CN107739362B - 源于杂色曲霉蒽醌类化合物及制备抗人食管癌药物的应用 - Google Patents

源于杂色曲霉蒽醌类化合物及制备抗人食管癌药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种源于杂色曲霉的蒽醌类化合物及制备抗人食管癌药物的应用。该化合物具有抑制食管癌细胞增殖作用。其结构式为：。通过发酵培养杂色曲霉(Aspergillus versicolor)IBPT‑7，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物。经实验证实，该化合物对人食管癌细胞EC9706具有较好的抗肿瘤活性。可作为制备人食管癌细胞增殖抑制药物或抗肿瘤药物用于人食管癌的研究。

Description

源于杂色曲霉蒽醌类化合物及制备抗人食管癌药物的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种源于杂色曲霉的蒽醌类化合物及制备抗人食管癌药物的应用。
背景技术
蒽醌类化合物在天然药物中存在广泛且有重要的药理功效，如中药黄精、紫草、丹参、大黄、雷公藤等植物中都含有大量蒽醌类化合物，具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等多种功效，特别是在癌症、心血管疾病、老年痴呆、爱滋病等重大疾病防治上应用广泛，研究成果众多，受到全球科学家和医药人士的普遍关注。其中在抗肿瘤领域，其作用机理主要表现在诱导肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤细胞多药抗药性作用、酶抑制剂、影响肿瘤细胞的增殖及细胞周期、抑制肿瘤细胞的代谢、对肿瘤细胞的杀伤和诱变等起作用。近年研究表明，一些海洋真菌也能够在次级代谢过程中产生结构新颖、活性好的蒽醌类化合物，具有很好的药用和产业化前景。
本发明人研究得知，杂色曲霉， (已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址: 武汉 武汉大学，保藏编号是：CCTCC NO：M 2013715) 的发酵产物的粗提取物有很好的细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行研究。研究发现所示蒽醌类化合物具有抗人食管癌活性，目前尚未见该化合物对人食管癌细胞的增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种源于杂色曲霉的蒽醌类化合物及其制备抗人食管癌药物的应用。该化合物具有抑制人食管癌细胞增殖作用，具有抗人食管癌活性。其结构式为：
。
该化合物的制备方法，是通过发酵培养杂色曲霉，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物。具体步骤如下：
1发酵生产
培养微生物的常规方法，取杂色曲霉接种到PDA固体斜面培养基上在28℃培养箱中培养2至3天，然后接种到SWS培养液中，28℃静止培养30天后，获得菌丝体和发酵液20升；所述培养液组成：每升水含淀粉10.0 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 20.0 g。
2 浸膏的获得
将杂色曲霉发酵培养液 (约20 L)，经由纱布过滤后分为菌丝体和发酵液两部分。发酵液部分按体积比1:2加入乙酸乙酯，经两次萃取，将所得的乙酸乙酯萃取液合并减压浓缩至近干，收取发酵液乙酸乙酯浸膏。菌丝体则用含70%-80%丙酮的水溶液超声破壁3次，除去残渣将清液合并后经减压浓缩去除丙酮，按体积比为1:2加入乙酸乙酯萃取两次，减压浓缩至近干得菌丝体浸膏。将发酵液乙酸乙酯浸膏和菌丝体浸膏两部分合并后得到提取物浸膏共6.0 g。
3 化合物的分离精制
浸膏（6.0 g）通过100-200目硅胶拌样，以石油醚：二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱液，进行减压硅胶色谱柱层析。经过简单的薄层色谱分析，合并，分离成组分A-F。组分E(1.1 g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:1的洗脱物)以二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱剂，进行加压柱硅胶色谱层析，经过薄层色谱分析后合并得到五个亚组分E1-E5。组分E2 (0.3 g) 以三氯甲烷：甲醇=1:2为洗脱剂，进行凝胶柱层析（Sephadex LH-20），经过薄层色谱分析后合并得到四个亚组分E2-1~E2-4。E2的亚组分E2-2 (93 mg) 通过半制备液相色谱(1010型ODS-A，10×250mm，5 μm)：分离流速为5 mL/min，流动相为75%乙腈含0.1% TFA，得到所示化合物 (3.4 mg，tR 9.1 min)。
所述杂色曲霉 (Aspergillus versicolor) IBPT-7，已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址: 武汉 武汉大学，保藏编号是：CCTCC NO：M 2013715。
本发明还保护了所述的化合物在制备抑制人食管癌细胞增殖药物中的应用，及该化合物在制备抗人食管癌药物中的应用。
本发明的显著优点：研究所示该蒽醌化合物未见报道且具有显著的抑制人食管癌增殖活性，目前尚未见该化合物对人食管癌细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
附图说明
图1化合物主要的COSY，HMBC和NOE信号。
具体实施方式
在如下的实施例中所指的化合物的化学结构：
实施例1该化合物的发酵生产及分离精制
1发酵生产
生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取杂色曲霉 (Aspergillus versicolor) IBPT-7 (已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址: 武汉武汉大学，保藏编号是：CCTCC NO：M 2013715) 适量，接种到PDA固体斜面培养基上在28℃培养箱中培养2至3天。
取斜面培养2至3天的杂色曲霉适量， 接种到SWS培养液中，28℃静止培养30天后，获得菌丝体和发酵液20L；所述培养液组成：每升水含淀粉10.0 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 20.0g。
2 浸膏的获得
将杂色曲霉发酵培养液 (约20 L)，经由纱布过滤后分为菌丝体和发酵液两部分。发酵液部分按体积比1:2加入乙酸乙酯，经两次萃取，将所得的乙酸乙酯萃取液合并减压浓缩至近干，收取发酵液乙酸乙酯浸膏。菌丝体则用含70%-80%丙酮的水溶液超声破壁3次，除去残渣将清液合并后经减压浓缩去除丙酮，按体积比为1:2加入乙酸乙酯萃取两次，减压浓缩至近干得菌丝体浸膏。将发酵液乙酸乙酯浸膏和菌丝体浸膏两部分合并后得到提取物浸膏共6.0 g。
3 化合物的分离精制
浸膏（6.0 g）通过100-200目硅胶拌样，以石油醚：二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱液，进行减压硅胶色谱柱层析。经过简单的薄层色谱分析，合并，分离成组分A-F。组分E(1.1 g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:1的洗脱物)以二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱剂，进行加压柱硅胶色谱层析，经过薄层色谱分析后合并得到五个亚组分E1-E5。组分E2 (0.3g) 以三氯甲烷：甲醇=1:2为洗脱剂，进行凝胶柱层析（Sephadex LH-20），经过薄层色谱分析后合并得到四个亚组分E2-1~E2-4。E2的亚组分E2-2 (93 mg) 通过半制备液相色谱(1010型ODS-A，10×250mm，5 μm)：分离流速为5 mL/min，流动相为75%乙腈含0.1% TFA，得到所示化合物 (3.4 mg，tR 9.1 min)。
化合物 常温下为黄色粉末，高分辨电喷雾质谱HRESI-MS在m/z: 383.1161 [M-H]ˉ, calcd for C21H19O7, 383.1131，提示分子量为384，结合波谱信息推测分子式为C21H20O7。1H和13C-NMR数据见表1，主要的COSY，HMBC和NOE信号见图1。
表1 化合物的1H和13C-NMR数据(500 MHz 1H and 126 MHz 13C, in DMSO-d 6)
实施例2 体外抗肿瘤活性的测试
1 实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制 测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物纯品。精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。
细胞系及细胞的继代培养采用肿瘤细胞系，肿瘤细胞用含10% FBS的DMEM 培养基，在37℃于通入5% CO2的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法
四氮唑盐（MTT）法 取对数生长期的肿瘤细胞，将细胞密度调至每毫升1×105个细胞，按每孔200μL接种于96孔细胞培养板中，于37℃通入5% CO2的培养箱中培养4h。每孔加入2μL的样品液或空白溶液，培养24h之后，每孔加入MTT液（MTT的每mL5mg生理盐水溶液）10μL，继续培养4h，37℃、2000转/min离心8min，吸取上清。每孔加入DMSO各100μL，在微量振荡器上振荡15min，至结晶完全溶解之后，利用MD公司生产的SPECTRAMAX Plus型酶标仪测定每孔在570 nm处的吸光（OD）值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设置三孔的空白对照和无细胞凋零孔（如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞凋零）。各孔OD值先做相应无细胞凋零，再取三孔平均OD值按IR (%) = (OD空白对照-OD样品)/OD空白对照×100% 计算每个浓度下细胞的增殖抑制率（IR%）。
2. 实验结果
细胞增殖抑制活性测试结果
在MTT法测试中，根据不同浓度的该化合物的肿瘤细胞增殖抑制率，应用SPSS16.0软件进行数据处理并计算半数抑制浓度IC50值。结果见表2。
表2 化合物对人食管癌细胞增殖的抑制活性
3. 结论
该化合物对人食管癌细胞具有较好的抗肿瘤活性。可作为制备人食管癌细胞增殖抑制药物或抗肿瘤药物用于人食管癌的研究。

Claims (3)

1.化合物。
2.权利要求1所述化合物在制备抑制人食管癌细胞增殖药物中的应用。
3.权利要求1所述的化合物在制备抗人食管癌药物中的应用。
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