CN103014090A - 一种从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6h)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3-甲基-7,8-二甲氧的方法,包括:1)活化菌株;2)初级培养;3)次级培养;4)减压抽滤得到菌丝体,菌丝体恒温干燥;5)研磨,过筛;6)多次进行200~300目硅胶柱层析,得到的流分旋蒸浓缩,氯仿洗出,自然挥干,甲醇重结晶,得产品。本发明以繁殖快、周期短的真菌为材料,成本低,操作简单,重复性好,无需昂贵的仪器,通过多次进行硅胶柱层析,得到一种新化合物双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3-甲基-7,8-二甲氧,通过对人类胃癌细胞株BGC823进行活性测定,得到的数据说明该种新化合物有优异的抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明属于新物质提取领域,具体涉及一种从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧的方法。
背景技术
莫勒菌(Moelleriella)是虫生真菌的重要成员,其无性型为类座壳孢(Aschersonia-like),由于它能引起粉虱和介壳类昆虫群体性流行病的发生,这使得它有可能成为有用的生物防治剂。随着研究的深入,近年来人们发现莫勒菌的代谢产物具有抗菌、抗肿瘤和抗疟原虫等生物活性,这预示该菌在生物农药或医药上存在很大应用价值。
由于人们在现代社会患癌症的概率较大,因此,寻找不同来源的抗癌药物已经越来越得到人们的关注。虫生真菌的代谢产物中含有多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇等多种具有杀虫、抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性物质,因此,充分开发利用虫生真菌,将有利于人类医疗水平的发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧的方法,本发明以繁殖快、周期短的真菌为材料,成本低,操作简单,重复性好,无需昂贵的仪器,通过多次进行硅胶柱层析,得到一种新化合物,通过对人类胃癌细胞株BGC823进行活性测定,得到的数据说明该种新化合物有优异的抗肿瘤活性,促进其药理学的研究和作为先导化合物的开发和应用。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧的方法包括以下步骤:
(1)将莫勒菌(邱君志等,赭色小莫勒菌在中国的发现. 菌物学报,2009. 28(1): 148-150)活化后,取菌块接种PDB培养基中,在160r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养,按10%接种量再次转接到PDB培养基中,继续在160r/min、25℃条件下连续培养28天即次级培养;
(2)减压抽滤得到菌丝体,菌丝体在40℃下恒温干燥后研磨成粉状,过筛,用乙酸乙酯浸泡,超声,重复3次;合并浸泡液,旋蒸得菌丝体浸膏;
(3)将菌丝体浸膏上200~300目硅胶柱,进行粗分;先用石油醚洗脱,之后换石油醚:二氯甲烷体积比=10:1洗脱,收集该部位洗脱液,旋蒸浓缩;
(4)将步骤(3)得到的浓缩物继续上200~300目硅胶柱,以石油醚:丙酮体积比=25:1梯度洗脱,收集石油醚:丙酮体积比=20:1部位洗脱液,旋蒸浓缩;
(5)将步骤(4)得到的浓缩物进一步上200~300目硅胶柱,先以石油醚洗脱,之后换石油醚:丙酮体积比=20:1梯度洗脱,最后以二氯甲烷:丙酮体积比=10:1梯度洗脱,收集二氯甲烷:丙酮体积比=1:1部位洗脱液,旋蒸浓缩,氯仿洗出,自然挥干,甲醇重结晶,即得到双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧,结构式如下:
。
所述步骤(1)中接种菌块的大小为0.5×0.5cm,接种量为4块。所述PDB培养基的制备为:马铃薯去皮,切块,称取200g,沸水煮30min,6层纱布过滤,称取20g葡萄糖,加蒸馏水定容至1000mL,pH自然。高压灭菌121℃,20min。
所述步骤(2)中要用3倍体积乙酸乙酯浸泡24小时,超声1小时。
所述重结晶具体操作为:用氯仿将得到的含有少量杂质的双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧溶解,自然挥干,待晶体析出后,再用甲醇洗去杂质,析出弃掉,剩余的晶体再用甲醇溶解后重结晶,直至获得单一的双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧。
本发明的有益效果在于:本发明以繁殖快、周期短的真菌为材料,成本低,操作简单,重复性好,无需昂贵的仪器,通过多次进行硅胶柱层析,制得了一种新化合物双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧。通过对人类胃癌细胞株BGC823进行活性测定,得到的数据说明该种新化合物有优异的抗肿瘤活性。
具体实施方式
实施例1:双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧的制备
1)将莫勒菌(本实验室野外采集,分离纯化并保藏菌株)活化后,以0.5×0.5cm(4块)接种于 PDB培养基(马铃薯去皮,切块,称取200g,沸水煮30min, 6层纱布过滤,称取20g葡萄糖,加蒸馏水定容至1000mL,pH自然。分装到250ml三角瓶中,每瓶装100ml,高压灭菌121℃,20min。)中,在160r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养,按10%接种量再次转接到PDB培养基中,继续在160r/min、25℃条件下连续培养28天即次级培养;
2)减压抽滤得到菌丝体,菌丝体在40℃下恒温干燥后研磨成粉状,过筛,用3倍乙酸乙酯浸泡,超声,重复3次。合并浸泡液,旋蒸得菌丝体浸膏。
3)将菌丝体浸膏上200~300目硅胶柱,进行粗分。先用石油醚洗脱,之后换石油醚:二氯甲烷体积比=10:1洗脱,收集该部位洗脱液,旋蒸浓缩。
4)将3)中得到的浓缩物继续上200~300目硅胶柱,以石油醚:丙酮体积比=25:1梯度洗脱,收集石油醚:丙酮体积比=20:1部位洗脱液,旋蒸浓缩。
5)将4)中得到的浓缩物进一步上200~300目硅胶柱,先以石油醚洗脱,之后换石油醚:丙酮体积比=20:1梯度洗脱,最后以二氯:丙酮体积比=10:1梯度洗脱,收集二氯:丙酮体积比=1:1部位洗脱液,旋蒸浓缩,氯仿洗出,自然挥干,甲醇重结晶,经HREIMS、NMR、HMBC谱图分析得到一种新化合物双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧。
产物的表征数据如下:1H NMR(CDCl3, 600MHz, ppm): δ13.42 (s, 1H, OH-1), δ12.18 (s, 1H, OH-10), δ6.55 (d, J=1.70Hz, 1H, H-2),δ6.53 (s, 1H, H-9),δ6.39 (d, J=1.70Hz, 1H, H-4), δ5.19 (s,2H, H-6), 3.95 (s, 3H, OCH3-8), δ3.84 (s, 3H, OCH3-7), δ2.31 (s, 3H, H-12)。
13C NMR (CDCl3, 600MHz, ppm): δ195.3 (C-11), δ165.8 (C-1), δ161.9 (C-4a), δ161.8 (C-10), δ159.3 (C-8), δ149.5 (C-3), δ138.5 (C-7), δ130.9 (C-6a), δ114.4 (C-10a), δ113.2 (C-2), δ111.0 (C-11a), δ110.8 (C-4), δ101.2 (C-9), δ66.7 (C-6), δ62.2 (OCH3-7), δ56.1 (OCH3-8), δ21.9(CH3 -12)。
实施例2:抗肿瘤活性的实验
采用实施例1得到的化合物进行如下实验:
细胞系及其培养条件:本发明所用细胞系是人类胃癌细胞株BGC823。细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,其中含有每毫升100单位青霉素和100微克链霉素,细胞接种于直径为10厘米的培养皿后,37℃、5%CO2环境中培养,细胞长满时用胰蛋白酶消化法进行传代。
细胞毒性测试:细胞毒性采用MTT法测定。将细胞用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液,采用血球计算版进行活细胞数,调整活细胞浓度为5×104每毫升接种于96孔培养板,每孔160微升。将培养板放入CO2培养箱中,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24小时。在细胞贴壁后,将培养液吸弃,以无双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧处理的细胞为对照组,以不同浓度双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧处理的细胞为实验组,各浓度分别设置3个复孔。当培养结束前4小时,每孔加入20微升MTT。培养箱中继续孵育4小时,弃上清,每孔加入100微升DMSO,震荡10分钟,置酶标仪测定OD值,波长设置为490nm。按下列公式计算存活率,同时作图并求得半数杀伤度(IC50),评价药物的细胞毒性。
存活率%=加药孔平均OD值/对照孔平均OD值×100%
经作图计算得双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧对人类胃癌细胞株BGC823的IC50为10 μg/mL。
上述实施例制得的新化合物对人类胃癌细胞株BGC823有优异的抗肿瘤活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧的方法,其特征在于:所述的方法包括以下步骤:
(1)将莫勒菌活化后,取菌块接种PDB培养基中,在160r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养,按10%接种量再次转接到PDB培养基中,继续在160r/min、25℃条件下连续培养28天即次级培养;
(2)减压抽滤得到菌丝体,菌丝体在40℃下恒温干燥后研磨成粉状,过筛,用乙酸乙酯浸泡,超声,重复3次;合并浸泡液,旋蒸得菌丝体浸膏;
(3)将菌丝体浸膏上200~300目硅胶柱,进行粗分;先用石油醚洗脱,之后换石油醚:二氯甲烷体积比=10:1洗脱,收集该部位洗脱液,旋蒸浓缩;
(4)将步骤(3)得到的浓缩物继续上200~300目硅胶柱,以石油醚:丙酮体积比=25:1梯度洗脱,收集石油醚:丙酮体积比=20:1部位洗脱液,旋蒸浓缩;
(5)将步骤(4)得到的浓缩物进一步上200~300目硅胶柱,先以石油醚洗脱,之后换石油醚:丙酮体积比=20:1梯度洗脱,最后以二氯甲烷:丙酮体积比=10:1梯度洗脱,收集二氯甲烷:丙酮体积比=1:1部位洗脱液,旋蒸浓缩,氯仿洗出,自然挥干,甲醇重结晶,即得到双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧,结构式如下:
2.根据权利要求1所述的从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧的方法,其特征在于:所述步骤(1)中接种菌块的大小为0.5×0.5cm,接种量为4块。
3.根据权利要求1所述的从莫勒菌中提取双苯恶庚因-11(6H)酮-1,10-二羟基,3 -甲基-7,8-二甲氧的方法,其特征在于:所述步骤(2)中要用3倍体积乙酸乙酯浸泡24小时,超声1小时。
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