CN113811322A

CN113811322A - Ntcp抑制剂在预防和治疗肝癌发生中的用途

Info

Publication number: CN113811322A
Application number: CN201980095774.8A
Authority: CN
Inventors: 毛峰峰; 周忠敏; 刘阳; 赵汗青; 隋建华; 李文辉
Original assignee: National Institute of Biological Sciences Beijin
Current assignee: National Institute of Biological Sciences Beijin
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2021-12-17
Also published as: WO2020215267A1

Abstract

本发明提供了NTCP抑制剂在预防和/或治疗肝癌发生中的用途。所述肝癌发生可由HBV和/或HDV感染、脂肪性肝病或化学品诱导。所述肝癌发生可能发生在男性中。在某些情况下，所述NTCP抑制剂下调或抑制NTCP的表达。在其他情况下，所述NTCP抑制剂调节NTCP的功能，优选地抑制NTCP的功能或使NTCP功能异常。优选地，所述NTCP抑制剂是环孢菌素A，或包含至少一种具有式I的结构的化合物，或其药学上可接受的盐。

Description

NTCP抑制剂在预防和治疗肝癌发生中的用途

背景技术

牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP，SLC10A1)是一种肝脏特异性胆汁酸(BA)转运蛋白。在生理上，NTCP作为结合型BA从肝窦进入肝细胞的主要摄取转运蛋白，在维持BA的稳态方面发挥着关键作用。我们以前证实了NTCP也充当乙型肝炎病毒(HBV)及其卫星病毒，丁型肝炎病毒(HDV)的功能性细胞受体。已知携带SLC10A1变体等位基因(纯合的R252H或S267F突变)的人表现出极高水平的血浆BA，但这些个体不表现出任何明显的临床症状。一致的是，在小鼠中，Ntcp缺陷(Slc10a1^-/-)不引起明显的异常，但在一部分(～40％)突变小鼠中引起高胆汁酸血症。

来自于几项先前研究的结果表明，升高的BA浓度可能促进HCC。具体来说，已证实在野生型(WT)C57BL/6小鼠中，提高血清中BA水平的处理(0.2％胆酸)导致诱导的肝肿瘤的数目和尺寸增加三倍(二乙基亚硝胺(DEN)诱导模型)；并且其他研究显示，在血清中具有长期高水平BA的法尼酯X受体(FXR)缺陷(Fxr^-/-)小鼠可以自发地发展出肝肿瘤。此外，在大多数人类HCC中NTCP表达降低，与NTCP在肝癌发生中的作用相一致。然而，尚不清楚由Ntcp缺陷或可能由NTCP蛋白的某些其他功能引起的长期高水平的结合型BA是否可以促进HCC的发生。

发明内容

本发明提供了NTCP抑制剂在预防和/或治疗肝癌发生(hepatocarcinogenesis)中的用途。肝癌，也被称为肝脏癌症或原发性肝脏癌症，是始于肝脏的癌症。最常见的肝癌类型是肝癌发生或肝细胞癌(HCC)，占到病例的80％。导致肝癌的主要原因是由乙型肝炎、丙型肝炎或酒精造成的肝硬化。其他原因包括黄曲霉毒素、非酒精性脂肪性肝病和肝吸虫。不太常见的类型包括黏液性囊性肿瘤和导管内乳头状胆管肿瘤。男性比女性更容易受到HCC影响。

肝癌发生是由HBV和/或HDV感染诱导的。我们发现NTCP抑制剂同样阻断HBV感染，并适用于HBV阳性的妊娠女性和她们的新生儿，以预防HBV垂直传播，并且也可用于在易感人群中预防HBV水平传播。NTCP抑制剂具有低得多的制造成本，并为HBIG提供了成本效益高的替代品，用于预防肝移植后的HBV复发。我们还发现NTCP抑制剂是HBV进入的抑制剂，为慢性HBV感染提供有效治疗，并且在细胞和动物模型中也都可以高效阻断HDV感染。此外，NTCP抑制剂也可用于改善肝损伤和抑制肝脏炎症。

或者，所述肝癌发生是由脂肪性肝病，特别是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)诱导的。我们发现，NTCP抑制剂显著降低胆固醇和甘油三酯的水平。在用NTCP抑制剂治疗后，BA水平(以及某些BA种类的比例)的提高为糖尿病患者提供了益处。此外，用NTCP抑制剂对ob/ob小鼠进行处理，也使得用油红O染色检查的脂滴减少。

或者，所述肝癌发生是由化学品诱导的。使用化学试剂二乙基亚硝胺(DEN)诱导了HCC的小鼠模型，我们发现Slc10a1^-/-小鼠表现出更少的肝肿瘤，而在肝细胞中组成性地过表达小鼠NTCP的转基因小鼠经历了肿瘤负荷的增加。我们的发现表明，对NTCP功能进行药物操控可以对肝癌发生产生临床影响。

更通常地，所述肝癌发生在雄性中发生。有趣的是，除了确定长期高胆汁酸血症不促进HCC之外，我们还发现在雄性中Ntcp缺陷不影响DEN的致癌性，但在患有高胆汁酸血症的雄性小鼠中确实诱导了肝脏偏雌性基因的表达。我们还发现，在雄性中，Ntcp缺陷减少了肿瘤结节的数量，而NTCP的组成型表达在雄性和雌性中都增加了肿瘤负荷。此外，对临床数据的分析表明，这些发生显著变化的肝脏偏雌性基因的大多数人类同源物，与人类肝癌患者的预后改善相关。基于我们的发现，我们提出，对NTCP的表达水平和/或功能的操控可能是预防HCC疾病发展的一种有希望的策略。

在某些情况下，所述NTCP抑制剂直接下调或抑制NTCP的表达。在其他情况下，所述NTCP抑制剂阻断牛磺胆酸钠共转运多肽，以调节NTCP的功能，优选地抑制NTCP的功能或使NTCP功能异常。

优选地，所述NTCP抑制剂是环孢菌素A或其药学上可接受的盐。

优选地，所述NTCP抑制剂是具有下述式I的结构的化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

A是O或S；

M是任选被取代的亚甲基桥或键；

Cs是环孢菌素A；并且

R₁是任选被取代的苯基，其在邻位处独立地具有H、卤素、OH、Me或OMe，和/或在间位处独立地具有H、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或R_x，和/或在对位处独立地具有H、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或R_x；

其中R_x是选自下述的取代基：

优选地，R₁是任选被取代的苯基，其在邻位和间位处具有H，并在对位处具有H、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或R_x。

优选地，R₁是任选被取代的苯基，其在邻位和对位处具有H，并在间位处独立地具有H、卤素、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基或R_x。

优选地，M是未被取代的亚甲基桥或被甲基或苯基取代的亚甲基桥，或键。

优选地，所述NTCP抑制剂具有选自下述任一者的结构：

本发明还提供了一种预防和/或治疗肝癌发生的方法，所述方法包括向需要的人给药有效量的上述NTCP抑制剂。

具体实施方式

术语“烷基”可以是指1～18或1～12或1～6个碳原子的直链和支链饱和烃基。烷基的实例包括甲基、乙基、1-丙基或正丙基(“n-Pr”)、2-丙基或异丙基(“i-Pr”)、1-丁基或正丁基(“n-Bu”)、2-甲基-1-丙基或异丁基(“i-Bu”)、1-甲基丙基或仲丁基("s-Bu")和1,1-二甲基乙基或叔丁基(“t-Bu”)。烷基的其他实例包括1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基和3,3-二甲基-2-丁基。

术语“卤素”可以是指F、Cl、Br或I。

术语“药学上可接受的盐”包括，但不限于：与无机酸的盐，例如选自盐酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、亚磺酸盐和硝酸盐；以及，与有机酸的盐，例如选自苹果酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、烷酸盐例如乙酸盐和与HOOC-(CH₂)n-COOH的盐，其中n选自0至4。类似地，药学上可接受的阳离子的实例包括，但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。

术语“治疗”是指，向被认为有需要的对象给药至少一种化合物和/或其至少一种立体异构体和/或其至少一种药学上可接受的盐。

术语“有效量”是指，至少一种化合物和/或其至少一种立体异构体和/或其至少一种药学上可接受的盐的在对象中有效“治疗”疾病或障碍的量，并且所述量将在某种显著程度上引发组织、系统、动物或人类的所寻求的生物学或医学反应，例如在给药时，足以阻止待治疗的病症或障碍的一种或多种症状的发展，或在某种程度上缓解所述一种或多种症状。治疗有效量将随着化合物、疾病及其严重程度和待治疗的哺乳动物的年龄、体重等的变化而变化。

所述主题化合物及其立体异构体及其药学上可接受的盐可以单独地或与至少一种其他治疗剂相组合用于治疗。在某些实施方式中，所述化合物、其立体异构体及其药学上可接受的盐可以与至少一种另外的治疗剂组合使用。本文公开的化合物和/或一种药学上可接受的盐，可以与所述至少一种其他治疗剂在单一剂型中或作为分开的剂型给药。当作为分开的剂型给药时，所述至少一种其他治疗剂可以在本文公开的化合物和/或一种药学上可接受的盐给药之前、同时或之后给药。

所述主题化合物可以本身使用，或者可以以其药学上可接受的盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、三氟乙酸盐等的形式使用。当化合物含有相对酸性的官能团时，盐可以通过添加所需碱(纯净的或在适合的惰性溶剂中)来获得。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机胺盐或镁盐等。当化合物含有相对碱性的官能团时，盐可以通过添加所需酸(纯净的或在适合的惰性溶剂中)来获得。药学上可接受的酸加成盐的实例包括：源自于无机酸的盐，其中无机酸例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等的盐；以及，源自于相对无毒的有机酸的盐，其中有机酸例如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、延胡索酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。还包括氨基酸的盐(例如精氨酸盐等)，以及有机酸(例如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等)的盐。

附图说明

图1.CsA抑制HBV感染。

图2.CsA抑制HBV和HDV的时间进程。

图3.CsA抑制HDV感染。

图4.CsA抑制HBV与靶细胞的结合。

图5.CsA抑制HepG2-NTCP细胞对[³H]-TC的摄取。

图6.CsA-1抑制HBV感染的时间进程。

图7.CsA和CsA-1的抗HBV活性的比较。

图8.CsA类似物抑制HBV感染。

图9.CsA-055的IC₅₀的确定。

图10.CsA-055抑制HepG2-NTCP对[³H]-TC的摄取。

图11.CsA抑制NTCP的转运活性。

图12.CsA和CsA-055对T细胞增殖的影响。

图13.CsA-055在hNTCP小鼠中阻断HDV感染。

图14.CsA-055在MCD诱导的NASH小鼠模型中改善肝损伤。

图15.CsA-055在MCD诱导的C57BL/6小鼠的NASH模型中预防肝损伤。

图16.CsA-055在MCD诱导的NASH小鼠模型中改善肝脏炎症。

图17.在apoE^-/-小鼠中，CsA-055治疗在整个实验中降低血浆总胆固醇水平和甘油三酯水平。

图18.CsA-055治疗在ob/ob小鼠中改善葡萄糖代谢。

图19.在ob/ob小鼠中，在2周CsA-055治疗后，CsA-055治疗阻止肝脏中的脂肪积累。

图20.CsA-055治疗改善肝癌发生。

图21.小鼠中NTCP的发育性表达。

图22.DEN诱导的Slc10a1^-/-小鼠表现出降低的肝肿瘤发展，其与血清TBA水平反相关。

图23.在DEN暴露后40周，WT小鼠的肝脏中，肿瘤与非肿瘤组织相比NTCP表达降低的代表性图。

图24.在雄性Slc10a1^-/-小鼠中，Ntcp缺陷不影响DEN致癌性。

图25.在雌性Slc10a1^-/-小鼠中，Ntcp缺陷不影响DEN致癌性。

图26.在患有高胆汁酸血症的雄性小鼠中，Ntcp缺陷扰乱多条代谢通路并导致偏雌性基因的表达。

图27.在雄性和雌性小鼠中，NTCP的组成性表达均加速DEN诱导的肝癌发生。

实施例

本文中的实施例仅仅是提供用于说明而不是限制的目的。本领域技术人员将会容易地认识到，各种不同的非关键性参数可以被改变或修改以产生基本上相似的结果。

应该理解，本文中描述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员将根据其提出各种不同的修改或改变，它们将被包括在本申请的精神和范围以及随附的权利要求书的范围之内。本文中引用的所有出版物、专利和专利申请为所有目的通过引用整体并入本文。

实施例1.NTCP抑制剂抑制HBV和/或HDV感染

(1)CsA抑制HBV感染。我们在HBV易感的原代肝细胞和肝细胞瘤细胞系的基础上建立了4种体外HBV感染系统，这些HBV易感的原代肝细胞和肝细胞瘤细胞系是原代树鼩肝细胞(PTH)、原代人肝细胞(PHH)、人肝细胞瘤细胞系HepaRG和HepG2-NTCP。

HBV和HDV感染测定在96孔板中进行。简单来说，将PHH、PTH和HepG2-NTCP细胞，在PMM中培养24小时，以诱导NTCP表达。从转染的Huh-7细胞的培养基，收获HBV和HDV病毒。为了用病毒感染细胞，将所述含病毒的培养基与终浓度为5％的PEG混合，然后与DMSO或待测试的化合物混合。然后将所述混合物施加到细胞，在37℃下保持24小时。然后除去病毒，并且每两天向所述细胞添加新鲜培养基。收集来自于dpi3-dpi5的培养基，用于通过商购ELISA试剂盒，按照制造商的指导进行HBeAg和HBsAg测定。

我们首先在PTH上发现，当将CsA添加到HBV感染系统中时，HBV感染受到阻碍，并且感染活性是剂量依赖性的。后来，我们还发现，CsA可以剂量依赖性地抑制HBV对PHH和HepaRG细胞系的感染。

结果示出在图1中。PTH培养方法和HBV感染程序遵照以前的报道来进行。简单来说，将不同浓度的CsA与HBV病毒混合，在4℃孵育2～4小时，然后将病毒施加到细胞培养物中。在37℃孵育16～20h后，除去感染物，将细胞清洗3次，然后在新鲜培养基中培养。细胞在37℃下培养，并且每2～3天收获并更换培养基。通过在感染后第7天，使用HBeAg ELISA试剂盒(Wantai.Inc)检查培养基中的HBeAg，来评估PTH感染水平。通过在感染后第11天，使用HBsAg ELISA试剂盒(Wantai.Inc)检查培养基中的HBsAg，来评估HepaRG感染水平。

(2)CsA在进入水平上阻断HBV感染。比较了CsA(2μM)在不同时间窗口抑制HBV感染的效果，我们发现只有在病毒和细胞孵育时添加CsA的情况下，CsA才显著抑制感染，而如果在病毒接种前或感染后用CsA处理细胞，则CsA不是非常有效。这个结果表明CsA在早期阶段，可能是在进入水平上抑制HBV感染。

结果示出在图2中。用HBV攻击PTH和HepaRG细胞。接种时间被定义为时间＝0h，在所指示的不同时间窗口，将CsA(2μM)添加到细胞培养物中。负值数字指示，在将病毒加载到细胞之前，将CsA预先与病毒孵育。将细胞在37℃下培养，并且每2～3天收获并更换培养基。通过在感染后第7天，使用HBeAg ELISA试剂盒(Wantai.Inc)检查培养基中的HBeAg，来评估PTH感染水平。通过在感染后第11天，使用HBsAg ELISA试剂盒(Wantai.Inc)检查培养基中的HBsAg，来评估HepaRG感染水平。

丁型肝炎病毒具有与HBV相同的包膜蛋白，并且HDV的进入步骤反映了HBV的进入步骤。我们对小鼠进行了HDV感染，并且进行了HDV RNA测定的量化。C57-hNTCP小鼠腹膜内(i.p.)注射了30mg/kg CsA类似物或溶媒，持续2天。在第二次注射后2小时，进行HDV攻击。在病毒攻击后6天将小鼠处死，然后解剖出肝脏并进行裂解，用于RNA提取。通过qPCR，来确定HDV RNA和NTCP RNA表达水平，使用GAPDH作为参比。也使用标准曲线，来计算HDV RNA和NTCP RNA的拷贝数。

我们发现，CsA也可以以剂量依赖性方式抑制HDV感染，结果示出在图3中。HDV感染测定按照以前的报道进行。将CsA以与图1相同的程序施加到细胞。在感染后第7天收获细胞，并通过定量PCR检查总HDV的RNA。

(3)CsA干扰HBV与靶细胞的结合。我们比较了几种HBV进入抑制剂(包括17B9、2D3和Myr-59)和CsA对HBV与细胞结合的影响。17B9和2D3是特异性识别HBV表面蛋白的N端(分别识别S区和前S1区)的单克隆抗体。Myr-59是由肉豆蔻酰化的，来自于HBV大蛋白前S1区的59个氨基酸组成的肽。结果表明，CsA可以显著抑制HBV与靶细胞之间的结合，并且所述抑制是剂量依赖性的。

结果示出在图4中。将病毒与CsA和其他抑制剂混合，并在4℃孵育2～4小时。然后将病毒施加到细胞，在37℃孵育4小时，然后除去病毒。然后将细胞用PBS清洗5次，然后裂解并提取DNA。HBV基因组DNA通过q-PCR来定量，使用GAPDH作为参比。将未处理组的HBV基因组DNA的量定义为100％，以计算其他组的相对结合。每种抑制剂的终浓度如下：CsA：10μM；17B9：对于PTH为50μg/ml，对于HepaRG为5μg/ml；2D3：对于PTH为50μg/ml，对于HepaRG为5μg/ml；Myr-59：200nM。

(4)CsA抑制HBV受体NTCP的转运活性。NTCP是人类肝细胞的HBV和HDV感染的功能性受体。NTCP是一种肝的钠/胆汁酸同向转运蛋白，据推测跨越细胞膜多达10次，并具有小的细胞外环，牛磺酸结合型胆汁酸是其天然底物。因此，我们检查了CsA是否可以干扰NTCP对[³H]标记的牛黄胆酸([³H]-TCA)的摄取。

我们进行了[³H]-TCA摄取测定。将PTH和HepG2-NTCP细胞在PMM中培养24小时，以诱导NTCP表达。在用DMSO或测试化合物处理2小时后，将细胞与溶解在Na+林格氏缓冲液(Na+的浓度为145mM)中的1μM[³H]-牛黄胆酸，在37℃孵育15分钟。随后，将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中清洗一次，并在50μL 1％TritonX-100水溶液中，在室温裂解5分钟。将裂解物全部转移到液闪96孔板中，并与200μL液闪混合液(Ultima Gold XR，PerkinElmer)混合。液闪计数在PerkinElmer 1450LSC液闪计数器上进行。

结果示出在图5中。TUDCA的终浓度为25μM。结果显示，与阳性对照牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)相比，CsA显著抑制了NTCP对[³H]-TCA的摄取，在10μM下具有高达90％的抑制效率，表明CsA抑制NTCP转运活性，从而抑制了HBV感染。

(5)CsA类似物的抗HBV活性。我们在体外感染测定法中，证实了我们的CsA类似物的抗HBV活性。结果示出在图6、图7、图8和图9中。结果表明，我们的类似物具有抗HBV活性，许多在1μM下具有高于90％的抑制率。HBV感染的时间进程曲线证实了，我们的类似物在HBV感染的早期阶段有效。此外，我们的许多抑制剂(特别是CsA-055)，在HepG2-NTCP细胞系和原代人肝细胞(PHH)感染系统中均表现出比CsA更好的抗HBV活性。

图6示出了CsA-1抑制HBV感染的时间进程。对PTH的HBV感染测定按照之前关于图2的描述来进行。CsA-1的终浓度是10μM。在感染后第7天，通过HBeAg ELISA试剂盒(WantaiInc)来检查培养基中的HBeAg水平。

图7示出了CsA和CsA-1的抗HBV活性的比较。对于HepG2-NTCP和PHH的HBV感染的测定如上文所述来进行。通过在感染后第7天，使用HBeAg ELISA试剂盒(Wantai.Inc)检查培养基中的HBeAg，来评估HepG2-NTCP感染水平。通过在感染后第11天，使用HBsAg ELISA试剂盒(Wantai.Inc)检查培养基中的HBsAg，来评估PHH感染水平。

图8显示了CsA类似物抑制HBV感染。HepG2-NTCP细胞的HBV感染测定如之前在图1中所示来进行。CsA类似物的浓度是10μM、3.3μM和1.1μM。通过在感染后第5天，使用HBeAgELISA试剂盒(Wantai.Inc)检查培养基中的HBeAg，来评估感染水平。

在图7和图8中，CsA类似物包括下述化合物：

图9示出了CsA-055的IC₅₀测定。HepG2-NTCP细胞的HBV感染测定如之前在图1中所示来进行。CsA-055的浓度是10μM、3.3μM、1.1μM、367nM、123nM和41nM。IC₅₀计算通过GraphPad Prism来进行。

(6)CsA类似物抑制HBV受体NTCP的转运活性，而不诱导NTCP内吞。我们比较了CsA和代表性类似物抑制NTCP对底物的摄取的能力。结果示出在图10中。[³H]-TCA摄取的测定如之前在图5中所示来进行。结果显示，CsA-055抑制HepG2-NTCP对[³H]-TCA的摄取，并且我们的类似物显著抑制NTCP对[³H]-TCA的摄取，具有比CsA高得多的效率。

我们还进行了其它物种测试，其表明我们的类似物不仅能够抑制人类NTCP对底物的摄取，而且能够抑制小鼠NTCP、猴NTCP和树鼩NTCP对底物的摄取，而CsA不抑制人类ASBT(SLC10家族的另一种胆汁酸转运蛋白)对[³H]-TCA的摄取。这些数据表明CsA特异性抑制NTCP的转运活性。在CsA类似物处理后，我们还使用了NTCP特异性抗体对细胞进行染色。牛磺石胆酸(TLCA)可以显著诱导NTCP内吞，因此在这里我们使用TLCA作为阳性对照。结果示出在图11中。在图中注明了NTCP抑制剂的浓度。我们的结果证实了，我们的类似物不诱导NTCP内吞。

在图11中，CsA类似物包括下述化合物：

(7)CsA类似物的免疫抑制效应。CsA作为免疫抑制药物广泛用于器官移植，以避免出现排斥。它的免疫抑制效应是基于CypA-CsA复合物与钙调磷酸酶的相互作用。这种相互作用抑制IL-2的表达，并因此抑制T细胞活化。为了确定我们的类似物是否提供它们原有的免疫抑制潜力，我们进行了体外T细胞活化测定。简单来说，从成年C57BL/6小鼠分离脾脏T细胞，并将其培养在RPMI-1640完全培养基(Thermo Fisher)中。遵照制造商的指导，用CFSE(Thermo Fisher)对细胞进行染色。然后将细胞在包被有抗CD3抗体的96孔板中，在类似物和DMSO对照存在下，培养72小时。通过FACS确定T细胞增殖。

CsA和CsA-055对T细胞增殖的影响的结果示出在图12中。将脾脏T细胞用CFSE(Thermo Fisher)和PE-CD4抗体(BD)染色，并通过FACS检查。N-T：无CFSE染色和无活化的对照；CFSE-T-0：无活化的对照；T-2_5：无CSFE染色的对照。结果表明，与CsA原型和DMSO对照相比，我们的类似物不显著抑制T细胞增殖。

(8)CsA类似物以比CsA原型低得多的效能抑制NFAT信号传导通路。将Jurkat细胞在RPMI-1640完全培养基(Thermo Fisher)中培养。为了进行电穿孔转染，收集细胞，并用100μL缓冲液R(Thermo Fisher)，以2×10⁷个细胞/ml的终浓度重悬浮，然后与2μg pGL3-NFAT-LUC质粒(Addgene)混合。电穿孔转染使用按照制造商的说明书的参数，通过Neon转染系统(Thermo Fisher)来进行。在电穿孔后，将细胞迅速转移到预加温的不含抗生素的RPMI1640完全培养基中。在电穿孔后24小时，将Jurkat细胞以2×10⁵个细胞/孔的浓度等分到96孔板中，然后添加10ng/ml PMA和500nM离子霉素以及测试化合物进行刺激。在48小时的刺激期后，通过离心收集细胞，然后用20μL被动(Passive)裂解缓冲液(Promega)，在摇床上，在RT裂解15mins。通过Centro LB960微孔板发光检测仪(Berthold Tech)检查萤光素酶强度。

(9)CsA类似物防止hNTCP小鼠的HDV感染。HDV侵入到肝细胞中也是NTCP介导的。表达人类NTCP的C57BL/6小鼠可以被HDV感染，并且该hNTCP-C57BL/6提供了一种病毒感染动物模型，来评估我们的CsA类似物的药物潜力。简单来说，小鼠每天注射30mg/kg的类似物和溶媒对照，注射两天，在第二次注射后2小时用5x10⁹ Geq HDV病毒攻击小鼠。在病毒攻击后6天将小鼠处死，然后解剖出肝脏并进行裂解，用于RNA提取。通过HDV基因组的q-PCR来确定感染水平。

结果示出在图13中。hNTCP小鼠腹膜内(i.p.)注射30mg/kg CsA-055或溶媒，注射2天。在第二次注射后2小时，进行HDV攻击。在病毒攻击后6天将小鼠处死，然后解剖出肝脏并进行裂解，用于RNA提取。通过q-PCR来确定HDV RNA和NTCP RNA表达水平，使用GAPDH作为参比。还使用标准曲线，来计算HDV RNA和NTCP RNA的拷贝数。结果显示，CsA-055阻断HDV感染hNTCP小鼠。这些结果表明，与溶媒相比，类似物处理显著降低了小鼠肝脏中的HDV RNA水平，而不扰乱NTCP的表达。

总的来说，实施例1显示，NTCP抑制剂(其下调/抑制NTCP的表达，或调节和抑制NTCP的功能)可以预防和治疗由HBV感染和/或HDV感染诱导的肝癌发生。

实施例2.NTCP抑制剂改善脂肪性肝病

(1)NTCP抑制剂在小鼠中改善由甲硫氨酸-胆碱缺乏性饮食诱导的肝损伤、肝脏炎症。HBV通过其受体NTCP进入肝细胞，限制了它的NTCP功能，从而促进代偿性BA合成和胆固醇供应。这个结果强调了，利用NTCP抑制对代谢益处的可能影响的重要性。在这里，我们使用我们的NTCP抑制剂，来评估它们对由甲硫氨酸-胆碱缺乏性(MCD)饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠模型的发展的预防效果和治疗潜力。在所述实验期间，我们监测了食物摄入量，并发现在MCD/介质组和MCD/类似物组之间没有差异。终点时的结果表明，使用代表性抑制剂的干预，导致血清肝功能酶ALT活性的显著降低，表明肝损伤较小。

我们评估了CsA类似物对MCD饮食诱导的NASH模型的影响。雄性野生型C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，并用于在8～10周龄时使用MCD饮食建立NASH模型。在MCD饮食诱导之前，收集血液分析肝功能。在采用MCD饮食1周后，将小鼠分成3个实验组：(1)正常饮食；(2)MCD饮食，每天一次i.p.介质(0.9％盐水)，持续4周；(3)MCD饮食，每天一次i.p.介质中的20mg/kg抑制剂，持续4周。n＝5～6/组。在实验结束时，将小鼠处死，收集血液和肝脏用于病理学评估。

结果示出在图14中。图14显示，在MCD诱导的NASH模型中，代表性抑制剂显著改善肝损伤，表明了用于NASH治疗的治疗潜力。

正如预期，血清中的总胆汁酸水平显著提高，结果示出在图15中。另外，肝脏炎症的严重程度低于MCD对照饮食相，结果示出在图16中。

图15示出了C57BL/6小鼠的血清参数。对采用MCD饮食的雄性C57BL/6小鼠，每天一次用介质或CsA-055(#55)(20mg/kg)治疗，持续4周。在实验结束时，收集血液，用于测量血清AST和ALT活性，以及血清总胆汁酸水平。N＝5～6/组。

图16示出了苏木精和曙红染色的代表性图像，箭头指示浸润淋巴细胞(10X)。n＝5～6/组。在苏木精和曙红染色中，将肝组织在4％聚甲醛中过夜固定，并用石蜡包埋。将包埋的肝组织切成5μm切片，在苏木精中染色5分钟，然后在0.3％氨水中变蓝。

(2)在喂食高脂肪(45％)饮食的apoE^-/-小鼠中，NTCP抑制剂降低血清胆固醇和甘油三酯。我们还测试了，我们的NTCP抑制剂在喂食高脂肪(45％)饮食的apoE^-/-小鼠中的效应。雄性apoE^-/-小鼠(8～10周)购自北京华阜康生物科技股份有限公司。将小鼠分成2个实验组：(1)每天一次i.p.介质(0.9％盐水)，持续共8周；或(2)每天一次i.p.介质中的20mg/kg抑制剂，持续8周。在研究期间，使用代表性抑制剂的治疗，显著降低了平均血清总胆固醇水平和甘油三酯水平。结果示出在图17中。正如预期，血清中的总胆汁酸水平显著提高。

图17显示在整个实验期间，在apoE^-/-小鼠中，CsA-055的治疗(20mg/kg，i.p.)降低了血浆总胆固醇水平和甘油三酯水平。CHO：胆固醇；TBA：总胆汁酸；TG：甘油三酯。每条线代表一只小鼠。

(3)在ob/ob小鼠中，NTCP抑制剂降低血液葡萄糖并改善脂肪肝。我们还测试了，我们的NTCP抑制剂在口服给药所述抑制剂的ob/ob小鼠中的效果。雄性ob/ob小鼠(8～10周)购自北京华阜康生物科技股份有限公司。将小鼠分成两个实验组：(1)口服饲料，持续2周；或(2)每千克饲料30mg抑制剂，持续2周。在终点时进行口服葡萄糖耐受试验(OGTT)。以2g/kg的剂量，口服给药30％蔗糖。

在用抑制剂治疗8周后，评估口服葡萄糖耐受试验(OGTT)。将雄性ob/ob小鼠禁食4～6h，并在1:30p.m进行试验。通过口服给药葡萄糖(2mg/g体重)。在葡萄糖给药后0、15、30、60和120min，从尾静脉抽取血样。使用便携式血糖仪(Accu-check Active，Roche)测量血糖水平。

OGTT的结果示出在图18中。图18显示了，在2周CsA-055治疗的ob/ob小鼠中，使用OGTT的葡萄糖水平的变化。在蔗糖给药后，在指定的时间点测量血液葡萄糖(*P<0.05；****P<0.0001)。结果证明，使用代表性抑制剂的治疗显著降低了平均血清总葡萄糖水平。

此外，油红O染色的结果示出在图19中。图19显示了，在ob/ob小鼠中，在2周的CsA-055治疗后脂肪在肝脏中的积累。与CsA-055治疗组(小鼠：6、7、8、9、10)中极小的脂质积累相比，饲料组(小鼠：1、2、3、4、5)中存在丰富的大脂滴(放大倍数×20)。结果证实，在CsA类似物治疗的ob/ob小鼠中，肝脏中的脂肪积累减少。正如预期，血清中的总胆汁酸水平显著提高。

总的来说，实施例2显示，NTCP抑制剂(其下调/抑制NTCP的表达，或调节和抑制NTCP的功能)可以预防和治疗由脂肪肝诱导、特别是由NASH诱导的肝癌发生。

实施例3.NTCP抑制剂改善肝癌发生

(1)CsA055治疗改善肝癌发生。我们用CsA055每天i.p.给药，治疗3～4月龄的C57BL/6N小鼠。剂量为20mg/kg(BW)。4个月后，将小鼠处死，以检查肝肿瘤。结果示出在图20中。箭头指示肝脏表面的肿瘤结节。图20显示，野生型发展出肉眼可见的肝肿瘤，而抑制剂CsA055治疗的小鼠未发展出肿瘤。

(2)小鼠中的NTCP表达。首先，我们使用经充分表征的NTCP单克隆抗体36C1M进行免疫荧光(IF)染色，在小鼠中表征了在肝脏发育期间NTCP的表达。在胚胎第19.5天(E19.5)，可早期检测到NTCP的膜表达(图21)。这种模式在围产期和整个成年期间得以维持。免疫反应性分布特征与已知的NTCP基底外侧定位相一致。出生后，在其基底外侧质膜上表达NTCP的肝细胞的数目急剧增加，并且到出生后第7.5天(E7.5)之前，成年表型(即，极化表达和NTCP表达水平的明显提高)明显(图21)。

图21示出了，小鼠中NTCP的发育性表达。发现阴栓的那天被定为胚胎第0.5天(简称E0.5)，并且出生那天被定为出生后第0天(简称P0)。将来自于E16.5(A)、E19.5(B)、P1.5(C)、P3.5(D)、P7.5(E)和成年WT C57BL/6J小鼠(F)的肝脏切片，用针对小鼠NTCP的单克隆抗体36C1M(红色)染色。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。到E19.5和整个围产期，直至成年，在肝细胞的基底外侧膜上出现显著的NTCP免疫反应性。还在几乎所有的细胞类型中均观察到核免疫反应性。箭头指示膜NTCP。标尺条：50μm。

(3)具有高胆汁酸血症的Slc10a1^-/-小鼠不自发发生HCC。考虑到高的血清总胆汁酸(TBA)浓度已与肝肿瘤的高风险相关联，令人吃惊的是尽管某些Slc10a1^-/-小鼠在约20月龄时表现出非常高的TBA水平，但在这些高胆汁酸血症小鼠中自发HCC发展的发生率与WT小鼠没有差异。

(4)DEN治疗的Slc10a1^-/-小鼠表现出降低的肝肿瘤发展，与血清TBA水平负相关。为了探索NTCP在肝癌发生期间的可能功能，我们使用了成熟的DEN诱导的HCC模型。我们将DEN(25mg/kg)给药到15只雄性Slc10a1^-/-小鼠和18只雄性WT小鼠(14日龄)，并检查肿瘤发展。在DEN暴露后40周，所有这些小鼠均发展出肝肿瘤。令人吃惊的是，我们注意到与WT小鼠相比，Slc10a1^-/-小鼠表现出更少的肿瘤结节，并且直径>5mm的结节的数目更低(图22A和B)。组织病理学检查鉴定出HCC是主要的肿瘤类型(图22C)。IF染色显示，在肿瘤中没有NTCP表达，与邻近非肿瘤组织中的NTCP表达形成鲜明对比(图23)。小鼠HCC中的这种NTCP表达模式，与在人类HCC中观察到的模式相似。

进一步的分析表明，在雄性Slc10a1^-/-小鼠中，在DEN暴露后40周时，肿瘤结节的数目与TBA水平负相关(图22D)。然而，在TBA水平与直径>5mm的结节的数目之间没有显著相关性。为了排除肝癌发生对HCC晚期的雄性Slc10a1^-/-小鼠血清中TBA水平的可能的影响，我们评估了，8～10周龄时血清中的TBA水平与它们在DEN给药后40周时的肿瘤负荷之间的相关性，并在斯皮尔曼(Spearman)秩和检验中，注意到8～10周龄时的TBA水平与它们在终点时的肿瘤结节数目之间的高度负相关(r＝-0.73，p＝0.03)(图22E)。此外，在雄性Slc10a1^-/-小鼠中，在8～10周龄时的TBA水平与DEN给药后40周时直径>5mm的结节数目之间没有显著相关性(图22E)。由于与雄性小鼠相比，雌性小鼠似乎不太易于发生肝肿瘤，因此我们检查了在DEN暴露后43周时雌性小鼠的肝肿瘤发病率。引人注目的是，尽管总共86％的WT雌性小鼠(14只中的12只)发生肝肿瘤，但只有33％(12只中的4只)的雌性Slc10a1^-/-小鼠发生肝肿瘤。注意到，在8～10周龄时的TBA水平与患有更严重的高胆汁酸血症的雌性Slc10a1^-/-小鼠的肿瘤负荷之间没有明显关系(图22F)。

总的来说，图22显示出，经DEN治疗的Slc10a1^-/-小鼠表现出降低的肝肿瘤发展，与血清TBA水平负相关。(A)在DEN暴露后40周，肝脏的代表性照片。(B)在DEN暴露后40周，与它们的WT对照(实心三角形，n＝18)相比，Slc10a1^-/-(空心三角形，n＝15)小鼠显示出更少的肿瘤结节和更少数量的直径>5mm的肿瘤结节。一个三角形代表一只小鼠，并且线条表示中位数值。p值在未配对双尾学生(Student’s)t检验中计算。(C)H&E染色的肝脏切片的代表性照片。T：肿瘤；NT：非肿瘤。放大倍数，×5。(D)在42周龄时，雄性Slc10a1^-/-小鼠中，血清TBA水平与结节数目和直径>5mm的结节数目之间的相关性。(E)在雄性Slc10a1^-/-小鼠中，在42周龄时的结节数目和直径>5mm的结节数目与8～10周时的初始TBA水平(空心三角形，n＝9)之间的相关性。(F)在雌性Slc10a1^-/-小鼠中，在42周龄时的结节数目和直径>5mm的结节数目与8～10周时的初始TBA水平(空心圆圈，n＝9)之间的相关性。所有相关性分析均使用Spearman相关性分析来进行，以估算相关系数值(r)。

图23示出了，在DEN暴露后40周的WT小鼠的肝脏中，与非肿瘤组织相比，肿瘤中的NTCP表达降低的代表性图。使用针对小鼠NTCP的36C1M抗体进行IF染色(红色)。细胞核被染成蓝色。标尺条：100μm。

(5)NTCP缺陷不影响DEN致癌性。为了检查Ntcp缺陷是否使得DEN代谢发生改变，因此具有不同诱导致癌性的能力，我们分析了CYP2E1(负责DEN生物活化的主要CYP)和O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT，一种DNA修复酶)的表达，已提出这两种酶在调节肝脏DEN致癌性中是重要的(9)。向14日龄的WT或Slc10a1^-/-小鼠i.p.注射DEN，并在5、24或48h后进行安乐死。除了0和24h的雄性Slc10a1^-/-小鼠和所有时间点的雌性Slc10a1^-/-小鼠，与它们的对照相比表现出明显更高的TBA水平之外，在雄性或雌性Slc10a1^-/-小鼠中没有明显的肝损伤(图24A和B，图25A和B)。通过qPCR，分析了在所有时间点肝脏的Cyp2e1和Mgmt的mRNA水平：我们发现在雄性WT与Slc10a1^-/-小鼠之间，或在雌性WT与Slc10a1^-/-小鼠之间没有显著差异(图24C和D，图25C和D)。CYP2E1或MGMT蛋白水平也不存在任何差异(在24h时间点检查)(图24E)。

为了确认已知驱动DEN诱导的致癌性的两种主要DNA加成物的存在和数量，在DEN注射后0和24h，通过UHPLC-MS/MS，测量了肝基因组DNA中8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-oxo-dG)和O⁶-乙基鸟嘌呤的水平。在DEN注射后，两种加成物的水平提高，但在WT与Slc10a1^-/-小鼠之间没有观察到它们水平上存在显著差异(图26A和B)。这些结果表明，我们在WTvs.Slc10a1^-/-小鼠中发现的肿瘤形成能力上的差异，不能用DEN癌发生模型的差异或与其相关的假象来解释。以前的研究表明，肝的代偿性增殖可能参与对DEN的应答，并可能造成肿瘤发生。然而，在这里，我们使用增殖细胞核抗原(PCNA)染色发现，在DEN注射后24h，PCNA⁺细胞数目在雄性WT和Slc10a1^-/-小鼠之间不存在差异(图24F和G)。

总的来说，图24显示出，在雄性Slc10a1^-/-小鼠中，Ntcp缺陷不影响DEN致癌性。在出生后第14天，将雄性WT和Slc10a1^-/-小鼠用DEN(25mg/kg)通过i.p.给药进行处理，在DEN暴露后0、5、24和48小时收集血清样品。测量TBA水平(A)和ALT水平(B)(n＝每组5～6只)。在DEN暴露后0、5、24和48小时使用qPCR分析参与DEN代谢的两个基因Cyp2e1(C)和Mgmt(D)的表达水平(n＝每组5只)。在DEN暴露后24h通过免疫印迹，评估CYP2E1和MGMT的蛋白质水平(E)。使用GAPDH作为参比蛋白质。每一印迹上方的数值指示定量的灰度扫描结果(使用Image J)。(F和G)在雄性WT和Slc10a1^-/-小鼠(n＝每组5只)中，在DEN注射后24小时，通过增殖细胞核抗原(PCNA)的免疫组织化学染色分析肝细胞代偿增殖。PCNA阳性计数的定量分析使用Image J进行。Student’s t检验。标尺条：50μm。

图25显示出，在雌性Slc10a1^-/-小鼠中，Ntcp缺陷不影响DEN致癌性。在出生后第14天，将雌性WT和Slc10a1^-/-小鼠用DEN(25mg/kg)通过i.p.给药进行处理，并在DEN暴露后0、5、24和48小时收集血清样品。测量TBA水平(A)和ALT水平(B)(n＝每组4～7只)。在DEN暴露后0、5、24和48小时，使用qPCR分析参与DEN代谢的两个基因Cyp2e1(C)和Mgmt(D)的表达水平(n＝每组4～5只)。Student’s t检验。

总的来说，实施例3显示，NTCP抑制剂(其下调/抑制NTCP的表达，或调节和抑制NTCP的功能)可以预防和治疗肝癌发生，特别是由化学试剂诱导的肝癌发生。

实施例4.NTCP抑制剂在雄性中改善肝癌发生

(1)在患高胆汁酸血症的雄性小鼠中，Ntcp缺陷扰乱多条代谢通路并导致肝脏雌性化基因表达。为了进一步阐明Slc10a1^-/-小鼠中HCC发展下降的基础，我们进行了RNA-seq，以研究8周龄时雄性和雌性的WT和Slc10a1^-/-小鼠的肝脏的转录组。KEGG通路分析表明了，雄性和雌性Slc10a1^-/-小鼠的肝脏中均有大量的代谢通路发生了显著改变(图26C)。由于在人类和啮齿动物中，肝脏的性别基因二态性是对HCC产生差异易感性的基础，因此我们进一步分析了Ntcp缺陷对肝脏性别偏好性基因表达的影响。对WT肝脏的RNA-seq数据的分析，鉴定出197个在雄性与雌性之间差异表达的基因，其中135个显示出偏雌性表达，62个显示出偏雄性表达。

有趣的是，我们发现在Slc10a1^-/-小鼠中，随着TBA浓度提高，在WT雄性vs.雌性小鼠中观察到的强烈偏雌性基因表达的程度变得不太显著。此外，使用甚至>50μM的TBA浓度，Slc10a1^-/-小鼠表现出我们在WT雄性vs.雌性小鼠中已经观察到的显著的雄性化基因表达(图26D)。这个分析清楚地表明，在患高胆汁酸血症的雄性Slc10a1^-/-小鼠中，Ntcp缺陷扰乱大量代谢通路，并导致肝脏雌性化基因表达，这种现象可能促成了所观察到的肝癌发生的减弱。为了进一步探索肝脏中的这些显著上调的雌性化和下调的雄性化基因多大程度上与肝癌患者的预后相关，我们在人类蛋白质图谱(www.proteinatlas.org)中呈现的肝癌患者组群中，检查了它们的人类同源物的表达对肝癌的预后影响。卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)分析显示，在排序靠前的30个上调的雌性化基因中，9个基因的高表达与肝癌的良好预后显著相关。这些基因中的两个被进一步认为是有利的预后基因(www.proteinatlas.org)。在排名靠前的10个下调的雄性化基因中，2个基因的低表达与肝癌的良好预后显著相关。

总的来说，图26显示出，在患高胆汁酸血症的雄性小鼠中，Ntcp缺陷扰乱多条代谢通路并导致雌性化基因的表达。(A和B)对出生后第14天，注射DEN后0和24h，雄性WT和Slc10a1^-/-小鼠的肝脏中，肝脏8-oxo-dG和O⁶-乙基-鸟嘌呤加成物的UHPLC-MS/MS分析。对于每个时间点和每种基因型来说，n＝4～6。平均值±SEM。p值通过未配对的双尾Student’st检验来计算。呈现了样品和标准品的8-oxo-dG和O⁶-乙基-鸟嘌呤的代表性色谱图。(C)对8周龄雄性Slc10a1^-/-和WT小鼠中，差异表达的基因的KEGG通路分析。通路按照p值进行排序。每个通路右侧的数字指示差异表达的基因的数目。这里呈现的数据是两次独立的RNA-Seq实验的合并分析。DEG截止(cut-off)值为qval<0.01，绝对变化倍数>2。对于每次RNA-Seq来说，n＝2～6。(D)对雄性和雌性WT和Slc10a1^-/-小鼠中，性别偏好性基因的RNA-Seq分析。在WT小鼠中，8周龄的雄性与雌性之间差异表达的基因(调整p-值<0.05)被认为是“性别偏好性基因”。每个基因的表达水平首先在平行样之间进行平均，然后以平均值为中心并按比例调节到方差(Z-评分)。使用双边配对样品威尔科克森(Wilcoxon)符号秩检验，来比较两个组之间的表达差异。使用箱线图描绘Slc10a1^-/-小鼠中性别偏好性基因的表达变化。对于每次RNA-Seq来说，n＝2～6。

(2)在雄性和雌性小鼠中，肝细胞中的小鼠NTCP的组成性表达加速DEN诱导的肝癌发生。为了进一步探索NTCP在肝癌发生中的作用，我们建立了过表达带有C-端标签(C9)的NTCP(其由小鼠白蛋白的增强子/启动子驱动)的转基因小鼠(图27A)。我们首先使用了36C1M检查了WT小鼠肝脏中的NTCP表达，然后利用C9标签特异性抗体探测了Tg(mNTCP-C9)小鼠的肝脏切片。除了由其自身启动子驱动的、在肝细胞中的内源表达之外，这些转基因小鼠还显示出小鼠NTCP的普遍膜表达(图27A)。然而，在雄性WT与Tg(mNTCP-C9)小鼠之间，或在雌性WT与Tg(mNTCP-C9)小鼠之间，没有发现TBA水平上的差异。我们进一步评估了，在经DEN处理的WT和Tg(mNTCP-C9)小鼠中的肝癌发生，并发现在DEN给药后40周，与WT小鼠相比，在雄性Tg(mNTCP-C9)小鼠的肝脏中存在明显更多可见的结节(图27B)。与WT对照相比，Tg(mNTCP-C9)小鼠显示出直径>5mm的结节数目的显著增加；它们还具有比WT小鼠更高的结节数目(图27C)。值得注意的是，到DEN给药后43周，雌性Tg(mNTCP-C9)小鼠也表现出比WT小鼠明显加速的HCC形成(图27B和D)。

总的来说，图27显示了，在雄性和雌性小鼠中，NTCP的组成性表达加速了DEN诱导的肝癌发生。(A)小鼠中，小鼠NTCP组成性表达的示意图。mNTCP的表达受到小鼠白蛋白增强子/启动子和牛生长激素(BGH)多腺苷化信号的控制。引入的小鼠NTCP基因在其C-端融合有标签(C9)(mNTCP-C9)。使用36C1M抗体(红色)检测内源NTCP；用C9抗体(红色)检测mNTCP转入基因的组成性表达；用DAPI(蓝色)染色细胞核。标尺条：100μm。(B)雄性WT和Tg(mNTCP-C9)小鼠在DEN暴露后40周，和雌性WT和Tg(mNTCP-C9)小鼠在DEN暴露后43周的肝脏的代表性照片。(C)在DEN暴露后40周，与它们的WT对照(实心三角形，n＝9)相比，雄性Tg(mNTCP-C9)小鼠(实心正方形，n＝5)示出肿瘤结节数目的增加，并且直径>5mm的结节数目的增加。每只小鼠用一个符号表示，线条表示中位数值。p值使用未配对的双尾Student’s t检验确定。(D)在DEN暴露后43周，与它们的WT对照(实心圆圈，n＝7)相比，雌性Tg(mNTCP-C9)小鼠(空心正方形，n＝5)显示出结节数目的增加和直径>5mm的结节数目的增加。每只小鼠用一个符号表示，线条表示中位数值。p值使用未配对的双尾Student’s t检验确定。

我们的结果合在一起表明：(i)在小鼠中，NTCP在围产期间在肝细胞中初始表达；(ii)在Slc10a1^-/-小鼠中肝癌发生减弱，但在Tg(mNTCP-C9)小鼠中加速；并且(iii)在患高胆汁酸血症的雄性Slc10a1^-/-小鼠中，肝脏雌性化基因早期表达。此外，发现显著上调的雌性化基因和下调的雄性化基因的大多数人类同源物，与肝癌患者中的良好预后相关。重要的是，最近的流行病学研究表明，在东亚人群中，SLC10A1(NTCP)S267F变体独立地与肝硬化和HCC的风险降低相关，并且有趣的是，另一项研究表明长期使用普萘洛尔(一种NTCP抑制剂)可能在HCV肝硬化患者中降低HCC发生率。基于我们的研究，我们提出操控NTCP的表达水平和/或功能，可能是阻止HCC疾病进展的一种有希望的策略。