CN106138045B - 通过靶向mTOR操纵肿瘤微环境以消除肿瘤耐药性的方法及制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过靶向mTOR操纵肿瘤微环境以消除肿瘤耐药性的方法及制剂。本发明首次揭示了雷帕霉素及其类似物在逆转肿瘤耐药性方面的新机制，在此基础上提供了对于治疗肿瘤或逆转肿瘤耐药性有用的药物或药盒，以及雷帕霉素及其类似物与临床特定抗癌药物形成组合制剂的新用途。

Description

通过靶向mTOR操纵肿瘤微环境以消除肿瘤耐药性的方法及 制剂

技术领域

本发明属于生物制药领域，更具体地，本发明涉及通过靶向mTOR操纵肿瘤微环境以消除肿瘤耐药性的方法及制剂。

背景技术

肿瘤对化疗药物的耐受性是肿瘤治疗的主要障碍，也是临床效果不佳甚至最终走向失败的根本原因。随着基础研究的进展，新的化疗药物和治疗方案不断被推出，然而至今仍未能解决肿瘤耐药这一难题。

在临床实践中，许多肿瘤的初次化疗一般可取得较好的结果，然而此后却难免要复发，且复发后的治疗效果往往更差，其主要原因就是残存的肿瘤细胞(包括干细胞)已经对化疗药物产生了耐药性，即对治疗的敏感性降低。据估计，癌症死亡患者中有90％以上存在着耐药这一现象。因此对肿瘤耐药机制和新型治疗方法的研究，对于克服抗癌治疗面临的困境，是极为重要的。

在过往针对包括晚期前列腺癌、乳腺癌等恶性实体瘤患者在内的临床或基于实验小鼠的预临床研究中，以基因毒药物为主体的抗癌治疗效果非常有限。究其原因，多数是由于化疗药物在清除肿块、杀死大量癌细胞的同时，也以其不可避免的脱靶效应对癌细胞周边的微环境造成广泛结构性和功能性破坏并使得病灶内的大量基质细胞出现治疗性活化，后者对于癌细胞在治疗间期的存活、修复、再增值形成多重保护屏障。这种非癌细胞在临床压力下的非自主性变化，最终促使疾病在疗后阶段广泛出现复发和转移，表现为临床肿瘤学中居高不下的致死率。

因此，本领域有必要不断探索克服肿瘤耐药性的新途径，来改善临床上肿瘤治疗效果。

发明内容

本发明的目的在于提供通过靶向mTOR操纵肿瘤微环境以消除肿瘤耐药性的方法及制剂。

在本发明的第一方面，提供一种雷帕霉素或其类似物的用途，用于制备消除肿瘤耐药性的药物组合物。

在一个优选例中，所述的雷帕霉素或其类似物通过靶向mTOR的方式操纵肿瘤微环境，从而消除肿瘤耐药性。

在另一优选例中，述的肿瘤耐药性是肿瘤对化疗药物产生的耐药性。

在另一优选例中，所述的雷帕霉素类似物包括：RAD001。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括(但不限于)：前列腺癌，乳腺癌，结直肠癌，肺癌，皮肤癌。

在本发明的另一方面，提供一种用于治疗肿瘤或消除肿瘤耐药性的药物组合物，所述药物组合物包括：雷帕霉素或其类似物；和化疗药物。

在一个优选例中，所述的化疗药物包括：米托蒽醌，阿霉素，环磷酰胺；或所述的雷帕霉素类似物包括：RAD001。

在另一优选例中，所述的化疗药物为非雷帕霉素的其它化疗药物；较佳地，所述的化疗药物是：基因毒药物，如米托蒽醌，阿霉素，环磷酰胺等。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括雷帕霉素和米托蒽醌，且雷帕霉素与米托蒽醌的质量比为1～5:1；较佳地为1.5～4:1；更佳地是2～3:1。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括雷帕霉素类似物RAD001、阿霉素和环磷酰胺，且RAD001、阿霉素和环磷酰胺的质量比为：(0.8～1.2):(0.8～1.2):(25～35)；较佳地为(0.9～1.1):(0.9～1.1):(28～32)；更佳地是1:1:30

在本发明的另一方面，提供所述的药物组合物的用途，用于制备治疗肿瘤或消除肿瘤耐药性的药盒。

在本发明的另一方面，提供一种用于治疗肿瘤或消除肿瘤耐药性的药盒，所述药盒包括：雷帕霉素或其类似物和化疗药物；或所述的药盒中包括所述的药物组合物。

在一个优选例中，所述的药盒中还包括使用说明书。

在另一优选例中，所述的使用说明书中记载了如下的化疗方案：

(1)给予受试者化疗药物，以及雷帕霉素或其类似物(可溶解、混合在一起给药)；

(2)2周后，重复步骤(1)；每二周作为一个给药周期，进行2～20个给药周期(如3～10个给药周期)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、DNA损伤发生后前列腺基质细胞(PSC27)内一系列因子被激活。

图1A，mTOR S2448位点发生磷酸化，而其底物之一的S6K1的T389位点和底物之二的4E-BP1的S65位点亦陆续出现磷酸化。其中S6K1的生化底物S6的S235/236位点随后被磷酸化。总mTOR，S6K1，4E-BP1和S6分别为各自磷酸化蛋白形式的对照；β-actin为加样对照。

图1B，PSC27经过¹³⁷Cs伽马射线(IR)和/或雷帕霉素(Rapa)处理后的免疫荧光染色。实验中所用抗体，anti-p-mTOR(S2448)。

图2、基质细胞的DNA复制、衰老和增殖情况。

图2A，PSC27在经过IR和/或Rapa处理后BrdU检测结果。

图2B，细胞经过12小时半乳糖苷酶试剂染色后的亮场照片。

图2C，各组之间的半乳糖苷酶试剂染色阳性细胞百分比统计数字作图。

图3、基质细胞经由各种条件处理后DNA损伤情况分析。

图3A，PSC27在经过IR和/或Rapa处理后双链断裂处伤口处染色图片。抗体，anti-γH2AX。

图3B，PSC27细胞经过IR处理后DNA损伤情况统计学分析。

图3C，PSC27细胞经过MIT处理后DNA损伤情况统计学分析。

图3D，PSC27细胞经过SAT处理后DNA损伤情况统计学分析。

图4、PSC27细胞在各种条件下表现出来的增殖潜力曲线。Control，未经处理的原始态基质细胞；RS，体外条件下经数次传代并到达分裂终点的复制型衰老细胞；Rapa/IR，经过伽马射线照射、同时被雷帕霉素处理后的基质细胞；DMSO/IR，经过伽马射线照射、同时被作为溶剂对照的DMSO处理后的基质细胞；IR only，仅经过伽马射线照射的基质细胞；control/DMSO，仅被DMSO处理后的基质细胞。

图5、基质细胞DNA损伤后信号调控通路相关蛋白IKK同mTORC1间相互作用及NF-κB功能性活化。

图5A，免疫沉降分析对照和射线照射下的基质细胞裂解液中蛋白相互作用情况。IgG，对照组免疫球蛋白；mTOR，实验组所用于免疫沉降的抗体。Cell lysates，总细胞裂解液。Reverse IP，反向免疫沉降；IgG，对照组免疫球蛋白；IKKα，实验组所用于免疫沉降的抗体。

图5B，IKKα磷酸化、IKBα蛋白降解及NF-κB功能性活化，包括p65和p50的核转运。α-tubulin，细胞质蛋白上样对照；Histone H3，细胞核蛋白上样对照。

图6、NF-κB报告系统及mTORC1主要组分蛋白对NF-κB功能性活化的影响。

图6A，用于检测实验条件下NF-κB功能性活化与否的报告系统。编码萤火虫荧光素酶的报告载体用于转染PSC27细胞，雷帕霉素和辐射处理之后的细胞裂解液用于信号生成反应。

图6B，mTOR被shRNA沉默后在DNA损伤条件下S2448位点的磷酸化状态。

图6C，raptor被shRNA沉默后检测细胞在DNA损伤条件下的表达。

图6D，mTOR和raptor分别被shRNA沉默后，细胞经辐射前后的NF-κB功能性活化情况。Rapa，雷帕霉素处理组，实验阳性对照。

图7、药物处理或转录本沉默对基质细胞中DDSP分泌表型的影响。

图7A，经25nM浓度的雷帕霉素处理后PSC27中多个DDSP效应因子的转录情况。

图7B，以shRNA敲除S6K1前后对细胞中S6K1的T389位点磷酸化影响。

图7C，以编码4E-BP1的过表达载体转染基质细胞后在DNA损伤前后4E-BP1的S65磷酸化情况。

图7D，分别将S6K1敲除或4E-BP1过表达后，PSC27分泌标志蛋白包括CXCL1,CCL8,WNT16B,IL8,MMP12，SPINK1,AREG等的表达变化情况。

图7E、对特定蛋白因子(如IL8)进行的基于ELISA的生化测定。

图8、全基因组范围芯片分析DNA损伤后分泌性蛋白的表达情况及雷帕霉素处理条件下分泌表型的发展。C，未经损伤的原始态PSC27细胞；XRT，辐射处理后的细胞；X+R，同时经过辐射和雷帕霉素处理后的细胞；C vs XRT，辐射处理后的细胞比较于原始态细胞；C vsX+R，辐射和雷帕霉素处理后的细胞比较于原始态细胞。

图9、IKK不同亚基对于DNA损伤条件下NF-κB活化的功能性影响。

图9A，通过shRNA将IKKα亚基敲除之后以immunoblot检测细胞经伽马射线照射后IKKα的磷酸化和表达水平变化。

图9B，通过shRNA将IKKβ亚基敲除之后以immunoblot检测细胞经IR后IKKβ的磷酸化和表达水平变化。

图9C，IKKα亚基和IKKβ亚基分别或同时敲除之后对于基质细胞DNA损伤后NF-κB活性的影响，雷帕霉素处理同亚基敲除叠加进行作为对照。

图10、化学胁迫和基因毒压力下mTOR和IKKα亚基之间的生物学作用。

图10A，Hela细胞在TNFα(20ng/ml，60分钟)、PSC27细胞在10Gy伽马射线照射后，细胞裂解物经免疫沉降处理(IgG为对照，anti-p-IKK为实验组)，再以免疫印迹分析其中p-mTOR和p-IKK的存在。

图10B，PSC27细胞在伽马射线照射后mTOR和IKK之间互作的时间曲线。图中所示为7天至20天之间的区段性时间节点下的细胞裂解物分析结果。

图11、免疫沉降确定DNA损伤条件下mTOR同IKKα之间的作用方式。用标签表达载体Flag-IKKα和GST-mTOR分别或共转染PSC27细胞，并进行伽马射线照射。以药物PP242预先处理细胞以避免Flag-IKKα被即将活化的GST-mTOR所磷酸化。细胞裂解液中的Flag-IKKα随即被anti-Flag所免疫沉降，沉降物悬浮于含ATP的激酶缓冲液中。因该免疫沉降后的过程中并无外源mTOR进入反应体系，故所有随后结果中出现的IKKα磷酸化均应由共沉淀下的mTOR所引起。小牛肠道磷酸酶(CIP)处理的样本为阴性对照平行实验所获。免疫印迹中使用p-IKKα，IKKα和mTOR抗体检测，actin为上样对照。

图12、外源IL-1α处理或内源IL-1α敲除条件下基质细胞中NF-κB信号通路的活化状态。

图12A，以重组人IL-1α预先处理PSC27细胞，然后对比分析原始细胞及IL-1α实验组细胞裂解物中p-IKKβ，IKKβ，IKBα，IRAK1的表达量或留存量变化。p65和p50抗体用于确定NF-κB亚单位p65和p50核转位情况。

图12B，以shRNA敲除IL-1α前后基质细胞中IL-1α表达情况，GAPDH为上样对照。

图12C，以shRNA敲除IL-1α后基质细胞中NF-κB信号相关蛋白的表达或留存情况，β-actin为细胞质蛋白上样对照，Histone H1为细胞核蛋白上样对照。

图13、PSC27基质细胞系经药物处理Akt，或转录本沉默PI3K后，在DNA损伤条件下胞内p38，Akt和mTOR的变化情况。

图13A，泛Akt化学试剂MK-2206处理PSC27细胞后，原始态和伽马射线照射下细胞内相关蛋白的修饰变化情况。

图13B，shRNA将PI3K催化亚基p110敲除后基质细胞在DNA损伤前后PIK3CA的表达情况。

图13C，shRNA将PI3K催化亚基p110敲除后原始态和伽马射线照射下细胞内相关蛋白的修饰变化情况。

图14、基质细胞中p38，IKK亚基在调控DNA损伤胁迫下DDSP信号通路中的系统分析。以shRNA分别或同时敲除IKKα和IKKβ亚基，或以药物SB203580抑制p38激酶活性后，基质细胞在伽马射线照射前后胞内一系列信号转导相关蛋白修饰及表达情况。β-actin，胞内蛋白上样对照；Histone H1，核内蛋白上样对照。

图15、基质细胞内Akt和/或PI3K被药物抑制条件下NF-κB功能性活化情况。以特异性药物LY294002和/或MK-2206预处理PSC27细胞后，比较其在经DNA损伤与否情况下，NF-κB的生物学活性状态。

图16、雷帕霉素所介导的基质细胞mTOR活性抑制，对于DNA损伤条件下基质细胞改变癌细胞各种表型的功能性影响。

图16A，前列腺癌增殖特性的变化。

图16B，前列腺癌二维迁移特性的变化。

图16C，前列腺癌二维侵袭特性的变化。

图16D，前列腺癌耐药特性的变化。以上几种实验中，除Hela细胞系为宫颈癌来源外，其它均为人类前列腺来源(BPH1为良性对照；M12，PC3，DU145，LNCaP为实验组恶性细胞系)。

图17、体外条件下基质细胞经雷帕霉素预处理8天后，再同前列腺癌细胞PC3形成重组组织并接种到免疫缺陷型小鼠体内(由腹腔注射)。经过一个8周的体内生长期，荷瘤鼠的肿瘤被测量并用于统计学分析。每组动物，8只。

图18、预临床条件下实验小鼠体内肿瘤在化疗作用下的生长和体积测定。

图18A，工作图，即一个8周疗程的实验时间点的分布，包括重组组织接种，药物供给，肿瘤测量，循环次数设计等。

图18B，几种不同条件下的荷瘤鼠体内肿瘤生长状态经生物荧光仪器检测后的影像学图片对比分析。

图18C，针对图18B条件下的免疫缺陷小鼠于预临床实验结束时测定肿瘤终端体积的结果统计学分析。整个过程中所用传统化疗药物为米托蒽醌。每组动物，10只。

图19、雷帕霉素类似物RAD001对于DNA损伤后乳腺基质细胞(HBF1203)相关信号通路调控因子翻译后修饰、转录分子活化和DDSP表型标志性效应因子表达的影响。

图19A，电离辐射后，mTOR S2448位点迅速出现磷酸化，而其底物S6K1(及其底物)和4E-BP1相应位点亦随后出现磷酸化。RAD对以上信号通路调控因子翻译后修饰形成生化阻断。

图19B，IKKα磷酸化、IKBα蛋白降解及NF-κB功能性活化，包括p65和p50的核转运。RAD001的存在，对这些变化造成显著抑制。

图19C，分别将S6K1敲除或4E-BP1过表达后，HBF1203分泌标志蛋白包括MMP1，MMP12，SFRP2，SPINK1，WNT16B，IL6，EREG，CXCL1等的表达变化情况。

图20、雷帕霉素类似物RAD001对于乳腺基质细胞HBF1203胞质中IKKβ和IKKα亚基活化的影响，及外源IL-1α处理或内源IL-1α敲除条件下基质细胞中NF-κB信号通路的活化状态。

图20A，重组人IL-1α预先处理HBF1203细胞，然后对比分析原始细胞及IL-1α实验组细胞裂解物中p-IKKβ，IKKβ，IKBα，IRAK1的表达量或留存量变化。p65和p50抗体用于确定NF-κB亚单位p65和p50核转位情况。

图20B，以shRNA敲除IL-1α后基质细胞中NF-κB信号相关蛋白的表达或留存情况，β-actin为细胞质蛋白上样对照，Histone H1为细胞核蛋白上样对照。

图21、雷帕霉素类似物RAD001同传统化疗药物联合使用的治疗方案及预临床试验的抗癌效果。

图21A，免疫缺陷型小鼠SCID经过常规化疗及RAD001辅助治疗的时间分布，给药顺序和检测设计图。

图21B，针对以上条件中的实验小鼠于预临床实验结束时测定肿瘤终端体积的结果统计学分析。整个过程中所用传统化疗药物为阿霉素/环磷酰胺。每组动物，10只。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示了雷帕霉素或其类似物在逆转肿瘤耐药性方面的新机制，在此基础上提供了对于治疗肿瘤或逆转肿瘤耐药性有用的药物或药盒，以及雷帕霉素或其类似物与化疗药物构成的相关组合制剂的新用途。

如本文所用，所述的“肿瘤”可以是原位肿瘤或转移肿瘤，其包括存在耐药性的难治性肿瘤。较佳地，所述的肿瘤是实体瘤。例如，所述的肿瘤包括：乳腺癌、结直肠癌、肺癌、皮肤癌等。

本发明人在研究中发现，雷帕霉素或其类似物可以通过靶向mTOR的方式操纵肿瘤微环境，从而废除癌细胞恶性表型，并使得肿瘤对于经典化疗保持敏感。

因此，本发明提供了雷帕霉素或其类似物的新医药用途，用于制备消除肿瘤耐药性的药物。

本发明人还发现，雷帕霉素或其类似物与化疗药物如米托蒽醌联合用药，能够极其显著地增强肿瘤抑制效果。雷帕霉素或其类似物与化疗药物的协同作用藉由以下作用方式：雷帕霉素或其类似物通过靶向mTOR的方式影响肿瘤微环境，使得肿瘤对于化疗药物保持敏感，从而化疗药物的用药效果更为理想。

雷帕霉素或其类似物与化疗药物可以被制成药物组合物的方式给药，或者两者可以分离地存在于一个药盒中。

本发明还提供了一种组合物(药物)，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的雷帕霉素或其类似物与有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的化疗药物(如米托蒽醌、阿霉素、环磷酰胺)，以及药学上可接受的载体。

如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本文所用。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

通常，可将所述雷帕霉素或其类似物与化疗药物(如米托蒽醌、阿霉素、环磷酰胺)配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

本发明提供了一种用于治疗肿瘤的药盒，所述的药盒中包括雷帕霉素或其类似物和化疗药物(如米托蒽醌、阿霉素、环磷酰胺)。更优选地，所述药盒中还包括：使用说明书，以指导临床医师以正确合理的方式用药。

为了方便给药，所述的雷帕霉素或其类似物与化疗药物(如米托蒽醌、阿霉素、环磷酰胺)的组合物或分离的雷帕霉素或其类似物或化疗药物(如米托蒽醌、阿霉素、环磷酰胺)可以被制成单元剂型的形式，置于试剂盒中。“单元剂型”是指为了服用方便，将药物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

为了获得良好的治疗效果，本发明人经过反复研究比较，提出了一个治疗方案，包括：(1)给予受试者化疗药物，以及雷帕霉素或其类似物；(2)2周后，重复步骤(1)；每二周作为一个给药周期，进行2～20个给药周期。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、细胞培养

(1)细胞系及培养

正常人源前列腺原代基质细胞系PSC27和正常人源乳腺原代基质细胞系HBF1203于PSCC完全培养液中增殖和传代。前列腺良性上皮细胞系BPH1，前列腺癌症上皮细胞系M12，DU145，PC3，LNCaP和VCaP(购自ATCC)，均在5％FBS的RPMI-1640完全培养液中、于37℃、5％CO₂条件的培养箱中培养。乳腺癌症上皮细胞系MDA-MB-231(购自ATCC)，使用含5％FBS的DMEM培养液培养。

(2)体外实验处理

为造成DNA损伤，PSC27细胞生长至80％时使用¹³⁷Cs伽马射线(剂量10Gy，简称IR)进行电离辐射。此外，1μM米托蒽醌(mitoxantrone，PSC27-MIT)，10μM沙铂(Satraplatin/JM216，PSC27-SAT)也在平行实验中用于造成DNA损伤。药物处理6小时后，细胞用PBS简单洗过3次，留置于培养液中7～10天，然后进行后续实验。

2、基因敲除载体和免疫实验抗体

实验中所用编码shRNA的慢病毒载体均购自美国Open Biosystems(Lafayette，CO)。

针对以下抗原的抗体的来源分别为：γH2AX(Upstate)；mTOR(BioLegend；Invitrogen)；phospho-mTOR(Ser2448)(R&D)；GST，Raptor(Millipore)；Rictor，4EBP1，phosphor-4EBP1，S6K1，phospho-S6K1(Cell Signaling)；IKKα，phospho-IKKα，phospho-Akt(S473)(Cell Signaling)；IKKβ，IKKγ(Abcam)；IKBα(MyBioSource)；phospho-IKKβ(USBiological)；p65，Histone H1，Histone H3，β-actin，β-tubulin(Santa Cruz)；NF-κB1(p50)(eBioscience)；p38，phosphor-p38(Enzo Life Sciences)；PI3K-p110(Abgent)；PI3K-p85(Epitomics)；Akt，IL-1α，IL-8(R&D)；CXCL1(GeneTex)；CCL8(Abcam)；WNT16B(BDPharmingen)；MMP12(OriGene)和AREG(LifeSpan)，被用于免疫印迹和/或免疫荧光沉淀分析。重组人IL-1α(HPLC-purification(159aa))由US Biological提供。

3、BrdU嵌入标记和β-半乳糖苷酶染色分析

细胞以1.5×10⁵/ml细胞数接种于直径35ml培养皿中(内放置一盖玻片)，培养1天，用含0.5％FBS培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于G0期。终止细胞培养前，加入BrdU(终浓度为30μg/L)，37℃，孵育4-6h。弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。甲醇/醋酸固定10min。经固定的玻片空气干燥，0.3％H²O²-甲醇30min灭活内源性氧化酶。用5％正常兔血清封闭。甲醛胺100℃，5min变性核酸。冰浴冷却后以PBS洗涤，加一抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1：50)，阴性对照为加PBS或血清。按ABC法进行检测，苏木精或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数(LI)。

β-半乳糖苷酶染色则以PBS简单清洗待染细胞，使用4％甲醛室温下固定5分钟。以PBS洗过后，37℃无CO₂培育12-18h，然后镜下观察。

4、免疫荧光分析

小鼠单克隆抗体anti-phospho-Histone H2A.X(Ser139)(clone JBW301，Millipore)和兔多克隆抗体anti-SFRP2(Santa Cruz)，及二级抗体Alexa 488(or594)-conjugated F(ab’)₂按顺序加入到覆有固定细胞的载玻片上。细胞核用2μg/ml的4’，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)进行复染。从3个观察视野中选取最具代表性的一张图像进行数据分析和结果展示。FV1000激光扫描共聚焦显微镜(Olympus)用于获取细胞共聚焦荧光图像。

5、基质-上皮共培养和体外实验

用DMEM+0.5％FBS的培养液培养PSC27细胞3天，然后以1倍PBS清洗满丰度的细胞群。简单离心后收集上清作为条件性培养基存放–80℃或直接使用。前列腺上皮细胞在这种条件性培养基中连续培养3天的时间里开展体外实验。对于化疗抗性，上皮细胞系在低血清DMEM(0.5％FBS)(简称“DMEM”)中，或条件性培养基中培养，同时米托蒽醌用于处理细胞1至3天，浓度接近各个细胞系的IC₅₀数值，随后以亮场显微镜进行观察。

6、全基因组范围表达芯片分析(Agilent expression microarray)

对正常人源前列腺原代基质细胞系PSC27进行全基因组范围表达芯片(4x44k)分析的程序和方法与之前发表的论文相同(Sun，Y.，Campisi，J.，Higano，C.，Beer，T.M.，Porter，P.，Coleman，I.，True，L.and Nelson，P.S.2012.Treatment-Induced Damage tothe Tumor Microenvironment Promotes Prostate Cancer Therapy Resistancethrough WNT16B.Nat.Med.18:1359-1368)。

7、定量PCR(RT-PCR)测定基因表达

以Trizol试剂抽提生长期细胞总RNA，逆转录为cDNA。将逆转录反应产物cDNA稀释50倍作为模板。

按照以上标准加样，反应条件为：95℃预变性15s，然后95℃5s，60℃31s，40个循环；融解曲线条件为95℃15s，60℃30s，95℃15s。样品于ABI ViiA7(ABI)仪上进行反应。以β-actin的表达作内参。反应完成后，经软件分析查看每个基因的扩增情况，导出相应的域值循环数，采用2-ΔΔCt方法，计算每个基因的相对表达量。对融解曲线(melting surve)的波峰和波形进行分析以确定得到的扩增产物是否为特异性单一目的片段。

8、免疫印迹Western blot分析

(1)细胞总蛋白抽提

细胞经冰预冷的PBS缓冲液简单洗涤后，加入含1mM PMSF(蛋白酶抑制剂)的RIPA细胞裂解缓冲液(Invitrogen)，置冰上裂解细胞30min，用细胞刮刀收集细胞裂解液，4℃12,000rpm离心15min，取上清，-80℃保存。

(2)BCA法蛋白定量

BCA蛋白定量试剂盒(Pierce)，将试剂A和试剂B按1：50的比例混合，制成工作液待用。稀释标准蛋白，使其浓度依次为0μg/μl，25μg/μl，50μg/μl，100μg/μl，250μg/μl，500μg/μl，750μg/μl，1000μg/μl，2000μg/μl。在酶标板中加入5μl标准蛋白或5μl样品，再加入100μl BCA工作液，混合均匀后37℃水浴30min，用酶标仪读取570nm波长的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线，计算样品的浓度。

(3)SDS-PAGE电泳

配制12％SDS-PAGE(5ml体系包含30％丙烯酰胺2ml，ddH2O 1.6ml，1.5MpH8.8Tris-HCl 1.3ml，10％SDS 50μl，10％过硫酸铵50μl，TEMED 2μl)，迅速混匀后注入干净的预置玻璃板(Bio-Rad)空隙中，并在顶层加入适量去离子水以促进凝胶聚合，室温下静置30min，待分离胶完全凝聚后，弃上层去离子水并用滤纸吸净残留液体。配制浓缩胶(2ml体系中包含30％丙烯酰胺0.33ml，1.0M pH6.8Tris-HCl0.25ml，10％SDS 20μl，10％过硫酸铵20μl，TEMED 2μl)，混匀后立即加到分离胶上层，插入干净的10齿梳子，室温下静置30min，待浓缩胶凝固完全后拔去梳子，用ddH2O洗涤加样槽数次，将凝胶置于电泳槽(Bio-Rad)，加入电泳缓冲液(含25mM pH8.0Tris，0.25M Glycine，0.1％SDS)。蛋白样品按5:1比例加入6×上样缓冲液(含300mM pH6.8Tris-HCl，12％SDS，600mM DTT，60％甘油，0.6％溴酚蓝)混匀，沸水浴10min，冰浴冷却5min，结合蛋白定量结果，各泳道加入等量蛋白样品，用Bio-Rad电泳仪进行电泳，先以80V电压进行电泳约20分钟至溴酚蓝前沿进入分离胶后，把电压提高至120V，继续电泳约1小时至溴酚蓝条带到达分离胶底部，电泳结束。

(4)蛋白转膜

SDS-PAGE电泳后，切除浓缩胶及无样品区域，将硝酸纤维素滤膜以电泳转移缓冲液短暂浸泡。在电转移装置(Bio-Rad)上由阳极至阴极依次放Bio-Rad 3mm滤纸、硝酸纤维素滤膜、凝胶、Bio-Rad 3mm滤纸。以100V电压进行电转移1.5h。转膜结束后，通过预染Marker和用0.1％丽春红染色(Ponceau Stain)判断转移效果，并用ddH₂O脱色5min。

(5)抗体标记和ECL检测

将硝酸纤维素滤膜在封闭液(含5％脱脂奶粉的TBST(0.1％Tween-20in TBS))中室温封闭1小时。在一抗杂交液中4℃孵育过夜。用TBST室温漂洗3次，每次2分钟。加入以封闭液配制的有HRP偶联的相应二抗杂交液，室温孵育0.5小时。用PBST室温漂洗滤膜3次，每次2min。

将SuperSignal West Pico试剂盒(Pierce)中等比例的底物及增强剂混合，均匀滴加到滤膜上，室温孵育1分钟，曝光X光片，显影、定影后，扫描X光片并保存用以分析。

9、蛋白相互作用免疫沉降分析

基质细胞(或上皮细胞)经体外条件下伽马射线，基因毒药物或化学因子刺激，一定时间后将细胞裂解液收集并用于随后蛋白-蛋白相互作用检测。取细胞裂解液1.2ml，置于离心管中，加入蛋白珠A agarose 20ul，置于4°摇床缓慢震荡1h以去除非特异性杂蛋白并降低背景。稍离心，收集上清于另一离心管中，向上清加入一抗2～5ug，和蛋白A agarose珠25ul，置于4°摇床缓慢震荡过夜。离心收集A agarose珠，弃掉上清，重悬沉淀于2x SDS上样缓冲液25ul中，煮沸2～5min，随后用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。

10、体外激酶活性检测(无细胞条件下)

基质细胞PSC27在不同条件下处理过后，使用1ml含0.3％CHAPS的裂解液进行处理。标签表达载体Flag-IKKα(购自Addgene)和GST-mTOR(购自Addgene)用于辐照前48小时共转染细胞。处理72小时后收集总细胞裂解物，PP242(Fisher-Scientific，20nM)及对照在辐照之前3小时加入培养基，以限制mTOR激酶活性。裂解液包含蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂和20nM PP242。裂解物同anti-Flag孵育12小时，随后同25μl蛋白G琼脂糖珠孵育1小时。用裂解液洗涤Anti-Flag介导的免疫沉降物4次，以除去PP242，而用ATP(20mM Hepes at pH7.7，2mM MgCl2，2mM MnCl2，10mMβ-glycerophosphate，10mM NaF，10mM p-NitrophenylPhosphate[PNPP]，300μM orthovanadate，1mM Benzamidine，2mM PMSF，1mM DTT，10μg/mLaprotinin，1μg/mL Leupeptin，1μg/mL pepstatin，1mM DTT)洗3次。免疫沉降物同时也与小牛肠道磷酸酶(CIP)在37℃下孵育45min，以抑制共沉降的mTOR活性，这作为该实验的特别对照。使用沉降物的针对GST-mTOR的激酶检测在30℃进行60min，使用激酶缓冲液和10μMATP及[γ-³²P]ATP(0.5μCi每激酶反应)。为终止实验，8μL的4×SDS样本缓冲液加入每一反应，煮沸10min。随后使用phospho-IKKα特异性抗体以免疫印迹确定免疫沉降物中IKKα的磷酸化状态。此外，在一个平行实验中红使用针对GST的抗体以检测mTOR在裂解物中的表达情况。

11、NF-κB转录活性报告表达载体

涵盖多个NF-κB结合位点和经过优化的IL-2最小启动子作为NF-κB激活转基因系统(NAT system)的报告载体NAT11-Luc2CP-IRES-nEGFP(获自日本Hokkaido大学)，在实验中用作NF-κB活性阳性对照。

12、小鼠移植瘤试验和预临床化疗程序

年龄6周左右的免疫缺陷型小鼠ICR SCID mice(体重约25g)用于本发明相关动物实验。基质细胞PSC27和上皮细胞以1:4的比例混合，而每一移植体包含1.25×10⁶细胞，用于组织重构。移植瘤通过腹腔注射方式植入小鼠体内，移植手术结束之后8周末动物被执行安乐死。肿瘤体积按照如下公式计算：V＝(π/6)x((l+w)/2)³(V，体积；l，长度；w，宽度)。

在预临床化疗试验中，经过腹腔下移植的小鼠被供给标准实验食谱，2周之后实施化疗药物米托蒽醌(0.2mg/kg剂量)和/或雷帕霉素(0.5mg/kg剂量)腹腔给药。时间点为第3，5，7周的第一天，整个疗程共进行3次循环给药，每个循环为2周。疗程结束后，小鼠体内肿瘤被收集用于体积测量和组织学分析。每只小鼠累积性接受米托蒽醌0.6mg/kg体重，雷帕霉素1.5mg/kg体重。化疗试验进行到第8周末结束。

针对接种乳腺癌细胞系MDA-MB-231和乳腺基质细胞系HBF1203的预临床化疗试验中，移植肿瘤2周之后实施化疗药物阿霉素/环磷酰胺(分别为1.0mg/kg和30.0mg/kg剂量)和/或RAD001(1.0mg/kg剂量)腹腔给药。时间点、给药频率和次数，均同以上米托蒽醌/雷帕霉素组合治疗方案。每只小鼠累积性接受阿霉素/环磷酰胺3.0mg/kg、90.0mg/kg体重，RAD001为3.0mg/kg体重。化疗试验全程时间为8周。

13、生物统计学方法

本发明中所有涉及细胞增殖率，迁移性，侵袭性和存活性等的体外实验和小鼠移植瘤及化疗处理的体内试验均重复3次以上，数据以均值±标准误的形式呈现。统计学分析建立在原始数据的基础上，通过one-way analysis of variance or a two-tailedStudent’s t-test进行计算，而P<0.05的结果认作具有显著性差异。

实施例1、作为基质细胞应对基因毒胁迫所作出的反应之一，mTOR在胞内被激活

临床条件下抗癌药物可以造成显著的细胞生理波动，包括DNA物理性损伤和自主性修复反应，后果主要包括细胞凋亡，自噬和衰老程序。细胞在发生DNA损伤之后很快进入衰老阶段，但在几个月内保持代谢性活动和生理性存活，并表现出一种以溶酶体扩张和半乳糖苷酶染色阳性为特征的分泌状态，该过程称为DNA损伤分泌程序(DDSP)。首先要确认，作为哺乳类细胞对外界的多种刺激如药物胁迫、营养和氨基酸供给等作出反应的主要信号分子mTOR，是否在基质细胞中被活化。

实验数据表明，人源前列腺基质细胞系PSC27一旦经电离辐射处理，mTOR在Ser2448位点被高度磷酸化(图1A)，而这种变化往往是作为该激酶生物活性和功能性参与细胞对外界刺激作出反应的一种生物标记。伴随着mTOR活化的，则是其下游靶点S6K1及其生化底物S6和4E-BP1的磷酸化。一般情况下，S6K1磷酸化使得细胞可以对核糖体生物合成和蛋白翻译进行精确调节。4E-BP1磷酸化则能阻止它本身跟eIF-4E的结合从而提高带帽型蛋白翻译的起始。相比之下，以25nM终浓度的雷帕霉素预先处理，基本消除了mTOR，S6K1和4E-BP1在培养条件下基质细胞中的翻译后修饰。磷酸化mTOR主要出现于细胞质中，与基因毒攻击后的细胞核中DNA单双链断裂的出现是如影随形的。虽然雷帕霉素没有明显改变原初细胞的形态学，它显著抑制了损伤基质细胞中mTOR的磷酸化水平(图1B)。细胞循环终止和明显的半乳糖胺酶染色阳性，均为基因毒诱导细胞衰老的标志性事件。

然而，向培养基中加入雷帕霉素没能改变这些表型，暗示这些细胞的衰老状态和代谢活性均被依旧维持着(图2A，2B和2C)。值得注意的是，辐射造成的DNA损伤反应的伤口焦点，即便在雷帕霉素加入培养基之后依然保持不变(图1B；图3A和3B)，说明雷帕霉素并不改变DNA物理性伤口的状态。作为支持性证据，临床中经常用于前列腺癌病人的两种药物，米托蒽醌(mitoxantrone，MIT)和沙铂(satraplatin，SAT)，一旦用于同种实验中的给药情况，则会产生极为相似的效果(图3C和3D)。尽管对于一些转化细胞，米托蒽醌可以衰减DNA损伤性信号并将不可逆的衰老性生长阻抑转变为可逆的静止态阻抑，本发明人的研究证明在基质细胞中其引发的是一种截然不同的反应。总群体翻倍数，是细胞增殖潜能的反应指数，然而却不被雷帕霉素所改变，这种趋势在基质细胞一旦在基因毒胁迫下进入衰老阶段后便成为事实(图4)。

同基因毒激发的分泌相关的绝大多数调节性通路，在过去经常被报道，包括转录因子NF-κB和C/EBPβ，但mTOR功能性参与的那些却被基本忽略了。为填补这一空缺，本发明人选择了在DNA损伤后的第10天裂解细胞，然后经过mTOR抗体介导的免疫沉降进行深层分析。有意思的是，辐射后的细胞中mTOR和IKKα及Raptor之间的结合明显增强，尽管每一种蛋白在裂解物中的总蛋白量在DNA损伤前后并未有所改变(图5A)。虽然在mTOR和IKKβ及IKKβγ之间存在着物理性结合，这种作用却很弱，且看不出有多大变化。为证实这一点，本发明人做了一项实验，即收集沉降物之前使用IKKα抗体，结果发现mTOR的量有所增加，而非Raptor(图5A)。上述数据表明在IKK的α亚基同mTOR之间存在着相互作用；而IKKα/β/γ同mTOR复合物之间的分子聚集，印证着涉及mTOR的一些分子间相互结合可以导致转录复合体NF-κB的活化。

实施例2、作为DDSP程序进展中一个关键信号节点，DNA损伤条件下mTOR/Raptor复合体一经出现便指向IKK/NF-κB通路

本发明人接下来评估mTOR通路对于DNA损伤分泌程序(DDSP)发展的生物相关性，并试图阐释其深层机制。首先，本发明人检测NF-κB通路的几个组分在细胞质或细胞核中的表达和活化情况。DNA损伤引起IKKα在Ser176/180位点的磷酸化，然而雷帕霉素的存在却使其信号显著下降(图5B)。同IKK亚单位改变相一致的是，即便在基质细胞经辐射后仍有大量IκBα保留在细胞质中，而作为下游反应之一的p65/p50核移位这一事件却在雷帕霉素的处理下被迅速废除(图5B)。使用本发明人在实验中创建的一套可检测核中NF-κB转录活性的报告系统(图6A)，发现针对mTOR或Raptor的转录抑制，能够显著阻止NF-κB复合物的功能性活化，尽管mTOR或Raptor的特异性shRNA(图6B，6C)在联合使用的条件下具有协同效应并跟雷帕霉素在25nM的工作浓度下产生的结果大致相当(图6D)。

鉴于基质细胞对DNA损伤所作出的反应即大幅合成并释放多种可溶因子这一特性，本发明人针对细胞使用了雷帕霉素，并随后对其进行辐射处理。同基因毒处理造成的变化相比，DDSP标志因子的上调被显著衰减或基本废除，在转录水平的变化幅度被限制在一个最低的范围中(图7A)。一旦敲除S6K或4E-BP1高表达(图7B和7C)，或经雷帕霉素处理，DNA损伤相关的一部分DDSP因子即出现明显下降，这包括CXCL1，CCL8，WNT16B，IL-8，MMP12，SPINK1和AREG(图7D)。特别的，对特定蛋白因子(如IL-8)进行的基于ELISA的生化测定，可以证实这一点(图7E)。然而，总有一些在基因毒情况下被DDSP所编码的、出现大量合成的蛋白，却不受雷帕霉素影响，暗示着这种胁迫反应型程序调控机制的生物复杂性(图7A)。本发明人从全基因组范围的芯片表达数据中也获得了支持性的证据，而这则是更为详细的、彻底的信息(图8)。

实施例3、NF-κB信号通路为mTORC1复合体的激酶活性所衔接

为阐释不同IKK亚基在DNA损伤时介导mTOR信号上的差异性，本发明人分别以基因特异性shRNA在伽马射线照射之前将IKKα和IKKβ亚基予以去除(图9A和9B)。消除α亚基实质上废除了NF-κB的核内活性，尽管β亚基的去除所造成的影响更高。当这两个亚基均已不存在时，DNA损伤情况下NF-κB通路的激活只有最小水平可被检测到(图9C)。

虽然IKKα同mTOR相联合并且看上去在功能上牵涉到将活化后mTORC1复合物的信号分程传递下来(图5A；图10A和10B)，但这两个分子之间是否存在直接相互作用或二者关系由其它因子所间接介导，至今并不清楚。为澄清这一点，本发明人使用药物PP242，一种新型的ATP竞争性、选择性mTOR激酶抑制剂，做了进一步实验。首先，体外实验用于确定mTOR是否直接磷酸化IKKα，即用GST-mTOR和Flag-IKKα表达载体来共转染PSC27细胞(图11)。在射线照射之前，细胞被PP242处理过，用于避免IKKα被即将出现的活化mTOR所磷酸化。在射线处理之后细胞被裂解，Flag-IKKα则被免疫沉降，随后于激酶缓冲液中同加入混合液中的ATP一起悬浮；既然在免疫沉降之后并没有外源mTOR加入体系，这一检测过程中观察到的所有IKKα磷酸化事件，必然系由一同沉降下来的mTOR所引起。免疫印迹结果证明IKKα在基因毒背景下S176位点发生磷酸化，而mTOR针对IKKα施加的磷酸化则被另一涉及小牛肠道磷酸酶的处理所印证(图11)。因此，IKKα磷酸化实际是发生在DNA损伤后活化的mTOR下游，而这一反应可被去磷酸化所逆转。本发明人的数据证明mTOR同IKK复合体之间存在物理性结合，这是作为对外界胁迫作出的一种反应，此一过程中IKKα是通过组装总IKK复合体而直接跟mTOR相互作用的主要蛋白组分。有趣的在于，当雷帕霉素在一个平行实验中被用于取代PP242时，IKKα磷酸化(S176)现象并没有出现，提示这两种mTOR抑制剂之间存在功能方式上的潜在差异。

实施例4、损伤基质细胞中mTOR下游和上游信号调控通路均处活跃

作为一种逆境诱导性因子，IL-1α对于包括IL-6和IL-8在内的分泌因子相关基质细胞表型的建立和维持是很重要的，而这类因子均为强化生长终止必不可少的前炎症因子。基因毒损伤的基质细胞可以表达高水平的IL-1α转录本，胞内蛋白，细胞表面结合蛋白及非常有限的外泌蛋白。即便拥有这些特质，细胞表面结合状态的IL-1α和损伤激活的mTOR之间的功能性关联至今依然缺失。需要明确的是，雷帕霉素抑制背景下的DDSP进展中IL-1α介导的信号是否以及怎样变化。有趣的是，基质细胞经受辐射损伤后IKKβ随即被磷酸化(图12A)，作为IL-1α/IL-1R信号通路中的关键成分，IL-1α受体相关激酶IRAK1和IκBα均被降解，而这一趋势在雷帕霉素处理之下却被显著抑制，表明这导致IL-1R信号的一种阻断。此外，外源IL-1α加入培养基之后却能逆转这一阻抑，而包括p65和p50在内的NF-κB复合体的核转移也基本同时恢复(图12A)。

在另外的一个反向实验中，IL-1α的消除(图12B)导致IKKβ磷酸化水平的下降，而IKKα磷酸化状态却不变(图12C)。尽管IRAK1蛋白水平没有发生变化，IκBα总量却在显著降低，暗示着IKKα单线介导的NF-κB通路依然活跃着。最为进一步的支持，p65和p50核信号仍然存在，表明NF-κB复合物的持续性激活(图12C)。

既然mTOR活化多数是因细胞对外部刺激作出的反应，下面要确认的是，作为哺乳动物细胞中mTOR上游调节子的PI3K/Akt，是否对DDSP相关的mTOR活化负有直接责任。使用MK-2206，一种高度选择性、非ATP竞争性异构、广谱性Akt抑制剂之后，本发明人发现mTOR磷酸化在消失，而这一过程跟Akt在S473位点的磷酸化下降同时进行(图13A)。然而，不论Akt抑制如何进行，p38活化却岿然不动。在这些证据存在的情况下，并不怎么令人感到意外的则是，PI3K激酶的催化亚基p110的移除(图13B)，可以阻止Akt和mTOR磷酸化，尽管p85α调节亚基保持不变的状态(图13C)。总之，在以上的每一种检测下，p38磷酸化，作为MAPK通路激活的一个指示灯，保持了持续的活化状态，不管PI3K/Akt轴发生怎样的改变(图14)。

作为DDSP事件的一个通用印记，DNA损伤后NF-kB复合物的活性显著提高，但可被PI3K或Akt的抑制所明显废除，尽管在基因毒攻击下部分核活性留存于细胞中(图15)。因此，从上游来的平行于p38的调控通路同时处于工作状态，或者p38通过PI3K/Akt介导了DDSP信号通路但在损伤性细胞中最终须牵涉NF-kB复合体的功能性活化；更重要的在于，这两种可能性在事实上都会存在(图14)。

实施例5、通过靶向mTOR的方式操纵微环境可以废除癌细胞恶性表型，并使得肿瘤对于经典化疗保持敏感

接下来本发明人检测了一旦mTOR用于抑制基质细胞的DDSP程序，其对于癌细胞行为的各种影响。第一，本发明人收集了基质细胞系产生的条件性培养基，用于体外刺激多种上皮细胞系。PSC27在雷帕霉素存在的条件下经受辐射并持续10天，以在收集条件性培养基之前充分发展DDSP表型，而培养基随后被应用于上皮细胞。有意思的是，在所检测的几种细胞系中，生长潜力普遍被降至最小(图16A)。过去已报道过损伤基质细胞产生的条件性培养基可以促进癌症上皮细胞的平面迁移率，及穿透胶制覆盖膜的侵袭力；然而，mTOR功能缺陷型基质细胞来源条件性培养基的这些特性，却被显著降低(图16B和16C)。与此同时，用于衡量DDSP广谱因子保护上皮细胞免受MIT递呈的细胞毒的实验中，所得数据表明，雷帕霉素介导的mTOR功能性抑制性基质细胞所赋予的癌细胞存活优势已经不再存在(图16D)。

在体外实验的基础上，本发明人通过操纵基质细胞构成的组织重组的方式对mTOR作为DDSP进展中一个枢纽性介导，进行了进一步研究。电离辐射之后，PSC27细胞在雷帕霉素存在的情况下孵育了10天，然后同PC3-Luc(前列腺癌PC3细胞系的亚系，可高表达萤火虫荧光素酶)相混合，一同移植入免疫缺陷性小鼠体内。在一个8周的疗程之后，实验小鼠被IVIS xenogen系统测定生物荧光，仪器确定其肿瘤大小。本发明人发现，PC3肿瘤的生长潜力被体外对基质细胞使用雷帕霉素预处理的方式，抑制了50％(图17)。因此，单一剂量的雷帕霉素即能避免DDSP所提升的肿瘤长势。

进而，模拟临床背景下生理现实的预临床研究，证实了以靶向mTOR的模式操纵肿瘤微环境的效果。从第3周开始的时间里，在第3、第5和第7周的第一天小鼠接受剂量为0.2mg/kg的米托蒽醌(MIT)腹腔注射(图18A)。因此，这种化疗的期间一共有3个两周的循环。在此期间，雷帕霉素作为靶向肿瘤微环境的药物，以与MIT制成单元剂型的形式同MIT一起给药。在8周的疗程结束时，雷帕霉素参与处理的那一组形成了比对照组小得多的肿瘤(图18B)。

为确认预临床效果，本发明人用统计学分析了数据，并发现在MIT直接造成的36.8％肿瘤缩小之外，雷帕霉素给药进一步造成55.7％的肿瘤负担降低(图18C)。客观上，这已经证实这一药物在废除DDSP赋予的癌细胞耐药性上的体内效果。

综上，米托蒽醌与雷帕霉素的联合用药极其显著地提高了抗肿瘤疗效。

实施例6、雷帕霉素类似物RAD001与同传统化疗药物联合使用的治疗方案及效果

本发明验证了雷帕霉素类似物RAD001对于DNA损伤后乳腺基质细胞(HBF1203)相关信号通路调控因子翻译后修饰、转录分子活化和DDSP表型标志性效应因子表达的影响。HBF1203一旦经电离辐射处理后，mTOR S2448位点迅速出现磷酸化，而其底物S6K1(及其底物)和4E-BP1相应位点亦随后出现磷酸化，如图19A。RAD对以上信号通路调控因子翻译后修饰形成生化阻断。IKKα磷酸化、IKBα蛋白降解及NF-κB功能性活化，包括p65和p50的核转运。RAD001的存在，对这些变化造成显著抑制，如图19B。分别将S6K1敲除或4E-BP1过表达后，HBF1203分泌标志蛋白包括MMP1，MMP12，SFRP2，SPINK1，WNT16B，IL6，EREG，CXCL1等的表达变化情况，如图19C。

本发明人还验证了雷帕霉素类似物RAD001对于乳腺基质细胞HBF1203胞质中IKKβ和IKKα亚基活化的影响，及外源IL-1α处理或内源IL-1α敲除条件下基质细胞中NF-κB信号通路的活化状态。重组人IL-1α预先处理HBF1203细胞，然后对比分析原始细胞及IL-1α实验组细胞裂解物中p-IKKβ，IKKβ，IKBα，IRAK1的表达量或留存量变化。p65和p50抗体用于确定NF-κB亚单位p65和p50核转位情况，结果如图20A。以shRNA敲除IL-1α后基质细胞中NF-κB信号相关蛋白的表达或留存情况，β-actin为细胞质蛋白上样对照，Histone H1为细胞核蛋白上样对照，结果如图20B。

本发明人还验证了雷帕霉素类似物RAD001同传统化疗药物联合使用的治疗方案及预临床试验的抗癌效果。免疫缺陷型小鼠SCID经过常规化疗及RAD001辅助治疗的时间分布，给药顺序和检测设计图如图21A，整个过程中所用传统化疗药物为阿霉素/环磷酰胺。针对以上条件中的实验小鼠于预临床实验结束时测定肿瘤终端体积的结果统计学分析如图21B。结果显示，在化疗药物直接造成的38.7％肿瘤缩小之外，雷帕霉素类似物RAD001给药进一步造成52.9％的肿瘤负担降低。

综上，阿霉素/环磷酰胺与雷帕霉素类似物RAD001的联合用药极其显著地提高了抗肿瘤疗效。

本发明中，将“米托蒽醌”直接与“雷帕霉素”同时给药，不存在间歇给药这种耗时耗力、增加创伤、最终反而影响治疗效果的陈旧方式。另外，本发明人提供了针对乳腺癌的组合式疗法数据，即用“阿霉素/环磷酰胺(doxorubicin/cyclophosphamide)”同雷帕霉素类似物RAD001联合使用，改变了以往仅仅靶向癌细胞自身的治疗思路，将微环境的病理性影响一并纳入干预范畴，从而克服了传统意义上抗癌治疗的严重局限性，具有突出的创新意义。

在本发明提及的所有文献都在本发明中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种雷帕霉素类似物RAD001的用途，用于与阿霉素和环磷酰胺联用制备消除肿瘤耐药性和治疗肿瘤的药物组合物；其中所述的肿瘤为乳腺癌，所述的雷帕霉素类似物RAD001:阿霉素:环磷酰胺的质量比为(0.9～1.1):(0.9～1.1):(28～32)。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤耐药性是肿瘤对化疗药物产生的耐药性。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的雷帕霉素类似物通过靶向mTOR的方式操纵肿瘤微环境，从而消除肿瘤耐药性。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的雷帕霉素类似物RAD001:阿霉素:环磷酰胺的质量比为1:1:30。

5.一种用于治疗肿瘤或消除肿瘤耐药性的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由雷帕霉素类似物RAD001、阿霉素、环磷酰胺以及药学上可接受的载体组成；其中所述的肿瘤为乳腺癌，所述的雷帕霉素类似物RAD001:阿霉素:环磷酰胺的质量比为(0.9～1.1):(0.9～1.1):(28～32)。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的雷帕霉素类似物RAD001:阿霉素:环磷酰胺的质量比为1:1:30。

7.权利要求5～6任一所述的药物组合物的用途，用于制备治疗乳腺癌或消除乳腺癌耐药性的药盒。

8.一种用于治疗肿瘤或消除肿瘤耐药性的药盒，其特征在于，所述药盒包括：权利要求5～6任一所述的药物组合物。

9.如权利要求8所述的药盒，其特征在于，所述的药盒中还包括使用说明书。

10.如权利要求9所述的药盒，其特征在于，所述的使用说明书中记载了如下的化疗方案：

(1)给予受试者阿霉素和环磷酰胺，以及雷帕霉素类似物；

(2)2周后，重复步骤(1)；每二周作为一个给药周期，进行2～20个给药周期。