CN110522750B - TNFα小分子抑制剂C87在制备治疗脑胶质瘤药物方面的应用 - Google Patents

TNFα小分子抑制剂C87在制备治疗脑胶质瘤药物方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种TNFα抑制剂C87在制备治疗脑胶质瘤药物方面的应用。本研究证实了微环境中的TNFα可以通过激活下游JNK激酶和Axl激酶引发胶质母细胞瘤细胞对EGFR抑制剂的耐药，且TNFα特异性小分子抑制剂C87可显著增加胶质母细胞瘤细胞对EGFR抑制剂治疗的敏感性。相关研究结果不仅是对以TNFα为代表的炎性因子与脑肿瘤发生关系的重要补充，同时为晚期胶质母细胞瘤患者提供了新的治疗策略和备选药物，具有良好的临床应用前景和潜在的经济效益。

Description

TNFα小分子抑制剂C87在制备治疗脑胶质瘤药物方面的应用
技术领域
本发明涉及TNFα抑制剂的新用途，具体涉及TNFα小分子抑制剂C87在制备治疗脑胶质瘤药物方面的应用。
背景技术
脑胶质瘤(glioma)是最常见的中枢神经系统肿瘤，呈侵袭性生长，与正常脑组织没有明显界限，难以完全切除，对放疗化疗不甚敏感，非常容易复发，生长在大脑等重要部位的恶性肿瘤，手术难以切除或根本不能手术。化学药物和一般抗肿瘤的中药，因血脑屏障等因素的影响，疗效也不理想，因此脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一[1]。胶质母细胞瘤(glioblastoma)是WHOⅣ级胶质瘤，与其他低级别星形细胞瘤(astrocytoma,WHO Ⅱ级和Ⅲ级)、少突胶质细胞瘤(oligodendroglioma,WHO Ⅱ级和Ⅲ级)相比，恶性度更高。初诊的胶母患者的治疗手段主要是手术切除，放疗同步替莫唑胺化疗,加6个周期的TMZ序贯化疗。即便如此，胶母患者的中位总生存期也只有14.6个月，两年生存率不足26.5％,五年生存率不足5％[2]。
肿瘤的靶向治疗是以肿瘤致癌基因或其信号转导通路为治疗靶点从而达到抑制肿瘤生长的疗法，近年来取得显著疗效，已成为除手术、放疗、化疗之外的第四种治疗方法。其中，致癌基因EGFR的发现和靶向EGFR类酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的开发，是肿瘤靶向治疗发展过程中的重要里程碑。表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因C-erbB-1的编码产物，是一种跨膜蛋白。EGFR信号通路对肿瘤细胞的增殖、存活、侵袭、转移、血管新生等起重要作用。EGFR在多种肿瘤中出现突变型激活，并认为是肿瘤发生的关键诱因之一[3]；靶向EGFR的小分子抑制剂如吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)、埃克替尼(Icotinib)、拉帕替尼(lapatinib)等的出现，为无数化疗失败的晚期非小细胞肺癌患者带来了福音[4]。但随着用药时间的延长，平均9个月左右，EGFR-TKI治疗往往会出现继发耐药迹象，患者耐药后疾病迅速进展。目前关于EGFR-TKI继发耐药的解释主要有两种：一是长期用药后肿瘤细胞EGFR T790M突变的出现，激活了Axl或Met等其他受体酪氨酸激酶，导致促生长信号重新占优势[5]；二是、EGFR信号被长期抑制后，肿瘤细胞应激反馈性增强STAT3信号通路活性，抵抗EGFR信号遭抑制带来的死亡讯息[6]。在40-50％胶质母细胞瘤患者的组织中能检测到EGFR信号的高表达，多数由EGFR vⅢ型突变引起。EGFR vⅢ突变型不需要EGF配体的结合就能组成性激活EGFR下游信号转导通路，促使细胞恶性转化[7]。迄今为止，EGFR vⅢ尚未在正常人体组织中检出，被视为恶性肿瘤特异性表达的EGFR突变。鉴于EGFR抑制剂在肺癌治疗中的显著成效和胶质母细胞瘤中EGFR vⅢ突变的高检出率，人们在胶质母细胞瘤患者中进行了一系列EGFR抑制剂临床试验，但均以失败而告终，胶质母细胞瘤似乎对EGFR抑制剂类药物不敏感[8,9]。这种耐药不同于非小细胞肺癌患者长期应用同一种EGFR抑制剂后造成的继发耐药，是胶质母细胞瘤细胞初次接触EGFR抑制剂时就表现出很差的反应性，目前有关这种耐药的机制研究很少，原因不明。因此，发现胶质母细胞瘤细胞对EGFR抑制剂耐药的机制并找到克服方法，对携带有EGFR vⅢ型突变却无药可用的晚期胶质母细胞瘤患者意义重大。
发明内容
本发明中，考虑到国内EGFR-TKIs类药物中吉非替尼应用最普遍，在价格和疗效上都占绝对优势，且易通过血脑屏障，我们开展了携带有EGFRvⅢ突变的胶质母细胞瘤对吉非替尼耐药机制和相应克服策略的研究。因为U87和LN229两种胶母细胞株本身野生型EGFR表达低且几乎不携带激活型的EGFR vⅢ突变[10]，故我们首先构建了稳定过表达EGFR vⅢ的U87vⅢ和LN229vⅢ细胞株，作为本研究的主要细胞模型。我们采用了western blot、MTT、ELISA、实时定量PCR、流式检测等方法，发现胶质母细胞对吉非替尼的耐药现象可能与用药后细胞内TNFα-JNK-Axl信号的激活相关，且胶质母细胞瘤中高表达的TNFα因子进一步加剧了细胞对吉非替尼的耐药。我们研究小组前期发现了一个新型的小分子TNFα抑制剂—C87(一种取代芳香基腙类化合物，结构式如式I，优选为化合物3-苯-1-(4-苯-1，3-噻唑-2-yl)-1氢-吡唑-4，5-二酮-4-({4-氯-3-硝基苯}腙，参见申请号为200810154649.3的中国专利申请)，它能在体外有效地和特异地抑制TNF的生物学作用，并对小鼠的急性坏死性肝炎有明确的治疗效果[11]。故我们又尝试用C87与吉非替尼联用，看是否能提高胶质母细胞对吉非替尼化疗的敏感性，同时设立TNFα抗体(TNFαAb)与吉非替尼联用实验组。如我们所料，细胞实验和动物实验证实TNFα特异性小分子抑制剂C87与吉非替尼联用可显著增加吉非替尼对胶质母细胞瘤的体外和体内疗效。
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目前已上市的TNFα抑制剂主要有三类：第一类是人鼠嵌合或完全人源化的TNFα单克隆抗体，例如Infliximab(Humira)，Adalimumab(Remicade)，Golimumab(Simponi)等；第二类是TNFα单克隆抗体Fab段偶联聚乙二醇，例如Certolizumab Pegol(Cimzia)；第三类是可溶性的TNFR，例如Etanercept(Enbrel)——sTNFR2偶联免疫球蛋白Fc段。它们均为抗体类或受体类水溶性大分子蛋白制剂[12]，透过血脑屏障在脑肿瘤部位达到有效作用浓度的难度比亲脂的小分子化疗药高很多。考虑到血脑屏障的存在，选择C87与吉非替尼联用治疗胶质母细胞瘤可能比现有的TNFα抑制剂有更大的优势和临床应用前景。
虽然TNFα在固有免疫和炎症反应中的作用和信号通路已经基本阐明，但TNFα与肿瘤的关系及下游信号机制却一直没有定论。越来越多的研究表明肿瘤微环境中的TNFα在肿瘤的发生发展中起到了重要的促进作用，例如它可以促进肿瘤细胞的增殖，恶性转化，血管新生和侵袭转移等[13]。由于经典观点认为脑部是一个‘免疫豁免区’，一般血液中的抗体和免疫细胞不能穿过血脑屏障，异体组织移入脑也不会发生免疫排斥现象，而TNFα主要与免疫反应有关，因此在神经系统中关注得少。但近些年的研究表明，这种‘免疫豁免’是条件性的，尤其是在中晚期神经肿瘤中，经常会出现炎性细胞的浸润和免疫反应的发生[14]。
本研究证实了微环境中的TNFα可以通过激活下游JNK激酶和Axl激酶引发胶质母细胞瘤细胞对吉非替尼的耐药，且TNFα特异性小分子抑制剂C87可显著增加胶质母细胞瘤细胞对吉非替尼治疗的敏感性。相关研究结果不仅是对以TNFα为代表的炎性因子与脑肿瘤发生关系的重要补充，同时为晚期胶质母细胞瘤患者提供了新的治疗策略和备选药物，具有良好的临床应用前景和潜在的经济效益。
具体地，本发明首先提供了一种TNFα抑制剂在制备治疗脑胶质瘤药物方面的应用。
其中，所述TNFα抑制剂为能够透过血脑屏障在脑肿瘤部位达到有效作用浓度的小分子TNFα抑制剂。所述TNFα抑制剂通过作用于TNFα促存活信号通路、尤其是TNFα-JNK-Axl信号通路发挥作用，具体为对该信号通路发挥抑制作用。所述TNFα抑制剂优选为取代芳香基腙类化合物，最优选为C87：化合物3-苯-1-(4-苯-1，3-噻唑-2-yl)-1氢-吡唑-4，5-二酮-4-({4-氯-3-硝基苯}腙；进一步，还包括C87的衍生物或盐。
其中，所述TNFα抑制剂可以单独施用或与其他药物(如化疗药、靶向药等)联用，特别包括与EGFR-TKIs类药物的联用，最特别包括与吉非替尼的联用。
其中，所述脑胶质瘤特别包括WHOⅣ级胶质瘤，最特别包括胶质母细胞瘤。
其中，所述治疗脑胶质瘤药物特别包括改善耐药性方面的药物，最特别包括改善原发耐药性方面的药物。
本发明还提供了一种用于脑胶质瘤的药物组合，包括TNFα抑制剂和EGFR-TKIs类药物。
其中，所述TNFα抑制剂为能够透过血脑屏障在脑肿瘤部位达到有效作用浓度的小分子TNFα抑制剂。所述TNFα抑制剂通过作用于TNFα促存活信号通路、尤其是TNFα-JNK-Axl信号通路发挥作用，具体为对该信号通路发挥抑制作用。所述TNFα抑制剂优选为取代芳香基腙类化合物，最优选为C87：化合物3-苯-1-(4-苯-1，3-噻唑-2-yl)-1氢-吡唑-4，5-二酮-4-({4-氯-3-硝基苯}腙；进一步，还包括C87的衍生物或盐。所述EGFR-TKIs类药物优选为吉非替尼。所述脑胶质瘤特别包括WHOⅣ级胶质瘤，最特别包括胶质母细胞瘤。
本发明还提供了一种改善施用脑胶质瘤药物时耐药性的方法，包括在施用所述脑胶质瘤药物的同时施用TNFα抑制剂的方法。本发明所述的“同时施用”或“联用”不限于两种药物采取同样的手段在同一时间点一起使用，而是包括两种药物可以以不同方式、用量和频率等不同手段使用，并在同一时间段内同时发挥作用的情况。
其中，所述TNFα抑制剂为能够透过血脑屏障在脑肿瘤部位达到有效作用浓度的小分子TNFα抑制剂。所述TNFα抑制剂通过作用于TNFα促存活信号通路、尤其是TNFα-JNK-Axl信号通路发挥作用，具体为对该信号通路发挥抑制作用。所述TNFα抑制剂优选为取代芳香基腙类化合物，最优选为C87：化合物3-苯-1-(4-苯-1，3-噻唑-2-yl)-1氢-吡唑-4，5-二酮-4-({4-氯-3-硝基苯}腙；进一步，还包括C87的衍生物或盐。所述脑胶质瘤药物包括WHOⅣ级胶质瘤药物，进一步包括胶质母细胞瘤药物；还包括EGFR-TKIs类药物，更进一步包括吉非替尼。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1：胶质母细胞对吉非替尼耐药现象与用药后细胞内TNFα信号的激活相关。
图2：外源TNFα因子刺激能导致胶质母细胞对吉非替尼耐受。
图3：TNFα在星形细胞瘤病人和胶质母细胞瘤病人瘤组织中的表达情况。
图4：C87与吉非替尼联用显著提高了胶质母细胞瘤细胞对吉非替尼治疗的敏感性。
图5：C87与吉非替尼联用的体内疗效结果。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体附图对本发明进行详细描述。
一、实验方法
1.1实验材料：
人胶质母细胞瘤细胞株U87及LN229购自美国ATCC细胞库。15例低级别星形细胞瘤组织和16例胶质母细胞瘤组织来自本院脑系肿瘤科2014年6月-2016年6月收治的、术后有明确病理诊断的胶质瘤初诊患者。研究对象均签署知情同意书，且本研究获得天津医科大学肿瘤医院伦理委员会的批准。EGFR vⅢ病毒购自吉凯基因公司，按说明书感染U87和LN229细胞株并稳定筛选两周后备用。吉非替尼(Gefitinib)购自Selleck公司，C87购自Tocris和Specs公司，TNFα因子购自Peprotech公司，TNFα中和抗体购自R&D公司。EGFR、pEGFR、pAxl、Axl、pJNK、JNK、GAPDH的抗体均购自Cell Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体、山羊抗兔IgG抗体购自碧云天公司。人TNFαELISA检测试剂盒购自Elabscience公司，蛋白超滤浓缩柱购自Millipore公司。Trizol、逆转录试剂盒、oligo dT18、dNTP、DEPC、RNA酶抑制剂购自Invitrogen公司，实时荧光定量PCR(Q-PCR)试剂盒购自Takara公司。细胞基础培养基、胎牛血清及胰蛋白酶均为Gibco公司产品。MTT、DMSO购于Sigma公司。ECL免疫印迹底物、BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司，硝酸纤维素膜购自Millipore公司，RIPA裂解液、PMSF、柯达底片购自碧云天公司。甘氨酸、巯基乙醇、Tris碱购自上海生物工程有限公司，甲醇、乙醇、异丙醇、氯仿等有机试剂购自天津市化学试剂批发公司。GAPDH及TNFα的Q-PCR引物序列摘自文献[15,16]，由英骏(Invitrogen)生物技术有限公司合成，序列如下：
GAPDH-F:5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3；
GAPDH-R:5-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3；
TNFα-F:5-AGCCCATGTTGTAGCAAACC-3；
TNFα-R:5-TGAGGTACAGGCCCTCTGAT-3。
1.2药物处理后细胞存活比率(Percentage viability)测算：
肿瘤细胞株均用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞每三至四天传代一次。取对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化后配成单细胞悬液，调整细胞密度至2-5×103/ml接种于96孔板，每孔100μL，培养24小时待细胞贴壁后分为对照组和若干实验组。对照组加入同等比例的DMSO，实验组加入相应浓度的不同药物，每组设3个复孔。实验中同时设置空白组，空白组与对照组操作完全一样，只是没有细胞。在37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中继续培养48小时。每孔加入20μlMTT(5mg/ml)继续作用4小时。弃上清，按100μl/孔加入DMSO，震荡3min使沉淀充分溶解，在酶标仪上测定波长546nm时的OD值。细胞存活比率＝(实验组OD值－空白组平均OD值)/(对照组平均OD值－空白组平均OD值)×100％。
1.3 Western blot印迹法：
取对数生长期的肿瘤细胞，分为对照组和若干实验组，分别加入不同的药物组合，至细胞培养箱中孵育24或48小时。到时间点后，直接吸去培养基，冷PBS洗2次，加细胞裂解液RIPA，冰上裂解15min。用细胞刮收集细胞裂解液，离心，4℃，10000rpm，10min。取上清，即得细胞总蛋白。取出10μl，用于BCA法测定蛋白浓度，剩下的蛋白液用5×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸5min。10％SDS PAGE胶电泳90分钟，电泳结束后进行转膜，时间60分钟。用含5％脱脂奶粉的TBST在室温下封闭1小时。一抗4℃孵育过夜(稀释比例1:1000-1:5000)。TBST漂洗三次，每次十分钟。二抗室温孵育1小时(稀释比例为1:5000)。TBST漂洗三次，每次十分钟。将ECL底物液淋在NC膜上，进入暗室，曝光、显影。
1.4肿瘤组织RNA提取、逆转录及实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测：
从负八十冰箱取出病人脑肿瘤组织(每例约50mg)置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置5min，之后依次加入氯仿萃取、异丙醇沉淀、乙醇洗涤，加入无RNA酶的去离子水溶解后得细胞总RNA。按Invitrogen逆转录试剂盒说明书逐步操作将RNA逆转录成总cDNA。从逆转录产物中取出2μL，稀释十倍后用作后续Q-PCR的扩增模板。Q-PCR循环参数：95℃10秒，95℃5秒，60℃40秒，共40个循环。实时定量完成后，以人的GAPDH基因作为内参，采用ABI7500自带软件进行数据分析。
1.5 ELISA试剂盒检测TNFα浓度：
收集吉非替尼处理EGFR vⅢ细胞不同时间段的培养上清，经蛋白超滤浓缩柱浓缩至500μl。每组取100μL TNFα标准品或100μL细胞培养上清加入事先包被好TNFα抗体的酶标板上，37℃孵育90分钟，每组设三个复孔。去除上步液体后，加入生物素化的抗人TNFα抗体100μL，37℃孵育60分钟。弃上清，加洗液洗涤三次。加入辣根过氧化物酶标记的亲和素100μL，37℃孵育30分钟。弃上清，加洗液洗涤五次。加90μL显色底物液(TMB)，37℃孵育15分钟，酶标板显蓝色，加50μL终止液后变成黄色。立即用酶标仪在450nm波长处测OD值，TNFα浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中TNFα的浓度。
1.6免疫组化实验：
1)将石蜡切片置于烤片机65度烘烤2-3h。2)常规脱蜡：二甲苯20min--二甲苯20min--二甲苯10min--无水乙醇10min--无水乙醇10min--95％乙醇10min--80％乙醇10min。3)EDTA法抗原修复2min30s。4)自然冷却至室温后，3％H2O2封闭过氧化物酶。5)凉清水冲洗多次，血清封闭。6)加一抗，盖过组织，可用枪头划匀抗体至组织边缘以外，防止边缘效应。放入4℃冰箱过夜。7)加二抗，放入37℃孵箱，孵育30min。8)加入辣根过氧化物酶偶联的链霉卵白素工作液，盖过组织，放入37℃孵箱，孵育20min。9)加DAB显色液显色。10)放入苏木精罐复染5min。11)1％盐酸酒精分化。12)氨水返蓝。13)脱去细胞中的水分:80％乙10min--95％乙醇10min--无水乙醇10min*2--二甲苯10min*2。14)树脂封片。
1.7流式细胞术：
分别加入不同的药物组合至细胞培养箱中孵育24小时或48小时。收集细胞制成单细胞悬液，冰预冷的PBS洗两遍后，用100μl Binding Buffer将待测细胞的密度调整为5×105-1×106细胞悬液。加入5μl FITC-AnnexinV标记液和5μl PI，轻轻混匀。避光室温染色15min。Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。在处理和标记时，尽可能在暗处进行。再补400μl Binding Buffer，流式细胞仪(BD公司的LSRⅡ)测定各组细胞发生凋亡的百分数。
1.8小鼠成瘤实验(人胶质瘤异种移植模型)：
所有小鼠实验均经天津医科大学肿瘤研究所和医院动物保护与使用机构委员会批准。每只裸鼠右侧皮下注射GBM细胞(1×106)。当移植瘤体积约为50mm3时，将小鼠随机分为对照组和实验组(每组6只小鼠)，用指定药物治疗16天。每两天用卡钳测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，公式为:体积＝(长×宽2)/2。当肿瘤体积超过2000mm3时，或治疗到达16天，对小鼠实施安乐死。用10％福尔马林固定肿瘤组织，石蜡包埋肿瘤。1.9统计学方法：组间均数比较应用GraphPad Prism 7软件分析数据，p<0.05为差异有统计学意义。
二、实验结果
2.1胶质母细胞对吉非替尼耐药的现象与用药后细胞内TNFα信号的激活相关。
考虑到U87和LN229两种胶母细胞株本身野生型EGFR表达低且几乎不携带激活型的EGFRvⅢ突变，故我们首先构建了稳定过表达EGFRvⅢ的U87vⅢ和LN229vⅢ细胞株，作为本研究的主要细胞模型(见图1A)。从图1B可以看出，低于12μM的吉非替尼并没有对U87vⅢ或LN229vⅢ细胞产生明显的杀伤效果，即使这两种细胞携带明显的EGFR突变且磷酸化EGFR信号已经得到有效抑制(图1A和图1C)。上述结论与绝大多数胶母患者对EGFR抑制剂类靶向药无效的现象一致，即胶质母细胞瘤对多种EGFR抑制剂耐药，但耐药机制尚不明确。我们用2μM吉非替尼处理U87vⅢ和LN229vⅢ细胞系不同时间点进行western蛋白检测发现，随着药物处理时间的延长，虽然磷酸化EGFR信号一直被抑制且处于较低水平，但胞内促存活激酶Axl和其上游JNK激酶的活化水平逐渐增强(图1C)，提示短时间内有新的促存活信号通路出现替代了原有的EGF/EGFR信号通路，细胞得以持续生存。因为TNFα因子是已知最强的JNK激酶上游激活因子之一，故我们用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测了2μM和12μM吉非替尼处理U87vⅢ或LN229vⅢ细胞不同时间点后培养上清中TNFα蛋白含量的变化，发现TNFα蛋白含量随时间延长逐渐上升，呈现剂量依赖性。在48小时达到峰值，是未处理组含量的约8～10倍(图1D)。我们还用了Q-PCR的方法检测了2μM吉非替尼处理U87vⅢ或LN229vⅢ细胞4和24小时后，细胞内TNFαmRNA表达量的变化，发现TNFα蛋白表达的上升可能是源于转录水平的增强(图1E和图1F)。总之，这些结果提示我们，胶质母细胞对吉非替尼的耐药现象可能与用药后细胞内TNFα-JNK-Axl信号的激活相关。
2.2外源TNFα因子刺激能导致胶质母细胞对吉非替尼耐受。
为了证实TNFα直接参与了胶质母细胞对吉非替尼的耐药，我们用TNFα因子(1ng/ml)与吉非替尼25μM处理U87vⅢ或LN229vⅢ细胞(如图2A和图2B)。我们发现，单用1ng/mlTNFα因子对两种细胞的存活率没有影响；单用25μM的吉非替尼可以使U87vⅢ细胞的存活率降至(51.2±4.4)％，或LN229vⅢ细胞的存活率降至(55.4±5.7)％；但1ng/ml TNFα因子和25μM吉非替尼同时加入细胞后，吉非替尼的杀伤作用便明显减弱，U87 vⅢ细胞的存活率变为(81.6±4.0)％(与吉非替尼单处理组相比，P＝0.0087)，LN229 vⅢ细胞的存活率变为(84.9±3.7)％(与吉非替尼单处理组相比，P＝0.0040)。上述数据表明，高剂量的TNFα因子甚至可以使胶母细胞原本对吉非替尼的微弱反应性变得更差，从另一个角度证明TNFα因子在胶质母细胞瘤对吉非替尼的耐药中发挥了重要作用。
2.3 TNFα在脑胶质瘤中的表达情况。
我们收集了15例低级别(Ⅱ-Ⅲ级)星形细胞瘤病人(1#-15#)和16例胶质母细胞瘤病人(16#-31#)的术后瘤组织，提取RNA并逆转录成cDNA后采用实时定量PCR(Q-PCR)的方法检测两个病人群体中TNFαmRNA表达量的高低，发现胶质母细胞瘤病人瘤组织TNFα表达量明显高于低级别星形细胞瘤病人(图3A，P<0.0001)。这31例患者均为本科室收治的胶质瘤初诊患者，术前未行放化疗、生物治疗或其他靶向治疗，术后有明确病理诊断，两个群体的性别比例、年龄跨度均相近。此外,TNFα蛋白水平与基因表达数据一致,TNFα蛋白质通常在胶质母细胞瘤组高于星形细胞瘤组(图3B)。因为胶质母细胞瘤组织中往往伴随较大面积的缺血性坏死和炎性细胞的浸润，而TNFα是机体固有免疫和炎症反应最重要、最常见的调节因子，这可能是胶母组织TNFα含量高的原因之一。
2.4 C87与吉非替尼联用显著提高了胶质母细胞瘤细胞对吉非替尼治疗的敏感性。
我们采用C87与吉非替尼联用，MTT法检测是否能提高胶质母细胞对吉非替尼化疗的敏感性，同时设立TNFα抗体(TNFαAb)与吉非替尼联用实验组。如图4A和图4B所示，单用C87(2.5μM)或TNFα抗体(1μg/ml)或吉非替尼(2μM)处理U87vⅢ或LN229vⅢ细胞，细胞存活率几乎没有变化(均在90％以上)；而C87与吉非替尼联用组可使U87vⅢ细胞存活率降至(41.3±2.5)％(与吉非替尼单处理组相比，P＝0.0027)，可使LN229vⅢ细胞存活率降至(45.6±3.4)％(与吉非替尼单处理组相比，P＝0.0004)；TNFα抗体与吉非替尼联用组取得了类似的效果，P值与吉非替尼单处理组相比分别为0.0074(U87vⅢ)和0.0065(LN229vⅢ)。图4C的细胞凋亡和统计图得出的结论跟MTT方法类似。图4D的光镜图更直观地说明了TNFα抑制剂与吉非替尼联用的效果。Control组、C87组、TNFα抗体组、吉非替尼组U87vⅢ细胞生长状态良好，绝大多数细胞为长梭形，边缘清晰，细胞折光度也较好；而C87与吉非替尼联用组或TNFα抗体与吉非替尼联用组U87vⅢ细胞已经死亡过半，镜下可见很多细胞死亡后的残骸与细胞碎片。我们又用western blot的方法检测了2μM吉非替尼联合C87(2.5μM)或TNFα抗体(1μg/ml)处理U87vⅢ细胞系48小时后细胞内激酶水平变化，发现C87的加入或TNFα抗体的加入明显地抑制了吉非替尼用药后Axl激酶、JNK激酶的磷酸化激活(图4E)。上述数据表明，C87与吉非替尼联用可显著增加胶质母细胞对吉非替尼化疗的敏感性。
2.5 C87与吉非替尼联用的体内实验
C87与吉非替尼联用可显著增加吉非替尼的体内疗效。这个实验是将U87vⅢ或LN229vⅢ细胞注射到裸小鼠右腹皮下，待肿瘤长到一定体积后，小鼠分成四组:溶剂对照组，吉非替尼，C87，及吉非替尼/C87联用组。虽然吉非替尼和C87作为单一疗法略微降低了肿瘤的生长，但联合用药明显比单独使用任何一种药物更有效(图5A和5B)。此外，Ki67免疫组化染色显示，联合用药抑制肿瘤细胞增殖的作用强于单一药物(图5C)。联合治疗组可将U87vⅢ肿瘤的Ki67指数降至9.0±4.6％(P<0.01,与吉非替尼单药组相比)；将LN229vⅢ肿瘤的Ki67指数降至12.6±3.9％(P<0.01,与吉非替尼单药组相比)。总之，我们的体内实验也表明联合抑制TNFα信号通路能显著改善表皮生长因子受体抑制剂对胶质母细胞瘤患者的疗效。
本发明中涉及的参考文献如下：
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以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种TNFα小分子抑制剂C87和EGFR-TKIs类药物的联用药物在制备治疗胶质母细胞瘤药物方面的应用，
所述C87为： 3-苯-1-(4-苯-1，3-噻唑-2-yl)-1氢-吡唑-4，5-二酮-4-({4-氯-3-硝基苯}腙，
所述EGFR-TKIs类药物为吉非替尼。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗胶质母细胞瘤药物包括改善耐药性方面的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗胶质母细胞瘤药物包括改善原发耐药性方面的药物。
4.一种用于胶质母细胞瘤的药物组合物，包括TNFα抑制剂C87和EGFR-TKIs类药物吉非替尼，所述C87为： 3-苯-1-(4-苯-1，3-噻唑-2-yl)-1氢-吡唑-4，5-二酮-4-({4-氯-3-硝基苯}腙。
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