CN102349917A

CN102349917A - 一种雷公藤红素的用途及制备方法

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Publication number: CN102349917A
Application number: CN2011102347728A
Authority: CN
Inventors: 傅瑾; 杨隆河; 邱彦; 陈玲; 朱程刚; 任杰; 刘祖国; 黄锐
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2011-08-16
Filing date: 2011-08-16
Publication date: 2012-02-15

Abstract

本发明公开了一种雷公藤红素的用途及制备方法。雷公藤红素可用于制备治疗脑胶质瘤的药物。一种雷公藤红素的制备方法包含以下步骤：(1)将雷公藤地上藤本部分与地下根部分混合粉碎处理后，经乙醇回流提取，过滤后减压浓缩；(2)将浓缩后的乙醇提取物用乙醇水超声混悬，静置后，倾倒出上清液；(3)上清液采用吸附树脂进行分离，以乙醇-水梯度洗脱依次洗脱，收集洗脱液；(4)洗脱部分减压浓缩后，经硅胶柱色谱纯化，回收溶剂后干燥获得红色粉末状提取物；(5)该提取物以热乙醇溶解成饱和或不饱和溶液后，放置，析出红色结晶后干燥即得。与现有技术相比，本方法原料利用率高、环保、简便、成本低廉、适合工业化生产，产品纯度高。

Description

一种雷公藤红素的用途及制备方法

技术领域

本发明涉及一种雷公藤红素的用途及制备方法。

背景技术

1雷公藤红素的用途

雷公藤红素是一种存在于卫矛科植物雷公藤、南蛇藤等植物中的五环三萜类物质，其分子式为C₂₉H₃₈O，结构式如图。以往的研究表明，雷公藤红素具有抗氧化、抗风湿、抗老年痴呆症等功效，近年来的药理学研究证实雷公藤红素能通过影响癌细胞的蛋白酶体进而诱发癌细胞的凋亡。

脑胶质瘤是脑内最常见的肿瘤，占全部颅内肿瘤的35％--60％，是恶性度很高、易复发、预后差的颅内恶性肿瘤之一，它主要来源于神经胶质细胞。恶性脑胶质瘤即便经过手术、放射治疗和化学治疗等综合治疗，仍易复发，但是几乎都是原位复发。由于该肿瘤术后易复发和对放疗、化疗不敏感等特性，在临床上一直是个难题。世界卫生组织1998年公布按死亡率顺序排位，恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35～54岁患者的第3位死亡原因。在全球，每年恶性脑胶质瘤夺去约50万人的宝贵生命。

内源性大麻素系统(endocannabinoid system，eCBs)是一个脂质信号系统，主要由内源性大麻素(AEA与2-AG)、大麻素受体、内源性大麻素的合成酶及降解酶等组成。内源性大麻素AEA经释放后被神经细胞重新摄取，在神经细胞内由脂肪酸酰胺水解酶(Fatty Acid Amide Hydrolysis，FAAH)直接降解后排出体外。与AEA不同，2-AG经由单酰甘油酯水解酶(Monoacylglycerol-lipase，MGL)快速降解失活。

尽管对于eCBs具体的抗胶质瘤机制尚未完全阐明，但该系统在体内外表现出良好的抑制胶质瘤生长活性。内源性大麻素能干涉细胞周期的调节，可影响细胞周期调控体系中的几个组分，同时促进胶质瘤细胞的凋亡。AEA可通过作用于辣椒素受体，增加细胞内钙浓度，激活环氧合酶COX和脂氧化酶LOX，释放细胞色素C和激活Caspase 3，最终诱导人神经母细胞瘤和C6胶质瘤细胞凋亡。而作用于CB受体可激活AEA的转运，促进花生四烯酸的裂解和乙醇胺的水解，从而影响AEA的促凋亡效应。此外，eCBs还可抑制胶质瘤细胞的增殖。一项研究表明，CB受体激动剂WIN-55，212-2可通过激活Raf1/MEK/ERK级联反应来抑制胶质瘤细胞的增殖，但是，过久的激活可引起胶质瘤细胞的凋亡。Stig Jacobson等发现，2-AG和AEA可抑制C6胶质瘤细胞的增殖，且AEA表现出时间和剂量依赖效应，其机制为：内源性大麻素作用于CB受体从而引起氧化应激和激活钙蛋白酶引起细胞内钙超载而抑制肿瘤细胞的增殖。此外，对于胶质瘤的治疗，大麻素能抑制血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-2(angiopoietin-2)、基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和缺氧诱导因子-1α(hypoxia induciblefactor-1α，HIF-1α)的表达。

因此，通过抑制FAAH、MGL等内源性大麻素水解酶活性，可以升高体内AEA、2-AG水平，同时调节CB受体表达，共同发挥良好的抗胶质瘤作用。

2雷公藤红素的提取

目前雷公藤红素主要从卫矛科植物中提取。由于雷公藤红素在根皮中的含量最高，现有技术提取雷公藤红素主要使用根皮而将也含有相对少量的藤茎部分丢弃不用，造成了原料未充分利用而引起成本增高。

雷公藤红素在植物中的含量很低，基本上在0.1％左右，因此往往需要繁琐的提取过程。现有技术的提取过程大量使用了二氯甲烷、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、石油醚、氯仿等有机溶剂，这些溶剂的回收步骤繁琐，需要较高的设备投入，且容易造成环境污染；而为了得到98％以上的高纯度的产品，现有技术采用逆流层析、制备型高效液相色谱等对样品要求很高的大型设备，同样造成成本的增高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种雷公藤红素用于制备治疗脑胶质瘤的药物的用途。

本发明的另一目的在于提供一种高原料利用率、简便、环保、适合工业化生产的雷公藤红素的提取方法。

本发明的技术方案如下：

一种雷公藤红素的用途，其特征在于用于制备治疗脑胶质瘤的药物。雷公藤红素同时显著抑制内源性大麻素水解酶FAAH和MGL水平，显著提高内源性大麻素AEA和2-AG含量，同时抑制CB₁表达，促进CB₂表达，诱导多种脑胶质瘤细胞凋亡。

所述的雷公藤红素的制备方法，包括如下步骤：

(1)将雷公藤地上藤本部分与地下根部分混合粉碎处理后，经乙醇回流提取，过滤后减压浓缩；

(2)将浓缩后的乙醇提取物用乙醇水超声混悬，静置后，倾倒出上清液；

(3)上清液采用吸附树脂进行分离，以乙醇-水梯度洗脱依次洗脱，收集洗脱液；

(4)洗脱部分减压浓缩后，经硅胶柱色谱纯化，回收溶剂后干燥获得红色粉末状提取物；

(5)该提取物以热乙醇溶解成饱和溶液后，放置，析出红色结晶后干燥即得。

所述步骤(1)所用乙醇为原料体积的5-15倍，浓度为95％的食用乙醇，回流次数为1～3次。

所述步骤(2)所用的乙醇为所述步骤(1)浓缩液体积的3～5倍，浓度为60～95％。

所述步骤(3)所用吸附树脂为D101大孔吸附树脂或HPD100大孔吸附树脂或上述两种树脂以任意比例混合，所述洗脱梯度为水，40％乙醇，70％乙醇，90～95％乙醇。

所述步骤(4)的洗脱部分为90～95％乙醇洗脱部分，所述硅胶柱为200～300目的硅胶柱。

通过以上对本发明技术方案的描述可知：

本发明的方法所用原料为雷公藤的地上藤本部分及地下根皮部分，全过程仅采用乙醇这一种环境危害很小的有机溶剂，与现有技术相比，本方法原料利用率高、环保、简便、成本低廉、适合工业化生产，所生产出的产品纯度高。

附图说明

图1为本发明中雷公藤红素对FAAH的EC50图。

图2为本发明中雷公藤红素对MGL的EC50图。

图3为本发明中雷公藤红素诱导AEA、CB₁、CB₂变化。

图4为本发明中雷公藤红素对脑胶质瘤细胞的细胞毒作用。

图5为本发明中雷公藤红素诱导脑胶质瘤细胞凋亡图。

图6为本发明中雷公藤红素对原代正常神经细胞及neuro-2A神经肿瘤细胞的细胞毒作用。

具体实施方式

实施例1

FAAH、MGL酶抑制活性检测

将30μL(1mg/mL)蛋白加入进样瓶中，再加入2μL DMSO(空白对照组)或不同浓度的雷公藤红素于37摄氏度反应10分钟。再加入含有底物AEA或2-OG(实验中以2-OG代替很难定量检测的2-AG，这种替代在本领域内是公知允许的)的缓冲液170μL，AEA的浓度为5μM，于37摄氏度反应30分钟后加入含有十七烷酸(Heptadecanoic acid，内标)的甲醇溶液200μL终止反应。液质联用(LC-MS)检测水解产物花生四烯酸及油酸的产量，用Graphpad Prism 5作图。以此测定得到雷公藤红素对FAAH、MGL酶的EC50值分别为4.69、16.70μM(见图1和图2)。

实施例2

LC-MS检测细胞内内源性大麻素的含量

细胞给药4小时后用甲醇/水(1∶1，v∶v)收集细胞，超声破碎细胞后用氯仿萃取。3000rpm离心收集下层有机层，氮气吹干后用3∶1甲醇/氯仿100μL重新溶解后用LC-MS检测内源性大麻素的含量。该实验显示，经雷公藤红素诱导后，细胞AEA表达显著增高(见图3)。

实施例3

细胞毒性实验

脑胶质瘤细胞以浓度5000个/孔接种于96孔板中，隔天待细胞贴壁后更换含有不同浓度雷公藤的培液继续培养24h。之后加入细胞计数试剂(CCK-8)10μL，继续孵育2小时后于450nm酶标仪测定吸光度。以空白组为100％计算细胞的死亡数，并依据该曲线初步预测雷公藤红素对各种脑胶质瘤细胞的EC50值。实验显示，雷公藤红素对C6、BT325、SHG44等脑胶质瘤细胞的EC50值在2.0-3.5μM之间，显示出良好的细胞毒活性(见图4)。

实施例4

细胞凋亡实验

脑胶质瘤细胞以浓度5×10⁵个/孔接种于6孔板中，隔天待细胞贴壁后更换含有不同浓度(1uM，10uM，20uM)雷公藤的培液继续培养10小时，磷酸缓冲液冲洗后加入0.0.5％DAPI检测细胞核的变化，在荧光显微镜下进行照相显示雷公藤可诱发肿瘤细胞凋亡(见图5)。

实施例5

细胞毒性实验

原代神经细胞和脑神经肿瘤细胞neuro-2A(由于无法取得脑胶质瘤细胞所对应的正常细胞，因此以脑神经肿瘤细胞neuro-2A及其对应的原代神经细胞作为替换，这种替换在本领域内是公知允许的)以浓度5000个/孔接种于96孔板中，隔天待细胞贴壁后更换含有不同浓度雷公藤(0.3uM-10uM)的培液继续培养24h。之后加入细胞计数试剂(CCK-8)10μL，继续孵育2小时后于450nm酶标仪测定吸光度。实验显示，雷公藤红素对脑神经肿瘤细胞的细胞毒作用大于正常原代神经细胞(见图6)。

实施例6

雷公藤红素的提取分离

取雷公藤地上藤本部分与地下根部分500g混合粉碎处理后，用10倍量质量浓度为95％的食用乙醇回流提取2次，过滤后减压浓缩；将浓缩后的乙醇提取物用4倍量的75％乙醇水超声混悬，放置后，倾倒出上清液；上清液采用HPD100大孔吸附树脂进行分离，以乙醇-水梯度洗脱(水，40％乙醇，70％乙醇，95％乙醇)依次洗脱，收集洗脱液；95％乙醇洗脱部分减压浓缩后，经200目到300目的硅胶柱色谱纯化，回收溶剂后干燥获得红色粉末状提取物；该提取物以热乙醇溶解成饱和溶液后，放置，析出红色结晶后干燥称重为1.3g，得率为0.26％。

实施例7

取雷公藤地上藤本部分与地下根部分500g混合粉碎过20目筛，用6L(12倍量)95％食用乙醇回流提取3次，每次提取时间为2小时。过滤后合并提取液，减压浓缩；将浓缩后的乙醇提取物用5倍量的75％乙醇水超声混悬，放置后，倾倒出上清液；上清液采用HPD100大孔吸附树脂进行分离，以乙醇-水梯度洗脱(水，40％乙醇，70％乙醇，95％乙醇)依次洗脱，收集洗脱液；95％乙醇洗脱部分减压浓缩后，经200目到300目的硅胶柱色谱纯化，回收溶剂后干燥获得红色粉末状提取物；该提取物以热乙醇溶解成饱和溶液后，放置，析出红色结晶后干燥称重为1.57g，得率为0.314％。

实施例8

取雷公藤地上藤本部分与地下根部分500g混合粉碎处理后，用5倍量质量浓度为95％的食用乙醇回流提取2次，过滤后减压浓缩；将浓缩后的乙醇提取物用3倍量的65％乙醇水超声混悬，放置后，倾倒出上清液；上清液采用HPD100大孔吸附树脂进行分离，以乙醇-水梯度洗脱(水，40％乙醇，70％乙醇，95％乙醇)依次洗脱，收集洗脱液；95％乙醇洗脱部分减压浓缩后，经硅胶柱色谱纯化，回收溶剂后干燥获得红色粉末状提取物；该提取物以热乙醇溶解成饱和溶液后，放置，析出红色结晶后干燥称重为0.47g，得率为0.094％。

实施例9

取雷公藤地上藤本部分与地下根部分500g混合粉碎处理后，用15倍量质量浓度为95％的食用乙醇回流提取2次，过滤后减压浓缩；将浓缩后的乙醇提取物用5倍量的95％乙醇水超声混悬，放置后，倾倒出上清液；上清液采用HPD100大孔吸附树脂进行分离，以乙醇-水梯度洗脱(水，40％乙醇，70％乙醇，95％乙醇)依次洗脱，收集洗脱液；95％乙醇洗脱部分减压浓缩后，经硅胶柱色谱纯化，回收溶剂后干燥获得红色粉末状提取物；该提取物以热乙醇溶解成饱和溶液后，放置，析出红色结晶后干燥称重为1.46g，得率为0.292％。

实施例10

取雷公藤地上藤本部分与地下根部分500g混合粉碎处理后，用8倍量质量浓度为95％的食用乙醇回流提取3次，过滤后减压浓缩；将浓缩后的乙醇提取物用5倍量的95％乙醇水超声混悬，放置后，倾倒出上清液；上清液采用HPD100大孔吸附树脂进行分离，以乙醇-水梯度洗脱(水，40％乙醇，70％乙醇，95％乙醇)依次洗脱，收集洗脱液；95％乙醇洗脱部分减压浓缩后，经硅胶柱色谱纯化，回收溶剂后干燥获得红色粉末状提取物；该提取物以热乙醇溶解成饱和溶液后，放置，析出红色结晶后干燥称重为1.16g，得率为0.232％。

以上实施例中所得红色结晶中，雷公藤红素的平均纯度为98.72％。

以上实施例中所用吸附树脂还可以为D101大孔吸附树脂或与D101与HPD100任意比例混合的树脂，均可以得到相一致的结果。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims

1.一种雷公藤红素的用途，其特征在于可用于制备治疗脑胶质瘤的药物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：雷公藤红素同时显著抑制内源性大麻素水解酶FAAH和MGL水平，提高内源性大麻素AEA和2-AG含量，同时抑制CB₁表达，促进CB₂表达，诱导多种脑胶质瘤细胞凋亡。

3.一种雷公藤红素的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

4.如权利要求3所述的一种雷公藤红素的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)所用乙醇为原料体积的5-15倍，浓度为95％的食用乙醇，回流次数为1～3次。

5.如权利要求3所述的一种雷公藤红素的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)所用的乙醇为所述步骤(1)浓缩液体积的3～5倍，乙醇浓度为60～95％。

6.如权利要求3所述的一种雷公藤红素的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)所用吸附树脂为D101大孔吸附树脂或HPD100大孔吸附树脂或上述两种树脂以任意比例混合，所述洗脱梯度为水，40％乙醇，70％乙醇，90～95％乙醇。

7.如权利要求3所述的一种雷公藤红素的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)的洗脱部分为90～95％乙醇洗脱部分，所述硅胶柱为200～300目的硅胶柱。