CN103724190B - 一种深海真菌次生代谢产物中的化合物EngyodontiuminA、制备方法及其用途 - Google Patents

一种深海真菌次生代谢产物中的化合物EngyodontiuminA、制备方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN103724190B
CN103724190B CN201310722849.5A CN201310722849A CN103724190B CN 103724190 B CN103724190 B CN 103724190B CN 201310722849 A CN201310722849 A CN 201310722849A CN 103724190 B CN103724190 B CN 103724190B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ethyl acetate
preparation
compound
engyodontiumina
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201310722849.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103724190A (zh
Inventor
陈建明
王伟毅
陈卓
李芊
王蔚
杨慧
陈巧玉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHINA OCEAN MINERAL RESOURCES R&D ASSOCIATION
Third Institute of Oceanography SOA
Original Assignee
CHINA OCEAN MINERAL RESOURCES R&D ASSOCIATION
Third Institute of Oceanography SOA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHINA OCEAN MINERAL RESOURCES R&D ASSOCIATION, Third Institute of Oceanography SOA filed Critical CHINA OCEAN MINERAL RESOURCES R&D ASSOCIATION
Priority to CN201310722849.5A priority Critical patent/CN103724190B/zh
Publication of CN103724190A publication Critical patent/CN103724190A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103724190B publication Critical patent/CN103724190B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C65/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C65/21—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明公开了一种深海真菌次生代谢产物中的化合物EngyodontiuminA、制备方法及其用途。该化合物具有如下的结构式，其分子式为C12H15ClO4，分子量为258.0659。通过接种白色侧齿霉Engyodontium album菌丝体于海水中制备得到。该化合物具有抗菌功能，可用于制备抗菌药物。

Description

一种深海真菌次生代谢产物中的化合物EngyodontiuminA、制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及海洋微生物领域，尤其涉及一种抗菌化合物，具体为一种化合物EngyodontiuminA、制备方法及其用途。
背景技术
海洋微生物（marine microorganism）是指分布在海洋中的个体微小、形态结构简单的单细胞或多细胞生物；是海洋中个体微小，构造简单的低等生物的总称。包括细菌、真菌、放线菌、霉菌、酵母、病毒、衣原体、支原体、噬菌体和微型藻及微型原生动物等。
1929年，Fleming从真菌中发现青霉素开创了人类用抗生素与疾病作斗争的新纪元。人们研究热点一直是陆生真菌资源，90年代以前，关于海洋真菌的化学研究报道很少;1970-1990年，只有少数报道;但是到了1990年以后，这方面的报道几乎呈指数性增长。到2002年从海洋真菌中共发现272个新天然产物，其中也包括了一些深海真菌中发现的天然化合物，其中许多化合物具有新的骨架。1998年和2000年发现的新化合物数目最多，近年来海洋真菌来源的新化合物数目的总趋势依然在增加，从而证明了海洋真菌具有独特的代谢和生理机制，是潜在的药物先导化合物的丰富资源。
深海真菌是指大于等于1000米水深处海洋中个体微小，结构简单的真菌。深海真菌白色侧齿霉Engyodonium album分离于大西洋（经度：W24°23纬度：N0°8）-3542m的深海沉积物，属于深海丝状真菌。目前仅有文献报道称对黑乳海参共附生白色侧齿霉菌的次级代谢产物进行研究，分离得到一些甾体成分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗菌作用的新的化合物。
为实现上述目的，本发明提供一种化合物EngyodontiuminA，其特征在于，其分子式为C12H15ClO4，分子量为258.0659，具有如下结构式，
所述化合物EngyodontiuminA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，
菌种的准备：使用海水PDA培养基，高温灭菌，制成平板，置于常温状态下，接种白色侧齿霉Engyodontium album菌丝体培养，作为菌种；所述海水PDA培养基成分为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，1L海水；
发酵种子液制备：在多个锥形瓶中分别装入海水PDA液体培养基，高温灭菌后，接种上述菌种培养，将该培养物作为种子液；
接种：采用固体发酵方式，准备发酵瓶，加入大米固体发酵培养基，接种上述种子液，培养；所述大米固体发酵培养基为每1L的三角锥瓶装大米105g，小黄米45g，PDA培养基150ML，121℃，20min，高温灭菌；
萃取：待真菌发酵成熟后，加入乙酸乙酯500mL/瓶浸泡发酵产物，发酵产物溶入乙酸乙酯溶液中，浸泡后，将上层乙酸乙酯相倒出，下层为固体发酵产物；加入新的乙酸乙酯500mL/瓶，此步骤可反复多次，每次浸泡一段时间，如此制备得到乙酸乙酯初提液；以乙酸乙酯和所得到的乙酸乙酯初提液为混合溶剂，采用高压乳化切割机碾碎下层的固体发酵产物，胞内物质溶解到上述混合溶剂中，得到乙酸乙酯混合液,用旋转蒸发仪将乙酸乙酯混合液减压浓缩至固态浸膏，得到初级浸膏；
单体分离纯化：所得初级浸膏与正相硅胶拌样成粉状，，将拌好的粉末样品加入空柱中待分离；将装有粉末样品的柱子与正相硅胶柱连接，利用中压液相制备系统进行洗脱，设置正己烷-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇层析比例，在中压液相制备系统中接收分离后出峰信号，根据信号峰出峰的先后顺序依次收集峰值在200mA-2000mA的洗脱液，将洗脱液用旋转蒸发仪在35摄氏度24h真空浓缩为固态浸膏，即得到初级馏分15个,编号从F.1到F.15依次编号，每个初级馏分的量约是2g-3g；
初级馏分分别以少量甲醇溶解，加入合适的助溶剂待分离；采用反相C18制备柱进行次级馏分的制备，利用中压液相制备系统进行梯度洗脱，根据信号峰出峰时间收集洗脱液，将洗脱液用旋转蒸发仪在40摄氏度2-3天真空浓缩至固态浸膏，得到次级馏分，共得到88个次级馏分，编号从No.1到No.88依次编号，每个次级馏分的量是20mg-300mg；
第NO.14的次级馏分采用高效液相色谱仪处理，仪器上体现目标化合物的出峰时间在25min左右，然后采用高压反相C18制备柱制备收集得到化合物EngyodontiuminA。
所述菌种的准备中，所述高温灭菌为121℃，20min；所述培养为于28℃下静置培养4-5天；
任选的，所述发酵种子液制备中，高温灭菌为121℃，20min；所述培养为28℃下以180rpm/min振荡培养2-3天；
任选的，所述接种为中种子液的接种量为15%；28℃培养箱放置28天；
所述萃取中，每瓶加入乙酸乙酯500mL浸泡发酵产物，所述浸泡时间为24h，所述多次可以是三次，每次浸泡24h；所述混合溶剂中，乙酸乙酯与乙酸乙酯初提液的体积比为2：3；所述减压浓缩条件为2-3h，35℃。
所述单体分离纯化中，所得初级浸膏与正相硅胶的重量比例为1:3左右；所述正相硅胶柱规格为；所述正己烷-乙酸乙酯体积比例为80:20,60:40,40:60,20:80,0:100，所述乙酸乙酯-甲醇体积比例为70:30,0:100；所述洗脱液减压浓缩条件为每个样1-2h，35℃；
初级馏分以少量甲醇溶解，比如1mL，加入四氢呋喃，500μL待分离；采用反相C18制备柱进行次级馏分的制备，利用中压液相制备系统，设置洗脱条件为：乙腈：水=100:0-0:100梯度洗脱，根据信号峰出峰时间收集洗脱液，减压蒸馏，6-7天，40℃，至固态浸膏，得到次级馏分，共得到88个次级馏分，依次编号No.1-No.88。
所述化合物EngyodontiuminA用于抗菌的用途。
所述菌为真菌和细菌。
所述真菌为黑曲霉。
所述细菌为抗甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，轮虫弧菌，坎式弧菌，创伤弧菌。
所述化合物EngyodontiuminA用于制备抗菌药物的用途。
发明人在对深海真菌的研究中，发现了一株深海丝状真菌，即白色侧齿霉Engyodontiumalbum，发明人在对其发酵产物在提取、分离和纯化方面进行了系统的研究，得到一种新化合物EngyodontiuminA。进一步研究还发现该化合物的结构如下述结构式所示，其分子式为：C12H15ClO4，分子量为258.0659。
化合物EngyodontiuminA的制备方法为：以白色侧齿霉Engyodontium album为发酵菌种大量发酵，并先后采用固体发酵，溶剂萃取和硅胶色谱柱分离纯化，得到EngyodontiuminA的单体之后，通过波谱方法进行结构鉴定，并通过体外实验得到抑菌活性数据，为新的活性药物开发打下基础。
以下对本发明新化合物EngyodontiuminA的制备过程以及体外抑菌活性实验进行详细说明。
1.菌株来源：深海丝状真菌-白色侧齿霉Engyodontium album
2.发酵产物的制备方法
本实验所以化学试剂甲醇，正己烷，乙酸乙酯，乙腈，四氢呋喃均购自西陇化工股份有限公司。
（1）菌种的准备
使用海水PDA培养基（PDA培养基配方：取马铃薯200g，加葡萄糖20g，琼脂15-20g,用海水1L溶解混匀），高温灭菌，制成平板，置于常温状态下，严格无菌操作，超净台接种白色侧齿霉Engyodontium album菌丝体（保藏单位为中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：MCCC3A00236），于28℃下静置培养4-5天，作为菌种；
（2）发酵种子液制备
在多个锥形瓶中分别装入海水PDA液体培养基；于高温灭菌后，严格无菌操作，超净台接种上述步骤（1）所得Engyodontium album菌种，28℃下以180rpm/min振荡培养2-3天，将该培养物作为种子液；
（3）接种
采用固体发酵方式，准备发酵瓶，大米固体发酵培养基:每1L的三角锥瓶装大米105g,小黄米45g（食用大米和小黄米可在超市购得）,加入150mL PDA培养液，121℃，20min高温灭菌，15%接种量接种上述步骤（2）所得Engyodontium album菌种的种子液，28℃培养箱放置28天。
（4）萃取
待真菌发酵成熟后，加入乙酸乙酯500mL/瓶浸泡发酵产物，发酵产物溶入乙酸乙酯溶液中，浸泡24h后，将上层乙酸乙酯相倒出，下层为固体发酵产物。加入新的乙酸乙酯500mL/瓶，如此反复3次，每次浸泡24h，如此制备1.5L乙酸乙酯初提液。以1L乙酸乙酯和1.5L乙酸乙酯初提液为溶剂，采用高压乳化切割机碾碎下层的固体发酵产物，胞内物质溶解到上述2.5L乙酸乙酯混合液中，总共得到的乙酸乙酯混合液2.5L,用旋转蒸发仪将乙酸乙酯混合液2.5L减压浓缩（2-3h,35℃）至固态浸膏，得到初级浸膏。
（5）单体分离纯化
所得初级浸膏与正相硅胶（规格：200-300目，国药集团化学试剂有限公司）拌样成粉状，拌样比例1:3左右，样品为1g，拌样的硅胶为3g，将拌好的粉末样品加入空柱中（上海鑫饰化工有限公司）待分离；将装有粉末样品的柱子与购买的正相硅胶柱（规格：，购买自：上海鑫饰化工有限公司）连接，利用中压液相制备系统（购买自北京创新通恒有限公司，型号：P3000A半制备）进行洗脱，设置正己烷-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇层析比例，分别为：正己烷-乙酸乙酯（80:20,60:40,40:60,20:80,0:100），乙酸乙酯-甲醇（70:30,0:100），在中压液相制备系统中254nm下接收分离后出峰信号，根据信号峰出峰的先后顺序（出峰顺序根据物质极性不同依极性由弱到强依次出峰）依次收集峰值在200mA-2000mA的洗脱液，洗脱液减压浓缩（每个样1-2h,35℃）为固态浸膏，即得到初级馏分15个,编号从F.1到F.15依次编号。
初级馏分(15个样品都如此做)以少量甲醇溶解（1mL），加入合适的助溶剂（四氢呋喃，500μL）待分离；采用反相C18制备柱（购买自：上海鑫饰化工有限公司）进行次级馏分的制备，利用中压液相制备系统（购买自北京创新通恒有限公司型号：P3000A半制备），设置洗脱条件为：乙腈：水（100:0-0:100）梯度洗脱，根据信号峰出峰时间（出峰时间根据物质极性不同依极性由强到弱依次出峰）收集洗脱液，减压蒸馏（6-7天，40℃）至固态浸膏，得到次级馏分，共得到88个次级馏分（编号No.1-No.88）。
得到的次级馏分分别统一采用高效液相色谱仪（岛津LC-20A）分析（洗脱条件都为：乙腈：水【20:100～100:0】40min），得出结果之一见图1，该图出峰时间为25min,从而确定洗脱条件，洗脱条件指的是乙腈梯度设定从20%乙腈走梯度到100%乙腈40min,通过计算可以得出每分钟走2%，此图中出峰时间在25min,计算可得总共走了50%，加上起始的比例20%，可以得出25min对应的比例为70%。然后采用高压反相C18制备柱(购买自：日本YMC公司)进行制备，EngyodontiuminA从次级馏分No.14采用高压反相制备得到。采用核磁共振得出该化合物为单一化合物。
（6）结构鉴定
本发明综合应用质谱本（简称：MS）、核磁共振氢谱（简称：1H-NMR）、核磁共振碳谱（简称：13C-NMR）以及核磁共振二维谱（简称：2D-NMR）等分析技术对发酵产物中的化合物EngyodontiuminA进行结构鉴定。
本发明上述的深海真菌的分离、纯化、发酵方法为本领域公知的常规使用方法，在需要进一步确证的时候，很容易从有关的教材和相关的技术文献等查阅到包括技术细节在内的所有技术资料。
本发明上述的有机溶剂分离制备法所使用的有机溶剂是本领域的常规有机溶剂，包括甲醇溶液，正己烷溶液，乙酸乙酯溶液，乙腈溶液，四氢呋喃溶液。
3.单体化合物EngyodontiuminA的体外抑菌活性
本发明对单体化合物EngyodontiuminA在抑制真菌和细菌（革兰氏阳性菌：抗甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，革兰氏阴性菌：轮虫弧菌，坎式弧菌，创伤弧菌）方面的活性进行了多方面的试验，具体包括对黑曲霉，抗甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），轮虫弧菌，坎式弧菌，创伤弧菌的抑制试验。
以下为本发明发酵产物EngyodontiuminA的抗真菌和细菌试验。
单体化合物EngyodontiuminA的抗真菌和细菌（革兰氏阳性菌：抗甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，革兰氏阴性菌：轮虫弧菌，坎式弧菌，创伤弧菌）的实验研究：
本实验采用刃天青显色法作为检测活性的方法，刃天青显色法的原理是：活细胞中的乳酸脱氢酶能将刃天青(蓝色)转化为荧光物质试卤灵(粉红红色),产生荧光信号。试卤灵会继续被细胞还原为无荧光的物质二氢试卤灵(白色),使荧光信号下降,无活性的或死亡的细胞丧失了代谢能力而不能还原刃天青,也就不能产生荧光信号,所以该法能特异性检测活性细胞。
抑菌实验采用96孔板操作，96孔中颜色呈蓝色，则代表样品对目标菌株有抑制活性；96孔中颜色呈粉红色或红色，则代表样品对目标菌株没有抑制活性。荧光值在5000以下或由荧光值得出的抑制率为70%以上，则代表样品对目标菌株有很强的抑制作用；荧光值在5000到15000或由荧光值得出的抑制率在40%-70%，则代表样品对目标菌株有较好的抑制作用；荧光值在15000以上或抑制率在40%以下，则代表样品对目标菌株有微弱或无抑制作用。
目标菌株菌悬液制备：
取黑曲霉菌种（中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：ACCC31856-黑曲霉）接种于PDA平板上，37℃静置培养2-3天,挑取在新鲜PDA平板上培养了2-3天的黑曲霉孢子到含0.5%的吐温20(商购来源：生工生物，货号：TB0560)生理盐水中摇匀；然后用血球计数板在显微镜下计数。通过显微镜下计数计算出黑曲霉孢子菌悬液的各个浓度，然后用RPMI-1640培养基把黑曲霉孢子菌悬液稀释到2.5×104spores/mL（孢子数/毫升）。
取抗甲氧西林金黄色葡萄球菌（商购来源：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC1.12409）接种于5mL MHB培养液（厂商：北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：CM0405）中，于37℃180rpm/min振荡培养12小时后，用血球计数板计数，以MHB（厂商：北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：CM0405）培养液稀释菌悬液浓度到105CFU/mL（菌落数/毫升）。
实验菌株轮虫弧菌（商购来源：中国海洋微生物菌种保藏管理中心，MCCC E385）,坎氏弧菌（商购来源：中国海洋微生物菌种保藏管理中心，MCCC E333）,创伤弧菌（商购来源：中国海洋微生物菌种保藏管理中心，MCCC E1758），将三株菌分别接种于5mL LB培养液中，于37℃180rpm/min振荡培养3小时后，12000rpm/ml离心收集菌体，用LB培养液稀释调整菌悬液浓度，最终轮虫弧菌和坎式弧菌菌悬液浓度都调整为104CFU/mL（菌落数/毫升），创伤弧菌菌悬液浓度调整为105CFU/mL（菌落数/毫升），此浓度范围可以满足后续抗菌活性的要求。
刃天青溶液：用无菌水配置500μg/mL的刃天青（商购来源：国药化学试剂有限公司，货号：71035931）溶液。
化合物EngyodontiuminA溶液：用甲醇配置10μg/μL的溶液100ul备用。
在96微孔板的九孔中各加入基础组分20μL刃天青溶液，设三孔阴性对照组、三孔空白对照组、三孔实验组。
阴性对照组：
第一孔阴性对照溶液组分为：溶解化合物EngyodontiuminA的有机溶剂甲醇5μL+含RPMI-1640培养基（商购来源：Sigma，货号：）的黑曲霉175μL+20μL刃天青；第二孔阴性对照溶液组分为：溶解化合物EngyodontiuminA的有机溶剂甲醇5μL+含MHB培养基（商购来源：北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：CM0405）的MRSA175μL+20μL刃天青；第三孔阴性对照溶液组分为：溶解化合物EngyodontiuminA的有机溶剂甲醇5μL+含LB培养基的轮虫弧菌175μL+20μL刃天青基础组分；第四孔阴性对照溶液组分为：溶解化合物EngyodontiuminA的有机溶剂甲醇5μL+含LB培养基的坎氏弧菌175μL+20μL刃天青基础组分；第五孔阴性对照溶液组分为：溶解化合物EngyodontiuminA的有机溶剂甲醇5μL+含LB培养基的创伤弧菌175μL+20μL刃天青基础组分；
空白对照组：
第一孔空白对照溶液组分为：溶解化合物EngyodontiuminA的有机溶剂甲醇5μL+培养黑曲霉的RPMI-1640培养基（商购来源：Sigma，货号：）175μL+20μL刃天青；第二孔空白对照溶液组分为：溶解化合物EngyodontiuminA的有机溶剂甲醇5μL+培养MRSA的MHB培养基（商购来源：北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：CM0405）175μL+20μL刃天青；第三孔空白对照溶液组分为：溶解化合物EngyodontiuminA的有机溶剂甲醇5μL+培养轮虫弧菌的LB培养基175μL+20μL刃天青基础组分；第四孔空白对照溶液组分为：溶解化合物EngyodontiuminA的有机溶剂甲醇5μL+培养坎氏弧菌的LB培养基175μL+20μL刃天青基础组分；第五孔空白对照溶液组分为：溶解化合物EngyodontiuminA的有机溶剂甲醇5μL+培养创伤弧菌的LB培养基175μL+20μL刃天青基础组分；
实验组：
第一孔阴性对照溶液组分为：用甲醇溶解了的化合物EngyodontiuminA溶液5μL+含RPMI-1640培养基（商购来源：Sigma，货号：）的黑曲霉175μL+20μL刃天青；第二孔阴性对照溶液组分为：用甲醇溶解了的化合物EngyodontiuminA溶液5μL+含MHB培养基（商购来源：北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：CM0405）的MRSA175μL+20μL刃天青；第三孔阴性对照溶液组分为：用甲醇溶解了的化合物EngyodontiuminA溶液5μL+含LB培养基的轮虫弧菌175μL+20μL刃天青基础组分，第四孔阴性对照溶液组分为：用甲醇溶解了的化合物EngyodontiuminA溶液5μL+含LB培养基的坎氏弧菌175μL+20μL刃天青基础组分；第五孔阴性对照溶液组分为：用甲醇溶解了的化合物EngyodontiuminA溶液5μL+含LB培养基的创伤弧菌175μL+20μL刃天青基础组分；
将96孔板放入到37℃恒温培养箱中培养24h，24h后观察96微孔板中各个孔的颜色如图8所示；将实验组与阴性对照组和空白对照组做对比。一、二、三分别代表阴性对照组、空白对照组和实验组，从1到5分别代表黑曲霉、抗甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA、轮虫弧菌、坎式弧菌、创伤弧菌。由图8可以看出阴性对照组颜色呈粉红色或红色，是因为目标菌和刃天青溶液反应使溶液变红色，表明化合物EngyodontiuminA对目标菌株没有抑制活性；空白组呈蓝色是因无菌溶液无反应发生，溶液呈现刃天青溶液的本身颜色-蓝色；实验组颜色呈蓝色，是因化合物EngyodontiuminA对目标菌株有抑制活性，溶液呈现刃天青溶液本身的蓝色。
然后将96孔板中的溶液在酶标仪中测量激发波长为530nm发射波长为590nm处的荧光值并通过公式计数出抑制率。
抑制率公式：
抑制率%=100%-（实验孔荧光值-空白对照荧光值）/（阴性对照荧光值-空白对照荧光值）*100%
本发明的实施例提供了深海丝状真菌-白色侧齿霉Engyodontium album及其发酵产物中分离到的新化合物Engyodontium album以及其的抑菌性药理作用，从实施例的结果可以看出，本发明的化合物EngyodontiuminA具有很好的抑菌作用，包括真菌和细菌。本发明提供了一种能够用于制备抗多种真菌和细菌产品的原料，为新的活性药物开发打下基础。
附图说明
图1是任何1个次级馏分的高效液相色谱图。
图2是本发明化合物的核磁共振二维谱图。
图3A和图3B为质谱图，其中3A是指[M+Na]281.7质谱图，3B是指[M-H]257.7质谱图。
图4是核磁共振氢谱图。
图5是核磁共振碳谱图。
图6是1H-1HCOSY（—）图。
图7是HMBC图。
图8是刃天青显色法试验中24h后96微孔板中各个孔的颜色图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例所用化学试剂甲醇，正己烷，乙酸乙酯，乙腈，四氢呋喃均购自西陇化工股份有限公司。
实施例1：化合物EngyodontiuminA的制备
1.菌株来源：深海丝状真菌-白色侧齿霉Engyodontium album
2.发酵产物的制备方法
本实验所以化学试剂甲醇，正己烷，乙酸乙酯，乙腈，四氢呋喃均购自西陇化工股份有限公司。
（1）菌种的准备
使用海水PDA培养基（PDA培养基配方：取马铃薯200g，加葡萄糖20g，琼脂15-20g,用海水1L溶解混匀），高温灭菌，制成平板，置于常温状态下，严格无菌操作，超净台接种白色侧齿霉Engyodontium album菌丝体（保藏单位为中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：MCCC3A00236），于28℃下静置培养4-5天，作为菌种；
（2）发酵种子液制备
在多个锥形瓶中分别装入海水PDA液体培养基；于高温灭菌后，严格无菌操作，超净台接种上述步骤（1）所得Engyodontium album菌种，28℃下以180rpm/min振荡培养2-3天，将该培养物作为种子液；
（3）接种
采用固体发酵方式，准备发酵瓶，大米固体发酵培养基:每1L的三角锥瓶装大米105g,小黄米45g（食用大米和小黄米可在超市购得）,加入150mL PDA培养液，121℃，20min高温灭菌，15%接种量接种上述步骤（2）所得Engyodontium album菌种的种子液，28℃培养箱放置28天。
（4）萃取
待真菌发酵成熟后，加入乙酸乙酯500mL/瓶浸泡发酵产物，发酵产物溶入乙酸乙酯溶液中，浸泡24h后，将上层乙酸乙酯相倒出，下层为固体发酵产物。加入新的乙酸乙酯500mL/瓶，如此反复3次，每次浸泡24h，如此制备1.5L乙酸乙酯初提液。以1L乙酸乙酯和1.5L乙酸乙酯初提液为溶剂，采用高压乳化切割机碾碎下层的固体发酵产物，胞内物质溶解到上述2.5L乙酸乙酯混合液中，总共得到的乙酸乙酯混合液2.5L,用旋转蒸发仪将乙酸乙酯混合液2.5L减压浓缩（2-3h,35℃）至固态浸膏，得到初级浸膏。
（5）单体分离纯化
所得初级浸膏与正相硅胶（规格：200-300目，国药集团化学试剂有限公司）拌样成粉状，拌样比例1:3左右，样品为1g，拌样的硅胶为3g，将拌好的粉末样品加入空柱中（上海鑫饰化工有限公司）待分离；将装有粉末样品的柱子与购买的正相硅胶柱（规格：，购买自：上海鑫饰化工有限公司）连接，利用中压液相制备系统（购买自北京创新通恒有限公司，型号：P3000A半制备）进行洗脱，设置正己烷-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇层析比例，分别为：正己烷-乙酸乙酯（80:20,60:40,40:60,20:80,0:100），乙酸乙酯-甲醇（70:30,0:100），在中压液相制备系统中254nm下接收分离后出峰信号，根据信号峰出峰的先后顺序（出峰顺序根据物质极性不同依极性由弱到强依次出峰）依次收集峰值在200mA-2000mA的洗脱液，洗脱液减压浓缩（每个样1-2h,35℃）为固态浸膏，即得到初级馏分15个,编号F.1-F.15。
初级馏分(15个样品都如此做)以少量甲醇溶解（1mL），加入合适的助溶剂（四氢呋喃，500μL）待分离；采用反相C18制备柱（购买自：上海鑫饰化工有限公司）进行次级馏分的制备，利用中压液相制备系统（购买自北京创新通恒有限公司型号：P3000A半制备），设置洗脱条件为：乙腈：水（100:0-0:100）梯度洗脱，根据信号峰出峰时间（出峰时间根据物质极性不同依极性由强到弱依次出峰）收集洗脱液，减压蒸馏（6-7天，40℃）至固态浸膏，得到次级馏分，共得到88个次级馏分（编号从No.1到No.88依次编号）。
得到的次级馏分分别统一采用高效液相色谱仪（岛津LC-20A）分析（洗脱条件都为：乙腈：水【20:100～100:0】40min），得出结果之一见图1，该图出峰时间为25min,从而确定洗脱条件洗脱条件指的是乙腈梯度设定从20%乙腈走梯度到100%乙腈40min,通过计算可以得出每分钟走2%，此图中出峰时间在25min,计算可得总共走了50%，加上起始的比例20%，可以得出25min对应的比例为70%。然后采用高压反相C18制备柱(购买自：日本YMC公司)进行制备，EngyodontiuminA从次级馏分No.14采用高压反相制备得到。采用核磁共振得出该化合物为单一化合物。
实施例2：化合物EngyodontiuminA的鉴定方法
本实施例综合应用质谱（简称：MS）、核磁共振氢谱（简称：1H-NMR）、核磁共振碳谱（简称：13C-NMR）以及核磁共振二维谱（简称：2D-NMR）等分析技术对发酵产物中的化合物EngyodontiuminA进行结构鉴定。
化合物EngyodontiuminA具有如下理化性质：
该化合物为黄色结晶，分子式：C12H15ClO4，精确分子量为258.0659，易溶于甲醇，乙醇等极性较大的有机溶剂，能溶解于氯仿，微溶于水。化合物EngyodontiuminA的质谱：ESIMS m/z[M+Na]281.7，[M-H]257.7,如图3A和图3B所示；化合物EngyodontiuminA的核磁共振氢谱如图4所示、化合物EngyodontiuminA的核磁共振碳谱如图5所示。
化合物EngyodontiuminA的核磁共振氢谱数据：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.00(s,br,1H,OH),6.69(s,1H,H-2),3.89(s,3H,H-9),3.81(s,3H,H-8),2.59(m,2H,H2-10),1.51(dq,J=15.0,7.3Hz,2H,H2-11),0.90(t,J=7.3Hz,3H,H3-12).
化合物EngyodontiuminA的核磁共振碳谱数据：
13C NMR(101MHz,DMSO)δ168.29(C-7),155.45(C-3),154.91(C-4),137.40(C-6),119.41(C-5),112.55(C-1),95.49(C-2),56.36(C-8),56.07(C-9),33.05(C-10),22.50(C-11),14.14(C-12).
由HMBC(→)图7和1H-1H COSY(—)图6标注出化合物EngyodontiuminA的核磁共振二维谱见图2。
综上，化合物EngyodontiuminA分子式为：C12H15ClO4，分子量为258.0659，结构式为：
实施例3：化合物EngyodontiuminA的效果试验
单体化合物EngyodontiuminA的抗真菌（黑曲霉）和细菌（革兰氏阳性菌：抗甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，革兰氏阴性菌：轮虫弧菌，坎式弧菌，创伤弧菌）的实验研究：
本实验采用刃天青显色法作为检测活性的方法，刃天青显色法的原理是：活细胞中的乳酸脱氢酶能将刃天青(蓝色)转化为荧光物质试卤灵(粉红红色),产生荧光信号。试卤灵会继续被细胞还原为无荧光的物质二氢试卤灵(白色),使荧光信号下降,无活性的或死亡的细胞丧失了代谢能力而不能还原刃天青,也就不能产生荧光信号,所以该法能特异性检测活性细胞。
抑菌实验采用96孔板操作，96孔中颜色呈蓝色，则代表样品对目标菌株有抑制活性；96孔中颜色呈粉红色或红色，则代表样品对目标菌株没有抑制活性。荧光值在5000以下或由荧光值得出的抑制率为70%以上，则代表样品对目标菌株有很强的抑制作用；荧光值在5000到15000或由荧光值得出的抑制率在40%-70%，则代表样品对目标菌株有较好的抑制作用；荧光值在15000以上或抑制率在40%以下，则代表样品对目标菌株有微弱或无抑制作用。
目标菌株菌悬液制备：
取黑曲霉菌种（中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：ACCC31856-黑曲霉）接种于PDA平板上，37℃静置培养2-3天,挑取在新鲜PDA平板上培养了2-3天的黑曲霉孢子到含0.5%的吐温20(商购来源：生工生物，货号：TB0560)生理盐水中摇匀；然后用血球计数板在显微镜下计数。通过显微镜下计数计算出黑曲霉孢子菌悬液的各个浓度，然后用RPMI-1640培养基把黑曲霉孢子菌悬液稀释到2.5×104spores/mL（孢子数/毫升）。
取抗甲氧西林金黄色葡萄球菌（商购来源：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC1.12409）接种于5mL MHB培养液（厂商：北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：CM0405）中，于37℃180rpm/min振荡培养12小时后，用血球计数板计数，以MHB（厂商：北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：CM0405）培养液稀释菌悬液浓度到105CFU/mL（菌落数/毫升）。
实验菌株轮虫弧菌（商购来源：中国海洋微生物菌种保藏管理中心，MCCC E385）,坎氏弧菌（商购来源：中国海洋微生物菌种保藏管理中心，MCCC E333）,创伤弧菌（商购来源：中国海洋微生物菌种保藏管理中心，MCCC E1758），将三株菌分别接种于5mL LB培养液中，于37℃180rpm/min振荡培养3小时后，12000rpm/ml离心收集菌体，用LB培养液稀释调整菌悬液浓度，最终轮虫弧菌和坎式弧菌菌悬液浓度都调整为104CFU/mL（菌落数/毫升），创伤弧菌菌悬液浓度调整为105CFU/mL（菌落数/毫升），此浓度范围可以满足后续抗菌活性的要求。
刃天青溶液：用无菌水配置500μg/mL的刃天青（商购来源：国药化学试剂有限公司，货号：71035931）溶液。
化合物EngyodontiuminA溶液：用甲醇配置10μg/μL的溶液100ul备用。
在96微孔板的九孔中各加入基础组分20μL刃天青溶液，设三孔阴性对照组、三孔空白对照组、三孔实验组。
阴性对照组：
第一孔阴性对照溶液组分为：甲醇5μL+含RPMI-1640培养基（商购来源：Sigma，货号：）的黑曲霉175μL+20μL刃天青；第二孔阴性对照溶液组分为：甲醇5μL+含MHB培养基（商购来源：北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：CM0405）的MRSA175μL+20μL刃天青；第三孔阴性对照溶液组分为：甲醇5μL+含LB培养基的轮虫弧菌175μL+20μL刃天青基础组分；第四孔阴性对照溶液组分为：甲醇5μL+含LB培养基的坎氏弧菌175μL+20μL刃天青基础组分；第五孔阴性对照溶液组分为：甲醇5μL+含LB培养基的创伤弧菌175μL+20μL刃天青基础组分；
空白对照组：
第一孔空白对照溶液组分为：甲醇5μL+培养黑曲霉的RPMI-1640培养基（商购来源：Sigma，货号：）175μL+20μL刃天青；第二孔空白对照溶液组分为：甲醇5μL+培养MRSA的MHB培养基（商购来源：北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：CM0405）175μL+20μL刃天青；第三孔空白对照溶液组分为：甲醇5μL+培养轮虫弧菌的LB培养基175μL+20μL刃天青基础组分；第四孔空白对照溶液组分为：甲醇5μL+培养坎氏弧菌的LB培养基175μL+20μL刃天青基础组分；第五孔空白对照溶液组分为：甲醇5μL+培养创伤弧菌的LB培养基175μL+20μL刃天青基础组分；
实验组：
第一孔溶液组分为：化合物EngyodontiuminA溶液5μL+含RPMI-1640培养基（商购来源：Sigma，货号：）的黑曲霉175μL+20μL刃天青；第二孔溶液组分为：化合物EngyodontiuminA溶液5μL+含MHB培养基（商购来源：北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：CM0405）的MRSA175μL+20μL刃天青；第三孔溶液组分为：化合物EngyodontiuminA溶液5μL+含LB培养基的轮虫弧菌175μL+20μL刃天青基础组分，第四孔溶液组分为：化合物EngyodontiuminA溶液5μL+含LB培养基的坎氏弧菌175μL+20μL刃天青基础组分；第五孔溶液组分为：化合物EngyodontiuminA溶液5μL+含LB培养基的创伤弧菌175μL+20μL刃天青基础组分；
将96孔板放入到37℃恒温培养箱中培养24h，24h后观察96微孔板中各个孔的颜色如图8所示；将实验组与阴性对照组和空白对照组做对比。一、二、三分别代表阴性对照组、空白对照组和实验组，从1到5分别代表黑曲霉、抗甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA、轮虫弧菌、坎式弧菌、创伤弧菌。由图8可以看出阴性对照组颜色呈粉红色或红色，是因为阴性对照中没有化合物EngyodontiuminA，故目标菌是有活性的，可以和刃天青溶液反应使溶液变红色；空白组呈蓝色是因无菌溶液无反应发生，溶液呈现刃天青溶液的本身颜色-蓝色；实验组颜色呈蓝色，是因化合物EngyodontiuminA抑制了目标菌株的活性，所以溶液呈现刃天青溶液本身的蓝色。
然后将96孔板中的溶液在酶标仪中测量激发波长为530nm发射波长为590nm处的荧光值并通过公式计数出抑制率。
抑制率公式：
抑制率%=100%-（实验孔荧光值-空白对照荧光值）/（阴性对照荧光值-空白对照荧光值）*100%
抗菌活性结果见表1：
从表1可以看出，化合物EngyodontiuminA对黑曲霉的抑制率是85.62%，化合物EngyodontiuminA对抗甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抑制率是76.52%；化合物EngyodontiuminA对轮虫弧菌、坎氏弧菌、创伤弧菌的抑制率都是100%；表明化合物EngyodontiuminA对真菌和细菌有抑制活性。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.一种化合物EngyodontiuminA的制备方法，其特征在于，其分子式为C12H15ClO4，分子量为258.0659，具有如下结构式，
包括如下步骤，
菌种的准备：使用海水PDA培养基，高温灭菌，制成平板，置于常温状态下，接种白色侧齿霉Engyodontium album菌丝体培养，作为菌种；所述海水PDA培养基成分为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，1L海水；
发酵种子液制备：在多个锥形瓶中分别装入海水PDA液体培养基，高温灭菌后，接种上述菌种培养，将该培养物作为种子液；
接种：采用固体发酵方式，准备发酵瓶，加入大米固体发酵培养基，接种上述种子液，培养；所述大米固体发酵培养基为每1L的三角锥瓶装大米105g，小黄米45g，PDA培养基150ML，121℃，20min，高温灭菌；
萃取：待真菌发酵成熟后，加入乙酸乙酯500mL/瓶浸泡发酵产物，发酵产物溶入乙酸乙酯溶液中，浸泡后，将上层乙酸乙酯相倒出，下层为固体发酵产物；加入新的乙酸乙酯500mL/瓶，此步骤反复多次，每次浸泡一段时间，如此制备得到乙酸乙酯初提液；以乙酸乙酯和所得到的乙酸乙酯初提液为混合溶剂，采用高压乳化切割机碾碎下层的固体发酵产物，胞内物质溶解到上述混合溶剂中，得到乙酸乙酯混合液,用旋转蒸发仪将乙酸乙酯混合液减压浓缩至固态浸膏，得到初级浸膏；
单体分离纯化：所得初级浸膏与正相硅胶拌样成粉状，将拌好的粉末样品加入空柱中待分离；将装有粉末样品的柱子与正相硅胶柱连接，利用中压液相制备系统进行洗脱，设置正己烷-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇层析比例，在中压液相制备系统中接收分离后出峰信号，根据信号峰出峰的先后顺序依次收集峰值在200mA-2000mA的洗脱液，将洗脱液用旋转蒸发仪在35摄氏度24h真空浓缩为固态浸膏，即得到初级馏分15个,编号从F.1到F.15依次编号，每个初级馏分的量是2g-3g；
初级馏分分别以少量甲醇溶解，加入合适的助溶剂待分离；采用反相C18制备柱进行次级馏分的制备，利用中压液相制备系统进行梯度洗脱，根据信号峰出峰时间收集洗脱液，将洗脱液用旋转蒸发仪在40摄氏度2-3天真空浓缩至固态浸膏，得到次级馏分，共得到88个次级馏分，编号从No.1到No.88依次编号，每个次级馏分的量是20mg-300mg；
第NO.14的次级馏分采用高效液相色谱仪处理，仪器上体现目标化合物的出峰时间在25min左右，然后采用高压反相C18制备柱制备收集得到化合物EngyodontiuminA。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述菌种的准备中，所述高温灭菌为121℃，20min；所述培养为于28℃下静置培养4-5天。
3.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵种子液制备中，高温灭菌为121℃，20min；所述培养为28℃下以180rpm/min振荡培养2-3天。
4.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述接种为中种子液的接种量为15％；28℃培养箱放置28天。
5.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述萃取中，每瓶加入乙酸乙酯500mL浸泡发酵产物，所述浸泡时间为24h，所述多次是三次，每次浸泡24h；所述混合溶剂中，乙酸乙酯与乙酸乙酯初提液的体积比为2：3；所述减压浓缩条件为2-3h，35℃。
6.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述单体分离纯化中，所得初级浸膏与正相硅胶的重量比例为1:3；所述正相硅胶柱规格为所述正己烷-乙酸乙酯体积比例为80:20,60:40,40:60,20:80,0:100，所述乙酸乙酯-甲醇体积比例为70:30,0:100；所述洗脱液减压浓缩条件为每个样1-2h，35℃；
初级馏分以1mL甲醇溶解，加入四氢呋喃，500μL待分离；采用反相C18制备柱进行次级馏分的制备，利用中压液相制备系统，设置洗脱条件为：乙腈：水＝100:0-0:100梯度洗脱，根据信号峰出峰时间收集洗脱液，将洗脱液用旋转蒸发仪在40摄氏度2-3天真空浓缩至固态浸膏，得到次级馏分，共得到88个次级馏分，依次编号No.1-No.88。
CN201310722849.5A 2013-12-24 2013-12-24 一种深海真菌次生代谢产物中的化合物EngyodontiuminA、制备方法及其用途 Expired - Fee Related CN103724190B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310722849.5A CN103724190B (zh) 2013-12-24 2013-12-24 一种深海真菌次生代谢产物中的化合物EngyodontiuminA、制备方法及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310722849.5A CN103724190B (zh) 2013-12-24 2013-12-24 一种深海真菌次生代谢产物中的化合物EngyodontiuminA、制备方法及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103724190A CN103724190A (zh) 2014-04-16
CN103724190B true CN103724190B (zh) 2016-08-24

Family

ID=50448527

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310722849.5A Expired - Fee Related CN103724190B (zh) 2013-12-24 2013-12-24 一种深海真菌次生代谢产物中的化合物EngyodontiuminA、制备方法及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103724190B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110699473A (zh) * 2019-11-27 2020-01-17 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108004151B (zh) * 2018-01-15 2019-07-19 青岛农业大学 一种从海带中分离的翅孢壳真菌及其应用
CN112011465A (zh) * 2020-09-02 2020-12-01 闽江学院 深海真菌白色侧齿霉菌原生质体的制备及遗传转化方法
CN112646786A (zh) * 2021-01-21 2021-04-13 海南海壹水产种苗有限公司 一株坎式弧菌噬菌体快速初步分离方法
CN114957034B (zh) * 2022-06-28 2023-06-23 广西中医药大学 一种氨基酸衍生物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"18 株南海海洋真菌的初步鉴定及其发酵产物的细胞毒活性和抗菌活性筛选";张玲等;《热带海洋学报》;20130531;第32卷(第3期);47-51 *
"Antimicrobial and cytotoxic secondary metabolites from tropical leaf endophytes: Isolation of antibacterial agent pyrrocidine C from Lewia infectoria SNB-GTC2402";Thiago M. Casella;《Phytochemistry》;20131101;第96卷;370-377页，第371页2.3.1节第1段第9-12行、图2、表2 *
"中国南海黑乳海参共附生白色侧齿霉菌中的甾体类成分";宫俊等;《第二军医大学学报》;20130331;第34卷(第3期);310-314 *
"黄海、长江口沉积物中真菌属种多样性初步研究";冯春辉;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;20130315(第3期);A006-232 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110699473A (zh) * 2019-11-27 2020-01-17 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103724190A (zh) 2014-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103724190B (zh) 一种深海真菌次生代谢产物中的化合物EngyodontiuminA、制备方法及其用途
Pimenta et al. Use of experimental design for the optimization of the production of new secondary metabolites by two Penicillium species
Padhi et al. Funiculosone, a substituted dihydroxanthene-1, 9-dione with two of its analogues produced by an endolichenic fungus Talaromyces funiculosus and their antimicrobial activity
Cheng et al. Secondary metabolites from the endophytic fungus Biscogniauxia formosana and their antimycobacterial activity
CN108892658B (zh) 化合物lithocarpinol B及其制备方法和在制备抗真菌药物中的应用
CN106010980B (zh) 一种内生真菌巴西类壳小圆孢菌株及其应用
CN103740606A (zh) 植生链霉菌及其产生新抗生素诺沃巢霉素的方法与应用
CN109336873A (zh) 化合物lithocarolsA-F及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用
CN103103134B (zh) 一种蛇足石杉内生真菌及其产石杉碱甲的应用
CN105348247B (zh) 一种异香豆素类化合物及其制备方法和应用
CN107417559B (zh) 一种倍半萜类化合物及其制备方法和应用
CN110330544A (zh) 一种4,4,1-双环甾类化合物及其制备方法和用途
CN103058974A (zh) 天然化合物及其制备方法和用途
CN105601607B (zh) 化合物acaromycin A及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用
CN102746995B (zh) 制备isochromophilone VIII的方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN102477400B (zh) 一种刺盘孢菌及其应用
CN108913606A (zh) 一种海洋抗耐药菌活性物质及制备和用途
CN112795617B (zh) 海洋真菌次级代谢物及其制备与应用
CN108558606A (zh) 一种二倍半萜类化合物peniroquesines及其制备方法和应用
CN107488594A (zh) 一株新青霉菌及其代谢产物安他拟酸a
CN105476983B (zh) 一种深海真菌来源化合物Prenylcandidusin C的用途
CN103820331A (zh) 闽浙马尾杉内生真菌及其产石杉碱甲的方法和应用
CN103820332B (zh) 蛇足石杉内生真菌及其产石杉碱甲的方法和应用
CN103014090A (zh) 一种从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6h)酮-1，10-二羟基，3 -甲基-7，8-二甲氧的方法
CN102452916B (zh) 一类芳香聚酮及其提取方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160824