CN105481817B - 一种异香豆素类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种异香豆素类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种异香豆素类化合物及其制备方法和应用，所述的异香豆素类化合物是以滇重楼中得到的曲霉属真菌米曲霉为基础，经菌种分离、菌种培养、规模化发酵、有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分离获得，其分子式为C16H18O5，命名为米曲霉素B，英文名为oryzaeins B，其结构式为：。制备方法是以滇重楼中得到的曲霉属真菌米曲霉为基础，经菌种分离、菌种培养、规模化发酵、有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分离步骤获得。应用为所述的异香豆素类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗轮状病毒药物研发的先导性化合物用于抗轮状病毒药物制剂研发。

Description

一种异香豆素类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种异香豆素类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
曲霉属真菌广泛存在于自然界中。其中，米曲霉是一种能产生复合酶的菌株，该菌株除可产生蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等多种功能的酶，因而广泛应用于食品、饲料、酿酒等发酵工业。同时，米曲霉次生代谢产物也被认为是一个亟待开发的重要资源。从不同来源的米曲霉发酵产物中也分离得到了一系列具有生物活性的天然产物，包括了生物碱、多肽、萜类化合物以及多酚类化合物。如从海洋生物红藻Heterosiphonia japonica中分离得到的米曲霉发酵产物中分离得到了一系列新颖的吲哚二萜类化合物asporyzins A–C。
发明内容
本发明以百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)中分离得到的曲霉属内生真菌米曲霉的固态发酵物为原料，经有机溶剂提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到一个新的异香豆素类化合物米曲霉素B，该化合物是从自然界中发现的具有罕见2-羰基-丙基和3-羟基-丙基片段的异香豆素类化合物，并且该化合物具显著的有抗轮状病毒活，应用前景突出。
本发明的第一目的是提供一种异香豆素类化合物；第二目的在于提供所述异香豆素类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述异香豆素类化合物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的异香豆素类化合物是以百合科植物滇重楼 (Paris polyphylla var. yunnanensis) 中得到的曲霉属真菌米曲霉 (Aspergillus oryzae)为基础，经菌种分离、菌种培养、规模化发酵、有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分离获得，其分子式为C16H18O5，命名为米曲霉素B，英文名为oryzaeins B，其结构式为：
本发明的第二目的是这样实现的，是以百合科植物滇重楼 (Paris polyphyllavar. yunnanensis) 中得到的曲霉属真菌米曲霉 (Aspergillus oryzae)为基础，经菌种分离、菌种培养、规模化发酵、有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分离步骤获得，具体为：
A、内生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的分离：将75%乙醇消毒后的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)茎秆和/或叶片放入无菌的研钵中进行研磨，研磨后转入无菌的塑料管内，1000~3000 rpm离心2~10min，吸取1~100微升上清液，涂布在BL平板上，倒置于培养箱中，25~30摄氏度黑暗培养2~10天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌种，直到获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession numberKM999948，GTGCATCGTACGTAGGTCTAGCGAGCCCACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCCGGAGGAA)确定为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)，其曲霉属真菌米曲霉见附图4；
B、内生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)菌种培养：A步骤分离得到的米曲霉菌种在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25~30℃培养7~10天，再接种在50~500毫升的三角瓶中，每个三角瓶含10~100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于25~30摄氏度下震荡培养5~10天得到液体发酵种子；
C、米曲霉(Aspergillus oryzae)的规模化发酵：将B步骤培养得到的的液体发酵种子进行规模化发酵，规模化发酵是在100~1000个100~500ml的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有10~200g大米和10~200ml蒸馏水，每个瓶中接种1.0~5.0ml步骤B培养得到的液体发酵种子，于25~30℃培养15~45天得到米曲霉发酵物；
D、浸膏提取：将C步骤发酵得到的米曲霉发酵物用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60min，合并提取液后过滤提取液，减压浓缩，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏a；
E、硅胶柱层析：将D步骤所得的浸膏a用浸膏a重量的1.5~3倍量的丙酮或者二氯甲烷溶解，用浸膏a重量的1~1.5倍量的80~100目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为浸膏a重量的6~10倍量；用体积配比为20:1~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC或分析型HPLC监测，合并相同的部分；
F、反相柱层析：将E步骤中以8:2配比的混合有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-18装柱；用体积浓度为20~80%的甲醇溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分。
G、高效液相色谱分离：将以体积浓度50~70%甲醇溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素B，英文名为oryzaeins B。
本发明制备得到的异香豆素类化合物的结构是用核磁共振结合其他波谱技术鉴定确认的，具体为：
化合物的紫外光谱（溶剂为甲醇）为λ max (logε）： 210 (3.78), 270 (3.57), 288(3.32), 325 (3.36) nm。红外光谱（溴化钾压片）为ν max 3430, 3085, 2957, 2848, 1724,1654, 1615, 1568, 1469, 1350, 1182, 1128, 1071 cm-1。HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 313.1058 [M + Na]+ (calcd 313.1052 for C16H18O5Na)。结合13C 和1HNMR谱（图1和图2，碳谱氢谱数据归属见表1），推出分子式为C16H18O5，不饱和度为8。1H NMR谱（图2）中显示了1个甲氧基，1个1,2,3,4-四取代苯环信号，1个三取代烯氢信号，4个亚甲基信号和1个甲基信号。在碳谱和DEPT（图1）中观测到了16个碳原子信号，其中2个甲基（包括了1个甲氧基信号），4个亚甲基，3个芳香次甲基和7个季碳信号（包括了2个羰基和2个含氧季碳信号）。其中，2个羰基和4对双键碳占用了6个不饱和度，提示该分子是一个二环类化合物。通过一维数据的仔细比对和分析，初步推测该化合物是一个含有一个甲氧基、一个2-羰基-丙基和一个3-羟基-丙基片段的异香豆素类化合物。这些推测通过二维核磁共振图谱得到确定（图3）。
表1 米曲霉素B的1H和13C NMR数据（溶剂为CDCl3）
首先，通过H-4与C-1，C-3，C-4a，C-5和C-8a的相关、H-6与C-4a，C-5，C-7和C-8的相关、以及H-7与C-5，C-6，C-8和C-8a的相关确定了化合物的基本骨架为异香豆素。其次，两个特殊的取代基（一个2-羰基-丙基和一个3-羟基-丙基）分别通过H3-11与C-9和C-10相关以及H2-3'与C-1'相关而确定。最后，通过H2-9与C-1，C-3和C-4相关、H3-1'与C-4a和C-6相关以及8-OMe与C-8相关，确定了三个取代基（一个羟基、一个2-羰基-丙基和一个3-羟基-丙基）的连接位置分别为C-3，C-5和C-8。因此，该异香豆素类化合物结构得以确定，系统名为8-甲氧基-3-(2-羰基丙基)-5-(3-羟基丙基)香豆素，并命名为米曲霉素B。其结构式为：
本发明的第三目的是这样实现的，所述的异香豆素类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。
本发明所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)YNCA1292，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.9716。
本发明化合物是首次被分离出来的，通过上述核磁共振和质谱测定方法确定了为苯丙素类化合物，并表征了其具体结构。经抗轮状病毒的实验，其TC50值为215.2µg/mL、IC50值为8.47µg/mL，治疗指数TI为25.41；其治疗指数超过对照病毒唑的治疗指数18.90；化合物具有很好的抗轮状病毒活性。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗轮状病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗轮状病毒药物研发的先导性化合物用于抗轮状病毒药物制剂研发。
附图说明
图1为本发明化合物米曲霉素B的核磁共振碳谱（13C NMR）；
图2为本发明化合物米曲霉素B的核磁共振氢谱（1H NMR）；
图3为本发明化合物米曲霉素B的关键HMBC相关；
图4为曲霉属真菌米曲霉曲霉属真菌米曲霉示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述的异香豆素类化合物，是以百合科植物滇重楼 (Paris polyphyllavar. yunnanensis)中得到的曲霉属真菌米曲霉 (Aspergillus oryzae)为基础，经菌种分离、菌种培养、规模化发酵、有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分离、波谱分析获得，其分子式为C16H18O5，命名为米曲霉素B，英文名为oryzaeins B，其结构式为：
本发明所述的异香豆素类化合物的制备方法，是以百合科植物滇重楼 (Paris polyphylla var. yunnanensis)中得到的曲霉属真菌米曲霉 (Aspergillus oryzae)为基础，经菌种分离、菌种培养、规模化发酵、有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分离步骤获得，具体为：
A、内生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的分离：将75%乙醇消毒后的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)茎秆和/或叶片放入无菌的研钵中进行研磨，研磨后转入无菌的塑料管内，1000~3000 rpm离心2~10min，吸取1~100微升上清液，涂布在BL平板上，倒置于培养箱中，25~30摄氏度黑暗培养2~10天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌种，直到获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession numberKM999948，GTGCATCGTACGTAGGTCTAGCGAGCCCACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCCGGAGGAA)确定为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)，其曲霉属真菌米曲霉见附图4；
B、内生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)菌种培养：A步骤分离得到的米曲霉菌种在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25~30℃培养7~10天，再接种在50~500毫升的三角瓶中，每个三角瓶含10~100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于25~30摄氏度下震荡培养5~10天得到液体发酵种子；
C、米曲霉(Aspergillus oryzae)的规模化发酵：将B步骤培养得到的的液体发酵种子进行规模化发酵，规模化发酵是在100~1000个100~500ml的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有10~200g大米和10~200ml蒸馏水，每个瓶中接种1.0~5.0ml步骤B培养得到的液体发酵种子，于25~30℃培养15~45天得到米曲霉发酵物；
D、浸膏提取：将C步骤发酵得到的米曲霉发酵物用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60min，合并提取液后过滤提取液，减压浓缩，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏a；
E、硅胶柱层析：将D步骤所得的浸膏a用浸膏a重量的1.5~3倍量的丙酮或者二氯甲烷溶解，用浸膏a重量的1~1.5倍量的80~100目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为浸膏a重量的6~10倍量；用体积配比为20:1~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC或分析型HPLC监测，合并相同的部分；
F、反相柱层析：将E步骤中以8:2配比的混合有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-18装柱；用体积浓度为20~80%的甲醇溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分。
G、高效液相色谱分离：将以体积浓度50~70%甲醇溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素B，英文名为oryzaeins B。
A步骤中所述的研磨是将75%乙醇消毒后的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)茎秆和叶片放入无菌的研钵中，加入茎秆和叶片总重量0.5~1.0倍的水、再加入茎秆和叶片总重量1.0~2.0倍的石英砂进行研磨。
D步骤中所述的有机溶剂为体积百分浓度70~100%的丙酮、体积百分浓度90~100%的乙醇、体积百分浓度90~100%的乙酸乙酯或体积百分浓度90~100%的甲醇。
E步骤所述的混合有机溶剂为氯仿-甲醇、石油醚-乙酸乙酯、氯仿-丙酮、石油醚-丙酮或环己烷-异丙醇。
所述的混合有机溶剂的体积配比为20:1，9:1，8:2，7:3，6:4，1:1，1:2和0:1。
G步骤中所述的高效液相色谱分离纯化是以68~75%的甲醇为流动相，流速10~14mL/min，以21.2×250mm，5mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为201~280nm，每次进样10~100mL，收集10~40min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素B，英文名为oryzaeins B。
本发明的应用为所述的异香豆素类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。
本发明所述的异香豆素类化合物的制备方法具体操作如下：
A、内生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的分离：将75%乙醇消毒后的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)茎秆和叶片放入无菌的研钵中，加入少量水并放有少量的石英砂进行彻底研磨，将所得碎片溶液转入无菌的塑料管内，1000~3000 rpm离心2~10分钟 ,吸取1~100微升上清液，涂布在BL平板上，倒置于培养箱中，25~30摄氏度黑暗培养2~10天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌种，直到获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession number KM999948)确定为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)；
B、内生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)菌种培养：A步骤所叙的米曲霉在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25~30摄氏度培养7~10天。将米曲霉接种在50~500毫升的三角瓶中，每个三角瓶含10~100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于25~30摄氏度下震荡培养5~10天(180 rpm)。
C、大规模米曲霉(Aspergillus oryzae)发酵：A和B步骤所叙的米曲霉大规模发酵在100~1000个100~500毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有10~200克大米和10~200毫升蒸馏水。每个瓶中接种1.0~5.0毫升步骤B说叙的含菌营养基，25~30摄氏度培养15~45天。
D、浸膏提取：将C步骤说叙的大规模固体发酵的米曲霉发酵物用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60分钟，合并提取液后过滤提取液，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a。其中该步骤所述的有机溶剂为70~100%的丙酮、90~100%的乙醇、90~100%的乙酸乙酯或90~100%的甲醇。
E、硅胶柱层析：将浸膏a用重量比1.5~3倍量的丙酮或者二氯甲烷溶解，用浸膏重1~1.5倍的80~100目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为浸膏a重量6~10倍量；用体积比为20:1~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC或者分析型HPLC监测，合并相同的部分。其中该步骤所述的混合有机溶剂为氯仿-甲醇、石油醚-乙酸乙酯、氯仿-丙酮、石油醚-丙酮或环己烷-异丙醇；其体积配比为20:1，9:1，8:2，7:3，6:4，1:1，1:2和0:1。
F、反相柱层析：将8:2配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-18装柱；用体积含量为20~80%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分。
G、高效液相色谱分离：将以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经制备高效液相色谱分离纯化，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素B，英文名为oryzaeins B。在G步骤中，高效液相色谱分离纯化是以68~75%的甲醇为流动相，流速10~14mL/min，以21.2×250mm，5mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为201~280nm，每次进样10~100mL，收集10~40min的色谱峰，多次累加后蒸干分别得到纯的黄色胶状物。
H、结构鉴定：G步骤所得的纯的黄色胶状物，通过测定化合物的一维、二维核磁共振、常规和高分辨质谱等波谱数据，得到该化合物的图谱。经结构解析确定其分子结构，确定为新的异香豆素类化合物，命名为米曲霉素B。本发明中的异香豆素类化合物均是首次被分离出来的。
下面以具体实施例对本发明做进一步说明：
实施例1
将75%酒精消毒过的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)茎秆和叶片放入无菌的研钵中，加入少量水并放有少量的石英砂进行彻底研磨，直至茎叶成为碎片，将碎片溶液转入无菌的塑料管内，3000 rpm 离心5分钟，吸取50微升上清液，涂布在BL平板上，倒置于培养箱中，28摄氏度黑暗培养5天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌种，从而获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession numberKM999948)确定为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)。将分离得到的杂色曲霉在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28摄氏度培养7天。将杂色曲霉接种在250毫升的三角瓶中，每个三角瓶含100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于28摄氏度下震荡培养 5天(180rpm)。大规模发酵在200个500毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有100克大米和100毫升蒸馏水。每个瓶中接种5.0毫升含菌营养基，28摄氏度培养30天。
所得发酵物用乙酸乙酯超声提取4次，每次60min，提取液合并并过滤，减压浓缩减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩500克浸膏a。浸膏a用500克80~100目硅胶拌样，用200~300目硅胶4000克装柱，用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到8个部分，体积比8:2的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液b为45g，体积比7:3的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液c为8g。用反相材料C-18装柱，洗脱液b上反相柱，以体积含量为20~80%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以72%的甲醇为流动相，流速12mL/min，21.2×250mm，5mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样50mL，收集25.0min和27.0min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素B。
实施例2
将75%酒精消毒过的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)茎秆和叶片放入无菌的研钵中，加入少量水并放有少量的石英砂进行彻底研磨，直至茎叶成为碎片，将碎片溶液转入无菌的塑料管内，3000 rpm 离心2分钟，吸取50微升上清液，涂布在BL平板上，倒置于培养箱中，28摄氏度黑暗培养10天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌种，从而获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession numberKM999948)确定为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)。将分离得到的杂色曲霉在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28摄氏度培养7天。将杂色曲霉接种在50毫升的三角瓶中，每个三角瓶含20毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于28摄氏度下震荡培养 10天(180rpm)。大规模发酵在500个500毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有100克大米和100毫升蒸馏水。每个瓶中接种5.0毫升含菌营养基，28摄氏度培养45天。
所得发酵物用乙酸乙酯超声提取5次，每次45min，提取液合并并过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩1500克浸膏a。浸膏a用1500克80~100目硅胶拌样，用200~300目硅胶10000克装柱，用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到8个部分，体积比8:2的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液b为95g，体积比7:3的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液c为17g。用反相材料C-18装柱，洗脱液b上反相柱，以体积含量为20~80%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以75%的甲醇为流动相，流速12mL/min，21.2×250mm，5mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为220nm，每次进样50mL，收集21.0min和24.0min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素B。
实施例3
将75%酒精消毒过的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)茎秆和叶片放入无菌的研钵中，加入少量水并放有少量的石英砂进行彻底研磨，直至茎叶成为碎片，将碎片溶液转入无菌的塑料管内，2000rpm 离心8分钟，吸取50微升上清液，涂布在BL平板上，倒置于培养箱中，28摄氏度黑暗培养5天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌种，从而获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession numberKM999948)确定为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)。将分离得到的杂色曲霉在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28摄氏度培养7天。将杂色曲霉接种在250毫升的三角瓶中，每个三角瓶含100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于28摄氏度下震荡培养 5天(180rpm)。大规模发酵在200个500毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有100克大米和100毫升蒸馏水。每个瓶中接种5.0毫升含菌营养基，28摄氏度培养30天。
所得发酵物用乙酸乙酯超声提取4次，每次60min，提取液合并并过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩500克浸膏a。浸膏a用500克80~100目硅胶拌样，用200~300目硅胶4000克装柱，用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到8个部分，体积比8:2的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂的洗脱液b为56g，体积比7:3的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液c为12g。用反相材料C-18装柱，洗脱液b上反相柱，以体积含量为20~80%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以72%的甲醇为流动相，流速12mL/min，21.2×250mm，5mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样50mL，收集25.0min和27.0min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素B。
实施例4
将75%酒精消毒过的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)茎秆和叶片放入无菌的研钵中，加入少量水并放有少量的石英砂进行彻底研磨，直至茎叶成为碎片，将碎片溶液转入无菌的塑料管内，3000rpm 离心2分钟，吸取50微升上清液，涂布在BL平板上，倒置于培养箱中，28摄氏度黑暗培养5天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌种，从而获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession numberKM999948)确定为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)。将分离得到的杂色曲霉在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28摄氏度培养7天。将杂色曲霉接种在250毫升的三角瓶中，每个三角瓶含100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于28摄氏度下震荡培养 5天(180rpm)。大规模发酵在200个500毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有100克大米和100毫升蒸馏水。每个瓶中接种5.0毫升含菌营养基，28摄氏度培养30天。
所得发酵物用乙酸乙酯超声提取4次，每次60min，提取液合并并过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩600克浸膏a。浸膏a用500克80~100目硅胶拌样，用200~300目硅胶6000克装柱，用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的环己烷-异丙醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到8个部分，体积比8:2的环己烷-异丙醇混合有机溶剂的洗脱液b为80g，体积比7:3的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液c为17g。用反相材料C-18装柱，洗脱液b上反相柱，以体积含量为20~80%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以72%的甲醇为流动相，流速12mL/min，21.2×250mm，5mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样50mL，收集25.0min和27.0min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素B。
实施例5
将75%酒精消毒过的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)茎秆和叶片放入无菌的研钵中，加入少量水并放有少量的石英砂进行彻底研磨，直至茎叶成为碎片，将碎片溶液转入无菌的塑料管内，1000 rpm 离心10分钟，吸取50微升上清液，涂布在BL平板上，倒置于培养箱中，28摄氏度黑暗培养5天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌种，从而获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession numberKM999948)确定为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)。将分离得到的杂色曲霉在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28摄氏度培养7天。将杂色曲霉接种在250毫升的三角瓶中，每个三角瓶含100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于28摄氏度下震荡培养 5天(180rpm)。大规模发酵在200个500毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有100克大米和100毫升蒸馏水。每个瓶中接种5.0毫升含菌营养基，28摄氏度培养30天。
所得发酵物用甲醇超声提取4次，每次60min，提取液合并并过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩400克浸膏a。浸膏a用400克80~100目硅胶拌样，用200~300目硅胶2400克装柱，用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到8个部分，体积比8:2的氯仿-丙酮混合有机溶剂的洗脱液b为60g，体积比7:3的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液c为11g。用反相材料C-18装柱，洗脱液b上反相柱，以体积含量为20~80%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以72%的甲醇为流动相，流速12mL/min，21.2×250mm，5mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样50mL，收集25.0min和27.0min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素B。
实施例6
取实施例1制备得到的异香豆素类化合物米曲霉素B进行结构测定：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。
实施例1制备得到的化合物的紫外光谱（溶剂为甲醇）为λ max (logε）： 210(3.78), 270 (3.57), 288 (3.32), 325 (3.36) nm。红外光谱（溴化钾压片）为ν max 3430,3085, 2957, 2848, 1724, 1654, 1615, 1568, 1469, 1350, 1182, 1128, 1071 cm-1。HRESIMS显示实施例1制备得到的化合物准分子离子峰m/z 313.1058 [M + Na]+ (calcd313.1052 for C16H18O5Na)。结合13C 和1H NMR谱（图1和图2，碳谱氢谱数据归属见表1），推出分子式为C16H18O5，不饱和度为8。1H NMR谱（图2）中显示了1个甲氧基，1个1,2,3,4-四取代苯环信号，1个三取代烯氢信号，4个亚甲基信号和1个甲基信号。在碳谱和DEPT（图1）中观测到了16个碳原子信号，其中2个甲基（包括了1个甲氧基信号），4个亚甲基，3个芳香次甲基和7个季碳信号（包括了2个羰基和2个含氧季碳信号）。其中，2个羰基和4对双键碳占用了6个不饱和度，提示该分子是一个二环类化合物。通过一维数据的仔细比对和分析，初步推测实施例1制备得到的化合物是一个含有一个甲氧基、一个2-羰基-丙基和一个3-羟基-丙基片段的异香豆素类化合物。这些推测通过二维核磁共振图谱得到确定（图3）。
首先，通过H-4与C-1，C-3，C-4a，C-5和C-8a的相关、H-6与C-4a，C-5，C-7和C-8的相关、以及H-7与C-5，C-6，C-8和C-8a的相关确定了实施例1制备得到的化合物的基本骨架为异香豆素。其次，两个特殊的取代基（一个2-羰基-丙基和一个3-羟基-丙基）分别通过H3-11与C-9和C-10相关以及H2-3'与C-1'相关而确定。最后，通过H2-9与C-1，C-3和C-4相关、H3-1'与C-4a和C-6相关以及8-OMe与C-8相关，确定了三个取代基（一个羟基、一个2-羰基-丙基和一个3-羟基-丙基）的连接位置分别为C-3，C-5和C-8。因此，实施例1制备得到的异香豆素类化合物结构得以确定。
实施例7
取实施例2制备的异香豆素类化合物进行结构测定，方法同实施例6，确认实施例2制备的化合物为所述的香豆素类化合物——米曲霉素B。
实施例8
取实施例3制备的异香豆素类化合物进行结构测定，方法同实施例6，确定实施例3制备得到的异香豆素类化合物为米曲霉素B，英文名为oryzaeins B。
实施例9
取实施例4制备的异香豆素类化合物进行结构测定，方法同实施例6，确定实施例4制备得到的异香豆素类化合物为米曲霉素B，英文名为oryzaeins B。
实施例10
取实施例5制备的异香豆素类化合物进行结构测定，方法同实施例6，确定实施例5制备得到的异香豆素类化合物为米曲霉素B，英文名为oryzaeins B。
实施例11
取实施例1制备的异香豆素类化合物进行抗轮状病毒活性试验，试验情况如下：
抗轮状病毒采用体外细胞测试法，即样品与病毒同时作用于MA104细胞后，通过Alarmablue法检测样品对病毒感染致细胞死亡的保护作用，从而测定样品对HRV的活性作用。
(a) 药物的细胞毒性检测
MA104细胞在 96 孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的样品液，继续培养3天后，更换含Alamarblue的培养液，继续培养2～3小时后检测其530/590nm处的荧光值，从而检测样品对 MA104 细胞的毒性，并计算半数细胞毒浓度（TC50）。
(b) 药物抗轮状病毒作用检测
MA104细胞在 96 孔细胞培养板中培养形成单层后，100TCID50的病毒液和不超过20％细胞毒性的梯度浓度药物溶液同时加到MA104细胞上，继续培养4-6天后，更换含Alamarblue的培养液继续培养2~3小时后检测其530/590nm处的荧光值，并计算半数抑制浓度（IC50）。
(c) 根基TC50/ IC50计算化合物的治疗指数
结果表明，实施例1制备得到的化合物的TC50值为215.2 µg/mL、IC50值为8.47 µg/mL，治疗指数TI为25.41；其治疗指数超过对照病毒唑的治疗指数18.90；实施例1制备得到的化合物具有很好的抗轮状病毒活性。
实施例12
分别以实施例2、3、4、5制备得到的化合物进行抗轮状病毒活性试验，试验方法同实施例11，结果均表明，本发明的化合物具有很好的抗轮状病毒活性。
以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗轮状病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗轮状病毒药物研发的先导性化合物用于抗轮状病毒药物制剂研发。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南民族大学
<120> 一种异香豆素类化合物及其制备方法和应用
<130> 2015
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 567
<212> DNA
<213> 曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)
<400> 1
gtgcatcgta cgtaggtcta gcgagcccac ctcccacccg tgtttactgt accttagttg 60
cttcggcggg cccgccattc atggccgccg ggggctctca gccccgggcc cgcgcccgcc 120
ggagacacca cgaactctgt ctgatctagt gaagtctgag ttgattgtat cgcaatcagt 180
taaaactttc aacaatggat ctcttggttc cggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg 240
ataactagtg tgaattgcag aattccgtga atcatcgagt ctttgaacgc acattgcgcc 300
ccctggtatt ccggggggca tgcctgtccg agcgtcattg ctgcccatca agcacggctt 360
gtgtgttggg tcgtcgtccc ctctccgggg gggacgggcc ccaaaggcag cggcggcacc 420
gcgtccgatc ctcgagcgta tggggctttg tcacccgctc tgtaggcccg gccggcgctt 480
gccgaacgca aatcaatctt tttccaggtt gacctcggat caggtaggga tacccgctga 540
acttaagcat atcaaaagcc ggaggaa 567

Claims (8)

1.一种异香豆素类化合物，其特征在于所述的异香豆素类化合物是以百合科植物滇重楼 (Paris polyphylla var. yunnanensis) 中得到的曲霉属真菌米曲霉 (Aspergillus oryzae)为基础，经菌种分离、菌种培养、规模化发酵、有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分离获得，其分子式为C16H18O5，命名为米曲霉素B，英文名为oryzaeins B，其结构式为：
。
2.一种权利要求1所述的异香豆素类化合物的制备方法，其特征在于是以百合科植物滇重楼 (Paris polyphylla var. yunnanensis) 中得到的曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)为基础，经菌种分离、菌种培养、规模化发酵、有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分离步骤获得，具体为：
A、内生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的分离：将75%乙醇消毒后的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)茎秆和/或叶片放入无菌的研钵中进行研磨，研磨后转入无菌的塑料管内，1000~3000 rpm离心2~10min，吸取1~100微升上清液，涂布在BL平板上，倒置于培养箱中，25~30摄氏度黑暗培养2~10天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌种，直到获得单一内生真菌菌落，经ITS测序确定为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)；
B、内生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)菌种培养：A步骤分离得到的米曲霉菌种在室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25~30℃培养7~10天，再接种在50~500毫升的三角瓶中，每个三角瓶含10~100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于25~30摄氏度下震荡培养5~10天得到液体发酵种子；
C、米曲霉(Aspergillus oryzae)的规模化发酵：将B步骤培养得到的的液体发酵种子进行规模化发酵，规模化发酵是在100~1000个100~500mL 的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有10~200g大米和10~200mL 蒸馏水，每个瓶中接种1.0~5.0mL 步骤B培养得到的液体发酵种子，于25~30℃培养15~45天得到米曲霉发酵物；
D、浸膏提取：将C步骤发酵得到的米曲霉发酵物用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60min，合并提取液后过滤提取液，减压浓缩，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏a；
E、硅胶柱层析：将D步骤所得的浸膏a用浸膏a重量的1.5~3倍量的丙酮或者二氯甲烷溶解，用浸膏a重量的1~1.5倍量的80~100目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为浸膏a重量的6~10倍量；用体积配比为20:1~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC或分析型HPLC监测，合并相同的部分；
F、反相柱层析：将E步骤中8:2配比的混合有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-18装柱；用体积浓度为20~80%的甲醇溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
G、高效液相色谱分离：将以体积浓度50~70%甲醇溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素B，英文名为oryzaeins B。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于A步骤中所述的研磨是将75%乙醇消毒后的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)茎秆和叶片放入无菌的研钵中，加入茎秆和叶片总重量0.5~1.0倍的水、再加入茎秆和叶片总重量1.0~2.0倍的石英砂进行研磨。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于D步骤中所述的有机溶剂为体积百分浓度70~100%的丙酮、体积百分浓度90~100%的乙醇、体积百分浓度90~100%的乙酸乙酯或体积百分浓度90~100%的甲醇。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于E步骤所述的混合有机溶剂为氯仿-甲醇、石油醚-乙酸乙酯、氯仿-丙酮、石油醚-丙酮或环己烷-异丙醇。
6.根据权利要求2或5所述的制备方法，其特征在于所述的混合有机溶剂的体积配比为20:1，9:1，8:2，7:3，6:4，1:1，1:2和0:1。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于G步骤中所述的高效液相色谱分离纯化是以68~75%的甲醇为流动相，流速10~14mL/min，以21.2×250mm，5mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为201~280nm，每次进样10~100mL，收集10~40min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素B，英文名为oryzaeins B。
8.一种权利要求1所述的异香豆素类化合物的应用，其特征在于所述的异香豆素类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。
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