，使用二甲亚砜(DMSO)配成20mM的母液，存储在-40℃冰箱。
他克莫司处理组：在养殖液中加入20mM的他克莫司储存母液，配制成含3μM他克莫司的养殖液，处理10条斑马鱼，每隔一天更换一次养殖液。
对照组：使用含有体积分数0.015％二甲亚砜的养殖液，处理10条斑马鱼，每隔一天更换一次养殖液。对照组和他克莫司处理组养殖液除二甲亚砜和他克莫司外的其他成分相同。
4、钙调磷酸酶活性测定：分别收集对照组(二甲亚砜处理)和他克莫司处理组斑马鱼的近端组织和远端组织，共计40个样本，按照考马斯亮蓝法试剂盒检测蛋白浓度；采用钙调磷酸酶检测试剂盒(ENZO，BML-AK804，USA)检测钙调磷酸酶活性，试剂盒包括钙调磷酸酶、钙调蛋白和磷酸化RII肽底物。除去样品中的游离磷酸盐后，加入磷酸化RII肽，并将样品在30℃下孵育30min。孵育后，加入磷酸盐指示剂孔雀绿，并在
Figure BDA0002694731260000041
iD3多模式酶标仪(Molecular Devices，USA)上测定样品中的游离磷酸盐量。将钙调磷酸酶活性归一化至总蛋白浓度。
5、结果
(1)图1是对照组和他克莫司处理组的近、远端组织再生情况。在正常情况下(对照组)，组织只能在近端伤口生长，而始终不能在远端伤口生长，参见图1A-C。图1B表示切除尾鳍组织后第2天除去近端再生组织不彻底时，第3天近端伤口可长出许多新生组织。图1D-F加入他克莫司后，不可再生的远端组织再生出组织，说明他克莫司处理后重启远端组织再生。
(2)图2是对照组钙调磷酸酶的活性检测情况，图3是他克莫司处理组钙调磷酸酶的活性检测情况。结果显示，正常再生的尾鳍中，远端组织的钙调磷酸酶的活性高于近端组织。加入他克莫司后，重启再生的组织中(FK506实验组)，其钙调磷酸酶的活性低于正常情况下不可再生组织(DMSO对照组)的活性，显著性分析：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，平均值±标准差。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，其特征在于，所述组织为斑马鱼远端尾鳍组织。
3.根据权利要求2所述的他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，其特征在于，他克莫司用于制备斑马鱼远端尾鳍组织再生剂。
4.根据权利要求1所述的他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，其特征在于，他克莫司用于制备钙调磷酸酶活性抑制剂。
5.根据权利要求3或4所述的他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，其特征在于，将他克莫司溶于二甲亚砜中，制成液体药剂。
6.根据权利要求5所述的他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，其特征在于，他克莫司的储存母液浓度为20mM，使用浓度为3μM。
7.根据权利要求6所述的他克莫司在制备重启组织再生功能的药剂中的用途，其特征在于，将他克莫司加入到斑马鱼的养殖液中。
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