CN110974835A

CN110974835A - 雷公藤红素在抑制肿瘤血管生成拟态中的应用

Info

Publication number: CN110974835A
Application number: CN201911380207.5A
Authority: CN
Inventors: 高伟; 王蕾; 朱迎君; 刘喜红
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2020-04-10

Abstract

本发明首次阐明了雷公藤红素对胶质瘤血管生成拟态的抑制作用及机制，PAS‑CD31双染法观察雷公藤红素能抑制裸鼠肿瘤组织VM的形成，且能降低裸鼠胶质瘤拟态相关蛋白EphA2、VE‑cadherin的表达，体外实验中验证雷公藤红素通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制U87、U251胶质瘤细胞VM形成的作用。

Description

雷公藤红素在抑制肿瘤血管生成拟态中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤的治疗领域，具体为通过抑制胶质瘤的血管生成拟态来抑制胶质瘤。

背景技术

在恶性胶质瘤中，存在一种高度侵袭性的肿瘤细胞模拟内皮细胞形成的管腔样结构——血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)。体内VM具有以下特点：血管壁主要由肿瘤细胞构成；管腔内无内皮细胞，而是一层基底膜样结构，VM周围很少见到肿瘤中心性坏死现象，管腔内可见红细胞、血小板等存在，可见VM具有类似于内皮血管的供血功能。过碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain，PAS)-血小板-内皮细胞粘附分子(platelet ECadhesion molecule-31，PECAM-1/CD31)双重染色显示，PAS阳性、CD31阴性。

VM的形成是一个复杂的生物学过程，受多种信号通路和与肿瘤细胞的转移、侵袭相关的细胞外基质重塑因子的调控。如血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelialcadherin，VE-cadherin)上皮细胞激酶(EPH receptor A2，EphA2)，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α，但是具体的调控机制目前仍不清楚。VE-cadherin是一种特异表达在内皮细胞上的跨膜蛋白，能够促进同类型的细胞相互作用，在血管生成中起重要作用。研究发现：侵袭性的黑色素瘤细胞表达VE-cadherin，但是非侵袭性的黑色素瘤细胞则不表达，表明VE-cadherin在黑色素瘤VM形成中发挥着重要作用。在VM的形成中，VE-cadherin主要通过介导EphA2来发挥作用，EphA2是肝配蛋白受体家族的一员，并且在转移型黑色素瘤细胞中表达。EphA2与膜表面的配体相互作用使EphA2磷酸化，磷酸化的EphA2通过FAK和细胞外信号调节激酶(extra cellular signal-regulated kinase，ERK)1/2激活PI3K，最终MMP2激活Ln-5γ2裂解从而导致VM形成。去甲斑蝥素通过抑制PI3K/MMPs/Ln-5γ2信号通路，在体内外实验中抑制了胆囊癌中VM形成和肿瘤生长。PI3K抑制剂LY294002和放疗联用，能够在体内外下调PI3K/MMPs/Ln-5γ2信号轴，抑制VM形成，从而导致胰腺癌细胞生长和转移能力受抑制。姜黄素同样可下调EphA2/PI3K/MMPs信号轴，有效地抑制脉络膜黑色素瘤中VM的形成。根据上述机制，通过靶向基因敲除、药物干扰等技术来抑制PI3K/蛋白激酶B(proteinkinaseB，Akt)通路从而抑制VM形成，能够提高肿瘤细胞的治疗效果。

雷公藤红素是卫矛科植物雷公藤根中提取的三萜类化合物，分子量为450.61g/mol，可用于治疗癌症。雷公藤红素的抗癌作用通过细胞毒性、促调亡作用和抗肿瘤血管生成等实现。雷公藤红素能抑制线粒体呼吸链复合物II，致活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)大量积聚于癌细胞内。ROS能诱导核酸、蛋白及脂质氧化损伤，ROS聚积能释放线粒体内细胞色素而诱导细胞凋亡。雷公藤红素可上调人骨肉瘤细胞中促凋亡蛋白Bax和细胞色素c的表达，改变Bax与Bcl-2的比例，诱发线粒体凋亡途径；可激活胞质内细胞凋亡蛋白酶(caspase)3和9，促进聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)裂解，诱导人骨肉瘤细胞凋亡。雷公藤红素能诱导前列腺癌细胞发生自噬作用。雷公藤红素能抑制人胃腺癌细胞AGS和YCC-2细胞的迁移，使细胞周期阻滞于G1期，通过上调凋亡和自噬的同源蛋白质来促进凋亡和自噬。雷公藤红素通过降低磷酸化Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、S6K的表达，促进AMPK的磷酸化。

前期实验证实雷公藤红素能抑制胶质瘤细胞C6、U87、U251的生长，使细胞周期阻滞在G2/M期，并促进胶质瘤细胞的凋亡和保护性自噬。雷公藤红素抑制胶质瘤生长的机制有待深入研究，胶质瘤细胞的高度侵袭性和血管生成是其恶性度的主要表现，因此，本课题将进一步研究雷公藤红素对恶性胶质瘤血管生成的影响及机制。研究发现，雷公藤红素能通过阻碍细胞DNA合成及抑制内皮细胞上的血管内皮生长因子受体(vascularendothelial growth factor receptor，VEGFR)的表达来限制内皮增殖，抑制肿瘤血管新生。雷公藤红素抗肿瘤转移的作用能通过降低HIF-1α的表达，抑制血管生成相关通路如Akt/mTOR/p70S6K，抑制MMPs来实现。在骨髓内皮祖细胞(bone marrow-epithelialprogenitor cells，BM-EPCs)中，雷公藤红素通过抑制VEGF的分泌来发挥抗血管生成作用，同时能抑制细胞活性，细胞间粘附，细胞-细胞外基质粘附，迁移和细胞血管腔的形成。此外，黄煜伦等人证实雷公藤红素能抑制胶质瘤细胞中VEGFR2、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和Akt的磷酸化。

众多血管生成途径和VM的存在是单一抗肿瘤抗血管生成的靶向疗法无法有效提高患者生存期的主要原因，目前亟待寻找一种能通过多种途径抑制胶质瘤血管生成的方法。以往研究发现雷公藤红素可以抑制胶质瘤裸鼠肿瘤的生长和微血管增生，但其具体作用机制不明，有待进一步研究。本课题通过动物实验，运用光镜、电镜、免疫组化、免疫荧光、分子生物学等技术观察雷公藤红素对胶质瘤原位异种移植模型微血管结构，血管生成及拟态形成密度，相关促血管生成因子及体外验证雷公藤红素对胶质瘤细胞拟态形成的调节和机制研究来证实雷公藤红素抑制胶质瘤血管生成及拟态形成的作用。

发明内容

本发明的一个方面是提供一种雷公藤红素抑制肿瘤血管生成拟态的应用，所述的应用是将雷公藤红素制备成抑制肿瘤血管生成拟态的药物，在一个具体的实施例中，所述的肿瘤为胶质瘤。

本发明的另外一个方面是提供一种雷公藤红素抑制肿瘤血管生成拟态的标志物VE-cadherin和/或EphA2表达的应用，所述的应用是将雷公藤红素制备成抑制VE-cadherin和/或EphA2表达的药物；在另外的一个具体的实施例中，所述的肿瘤为胶质瘤。

本发明的另外一个方面是提供一种治疗肿瘤的药物组合物，其中所述的药物组合物包括雷公藤红素与PI3K抑制剂。在一个具体的实施例中，所述的肿瘤是胶质瘤；在另外一个具体的实施例中，所述的PI3K抑制剂为LY294002。

本发明的另外一个方面是雷公藤红素与PI3K抑制剂共同制备抑制肿瘤血管生成拟态的药物中的应用，在一个具体的实施例中，所述的肿瘤是胶质瘤；在另外的一个具体实施例中，所述的PI3K抑制剂为LY294002。

本发明的另外一个方面是雷公藤红素与PI3K抑制剂共同制备抑制VE-cadherin和/或EphA2表达的药物的应用，在一个具体的实施例中，所述的PI3K抑制剂为LY294002。

本发明的优点在于

1，第一次阐述雷公藤红素对胶质瘤拟态的抑制作用及机制。PAS-CD31双染法观察雷公藤红素能抑制裸鼠肿瘤组织VM的形成，且能降低裸鼠胶质瘤拟态相关蛋白EphA2、VE-cadherin的表达。体外实验中验证雷公藤红素通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制U87、U251胶质瘤细胞VM形成的作用。

2.作为一种药物，雷公藤红素可以靶向性地作用于癌细胞，有效控制控制癌细胞的增殖，并不影响正常的胶质细胞。

3.雷公藤红素可以与PI3K抑制剂协同作用，起到更好的抑制胶质瘤VM形成以及抑制VM标志物VE-cadherin的表达的作用。

附图说明

图1：电镜观察肿瘤浸润区微血管结构，雷公藤红素能破坏肿瘤组织内的微血管结构。

图2：PAS-CD31双染法观察雷公藤红素对裸鼠肿瘤组织VM形成的影响，雷公藤红素能降低VM血管密度，且能降低CD31标记的内皮血管密度。

图3：雷公藤红素能降低对裸鼠胶质瘤血管新生相关蛋白CD31、VEGFR2、Ang2、VEGFA的表达。

图4：雷公藤红素能降低裸鼠胶质瘤拟态相关蛋白EphA2、VE-cadherin的表达。

图5：雷公藤红素能降低裸鼠脑组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表达水平。

图6：雷公藤红素抑制U87、U251胶质瘤细胞影响，A:雷公藤红素0.5，1μM能抑制U87、U251细胞增殖且不影响正常的星形胶质细胞的活性；B-D:雷公藤红素1μM能抑制显著抑制U87、U251细胞迁移、侵袭。

图7：雷公藤红素对U87、U251细胞VM的形成和拟态标志蛋白VE-cadherin表达的影响，A-B:在0.25-1_μM的浓度范围内，随着雷公藤红素的浓度提升，显著抑制U87、U251细胞VM的形成；C-D:在0.25-1_μM的浓度范围内，随着雷公藤红素的浓度提升，显著抑制U87、U251细胞VM的形成标志物VE-cadherin表达。

图8：雷公藤红素能抑制p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达。

图9：雷公藤红素和PI3K抑制剂LY294002/AKT激动剂SC79分别对p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达的影响，A:结果显示雷公藤红素与LY294002相似，均能够抑制p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达；B结果显示，AKT激动剂SC79则是促进了p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达，而雷公藤红素则抑制了SC79的促进作用。

图10：雷公藤红素和PI3K抑制剂LY294002/AKT激动剂SC79共同作用，LY294002能显著降低而AKT激动剂SC79显著升高VM形成和VE-cadherin的表达，雷公藤红素与其联合使用增加了LY294002的抑制作用，逆转了SC79的促进作用。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1实验材料及方法

1、实验材料

1)药物准备

取8.05mg的雷公藤红素溶于402.5μlDMSO中，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成母液，PBS梯度稀释制成雷公藤红素高剂量(Celastrol high dose，Cel-H 2mg/kg)组，中剂量(Celastrol medium dose，Cel-M 1mg/kg)组和低剂量(Celastrol low dose，Cel-L0.5mg/kg)组，DMSO含量为1％。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)35mg溶于175μl的DMSO中，然后配置成17.5ml的TMZ溶液20mg/kg)。

LY294002：LY294002是PI3K的一种体内高度选择性抑制剂。使用50μM浓度时，可特异性减弱PI3K活性，但不会抑制其他脂质和蛋白激酶。本实验将98μl DMSO中放入1.5mgLY294002配制成50mM原液。使用时用完全培养基稀释成50μM。

SC79：取50μlDMSO溶解5mgSC79后，用MEM不完全培养基制备成10mM的母液备用，使用时用完全培养基稀释成8μg/ml。

2)细胞来源

U87，U251人胶质瘤细胞株由中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心提供。

3)实验动物

健康雄性裸鼠42只，SPF级动物，体重18～22克，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0011]，由首都医科大学实验动物中心按SPF级动物饲养。

2、样品采集及处理方法

1).动物模型建立

经吸入式异氟烷麻醉后，将裸鼠俯卧在手术台上，固定于立体定向仪上，两耳针深入外耳道对称固定。常规消毒、铺无菌洞巾。内毗连线与头部矢状中线交汇处纵向1cm长头皮切口，分离暴露颅骨。选取裸鼠右侧脑尾状核区为靶点，根据裸鼠头部立体定向解剖图谱确定对应于右脑尾状核的钻孔位置：冠状缝与正中矢状线交点前1.0mm，中线右2.0mm，硬脑膜下3mm。用牙科钻钻一直径lmm的小孔，深达硬脑膜表面而不刺破硬脑膜，将连接于定位仪上的微量注射器的针尖调节至触及硬脑膜，进针3.5mm，后退0.5mm，使针尖距硬脑膜为3mm。将细胞悬液5μl(细胞数为5×10⁵个)，缓慢注入脑内，注射时间10min，留针5min后，缓慢退针，立即用无菌骨蜡封闭骨孔，缝合皮肤，切口青霉素涂抹消毒。

2)处理方法

将裸鼠随机分为6组(每组n＝7只)：假手术(sham-operated，sham)组、模型(model，MO)组、TMZ组、Cel-H、M、L组。造模后第5天开始，Sham组和MO组腹腔注射含1％DMSO的PBS溶液，其他各组注射相应药物，0.1ml/10g，隔天一次，注射2周。观察裸鼠发病情况，检测体重及神经系统症状变化。造模第19天每组随机取4只进行MRI扫描，记录肿瘤体积，当天所有动物取脑，检测指标。

3)CCK8检测细胞存活率方法

将U87,U251和星形胶质细胞(1.0×10⁴)接种于96孔板中培养24h,加入雷公藤红素(0.125,0.25,0.5,1and 2μM)培养24h and 48h后加入cck8试剂，检测450nm处各孔板的吸光度(optical density,OD)4)Transwell

Transwell迁移和侵袭实验Transwell迁移实验：将2×10⁴个肿瘤细胞无血清种植于24孔板的Transwell小室内，培养孔板中加入500μl含有10％FBS的MEM培养基，分别加入0.25,0.5and 1μM雷公藤红素培养24h后，小室经4％多聚甲醛固定，0.5％结晶紫染色后，用棉签擦拭掉上层细胞，计算迁移细胞数，侵袭实验的小室需要提前铺Matrigel基质胶后，再进行细胞接种，其余步骤同Transwell迁移实验。

5)划痕实验

将肿瘤细胞无血清话培养24h后，待细胞长满皿低，用200μl的无菌枪头在细胞表层画一条直线划痕，拍照后计算划痕面积，记为S₀，加入雷公藤红素(0.25,0.5and 1μM)，继续培养24h后进行划痕拍照，记为S₂₄。细胞迁移面积＝S₀-S₂₄

6)western blotting

肿瘤组织边缘的组织和细胞经RIPA裂解液裂解后，离心取上清液，用BCA蛋白试剂盒进行定量后，在SDS-PAGE中电泳，而后电转到PVDF膜上，封闭1h后，孵育上一抗过夜，第二天，TBST洗膜后进行二抗孵育，曝光条带。用ImgeJ统计各条带灰度值。

实施例2以U87人胶质瘤细胞建立裸鼠脑胶质瘤原位异种接种模型，观察雷公藤红素抑瘤作用。

2.1电镜观察肿瘤浸润区微血管结构的变化(结果如图1所示)；随着给药的浓度提高(0.5-2mg/ml)，可见雷公藤红素显著破坏胶质瘤中的血管结构。

2.2PAS-CD31双染法观察雷公藤红素对裸鼠肿瘤组织VM形成的影响；

先进行CD31免疫组化染色，石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，封闭，抗体孵育，DAB显色，再行PAS染色：

高碘酸染色：切片入高碘酸染液中染色15分钟，自来水洗，蒸馏水洗两遍；

雪弗染色：切片入雪弗染液30分钟，避光，流水冲洗5分钟；

苏木素细胞核染色，封片，显微镜下观察，拍照，分析。

计算随机5个视野内的PAS(+)、CD31(-)拟态血管数量。结果如图2所示，可见雷公藤红素能降低VM血管密度，且能降低CD31标记的内皮血管密度。

2.3检测裸鼠脑胶质瘤脑组织中CD31、VEGFR2、促血管生成素(Angiopoietin，Ang)2Ang2、VEGFA的表达，观察雷公藤红素对裸鼠胶质瘤血管新生相关蛋白表达的影响；结果如图3所示。图中可以看出雷公藤红素能降低对裸鼠胶质瘤血管新生相关蛋白CD31、VEGFR2、Ang2、VEGFA的表达。

2.4检测裸鼠脑组织中EphA2、VE-cadherin的表达，观察雷公藤红素对裸鼠胶质瘤拟态相关蛋白表达的影响。结果如图4所示，雷公藤红素能降低裸鼠胶质瘤拟态相关蛋白EphA2、VE-cadherin的表达。

2.5检测裸鼠脑组织中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表达，观察雷公藤红素对PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响。结果如图5所示，雷公藤红素能降低裸鼠脑组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表达水平。

实施例3雷公藤红素抑制U87、U251胶质瘤细胞VM形成的作用及机制研究

3.1CCK8法分析雷公藤红素对U87、U251细胞活性的影响。结果见图6A所示，可见0.5，1μM能抑制U87、U251细胞增殖且不影响正常的星形胶质细胞的活性。

3.2划痕实验，Transwell小室迁移、侵袭实验观察雷公藤红素最佳剂量对U87、U251细胞迁移、侵袭性的影响。结果见图6B-D所示，雷公藤红素1μM能抑制显著抑制U87、U251细胞迁移、侵袭。

3.3光镜观察U87、U251细胞VM的形成及VE-cadherin表达的影响；

1)观察U87、U251细胞VM形成情况

实验准备：-20℃储存的Matrigel基质胶前一天取出在4℃解冻，提前预冷24孔板，枪头，PBS缓冲液，细胞完全培养基；

所有操作在冰上进行，使用提前预冷的枪头每孔加入200μlMatrigel基质胶，避免气泡，周围孔加PBS；

将培养板小心放入细胞培养箱30分钟，等待基质胶的凝固；

取对数生长期的细胞，PBS冲洗，胰酶消化，离心，PBS洗涤细胞，完全培养基重悬，计数，调整细胞浓度为2×10⁵个/ml；

取出含有Matrigel基质胶的培养板，每孔加入100μl细胞悬液，注意避免气泡，枪头不穿透基质胶凝固层表面；

将培养板小心放入细胞培养箱，24小时后，显微镜拍照，观察肿瘤细胞自身成环的能力，并在×20视野下，随机选取5个视野，统计成管数量。

结果如图7所示，A-B:在0.25-1μM的浓度范围内，随着雷公藤红素的浓度提升，显著抑制U87、U251细胞VM的形成；C-D:在0.25-1μM的浓度范围内，随着雷公藤红素的浓度提升，显著抑制U87、U251细胞VM的形成标志物VE-cadherin表达。

2.4检测雷公藤红素通过PI3K/Akt/mTOR对VM形成及VE-cadherin蛋白表达的调控。

1)雷公藤红素能抑制p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达，图8所示，在1μM浓度的下，雷公藤红素显著抑制p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达；

2)雷公藤红素与PI3K抑制剂LY294002：

雷公藤红素与LY294002相似，均能够抑制p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达(图9A)

3)雷公藤红素与AKT激动剂SC79

AKT激动剂SC79则是促进了p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达，而雷公藤红素则抑制了SC79的促进作用(图9B)

2.5雷公藤红素与与PI3K抑制剂/AKT激动剂作用于VM形成以及VE-cadherin的表达。

PI3K抑制剂LY294002能显著降低而AKT激动剂SC79显著升高VM形成和VE-cadherin的表达，说明该通路参与到VM形成中。而雷公藤红素和SC79合用能明显降低VM形成和VE-cadherin的表达，证实雷公藤红素通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制血管拟态的形成(图10)。

Claims

1.一种雷公藤红素在制备抑制肿瘤血管生成拟态药物中的应用，所述的肿瘤为胶质瘤。

2.一种雷公藤红素抑制肿瘤血管生成拟态的标志物VE-cadherin和/或EphA2表达的药物中的应用，所述的肿瘤为胶质瘤。

3.一种治疗肿瘤的药物组合物，其中所述的药物组合物包括雷公藤红素与PI3K抑制剂。

4.权利要求3所述的药物组合物，所述的肿瘤是胶质瘤。

5.权利要求3或4所述的药物组合物，所述的PI3K抑制剂为LY294002。

6.雷公藤红素与PI3K抑制剂共同制备抑制肿瘤血管生成拟态的药物中的应用。

7.权利要求6所述的应用，所述的肿瘤是胶质瘤。

8.权利要求6或7所述的应用，所述的PI3K抑制剂为LY294002。

9.雷公藤红素与PI3K抑制剂共同制备抑制VE-cadherin和/或EphA2表达的药物的应用。

10.权利要求9所述的应用，所述的PI3K抑制剂为LY294002。