CN101613264B - 环烯酮类化合物及其在制备抗肿瘤药中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类具有抗肿瘤活性的环烯酮类化合物及其制备方法与应用。该化合物(GIBH022)的化学名称为：3-Ethyl-4R，5S-dihydroxy-cyclopent-2-enone(3-乙基-4R，5S-二羟基-2-环烯戊酮)，其结构式如(I)：
Description
技术领域
本发明涉及环烯酮类化合物领域，具体涉及一类具有抗肿瘤活性的环烯酮类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人类生命的疾病，其死亡率仅次于心脑血管疾病，且发生率有逐年上升的趋势。其中，肺癌是发病率和死亡率最高的肿瘤(Miller 2005)。在女性肿瘤中，乳腺癌发病率和死亡率均居第一位。研究开发具有抗肿瘤活性的药物具有重要的意义。
海洋是一个高盐、寡营养，甚至低温、高压的环境，为了适应特殊的环境，海洋微生物以其独特的代谢途径，能够产生结构新颖的活性代谢产物(Zhang，An et al.2005；Saleem，Aliet al.2007)。海洋微生物种类繁多，为寻找新的抗癌物质提供了更多的可能。海洋真菌作为海洋微生物的重要组成部分，其天然产物的研究始于20世纪90年代，1998年进入鼎盛时期，至2002年从海洋真菌中分离出来的新化合物有272个(Bugni and Ireland 2004)，其中不乏具有抗肿瘤活性的物质。
聚酮类化合物中有许多是重要的药用天然产物，例如红霉素、制霉菌素、阿维菌素、雷帕霉素、柔毛霉素等(Saleem，Ali et al.2007)。但是，关于环烯戊酮类活性物质的报道并不多。土曲霉酮(二羟基丙烯基环烯戊酮)发现于1935年，近年来的研究表明，它具有抑制细菌、抑制黑色素的生物合成、抑制表皮增殖等活性(Malmstrom，Christophersen et al.2002；Park，Kim et al.2004；Kim，Cho et al.2007)。另外，美国国家癌症研究所(NCI)的数据表明，土曲霉酮具有中等抑癌活性，GI50为10-4M。2002年，土曲霉酮及其衍生物也在海洋真菌Emericella variecolor中被发现。从海洋真菌Halichondria okadai和Trichoderma harzianum中发现的环烯戊酮类物质trichodenones具有抑制淋巴癌细胞P388的活性，ED50为0.21～1.45ug/ml(Bugni and Ireland 2004)。本发明中所涉及的环烯戊酮类化合物为新结构化合物，并对肿瘤细胞的杀伤具有较好的选择性，其在抗肿瘤方面的应用为首次报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于海洋真菌的具有抗肿瘤活性的环烯酮类化合物。
本发明的另一个目的是提供上述环烯酮类化合物的制备方法。
本发明的进一步目的是提供上述环烯酮类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明从海洋真菌Trichoderma sp.GIBH-Mf082(以下简称真菌GIBH-Mf082)的发酵培养物中提取分离得到一种浅黄色的环烯酮类化合物(GIBH022)，其化学名称为：
3-Ethyl-4R，5S-dihydroxy-cyclopent-2-enone(3-乙基-4R，5S-二羟基-2-环烯戊酮)，其结构式如(I)：
本发明所用的真菌GIBH-Mf082已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NO：CCTCC M208080，保藏日期为2008年5月29日。
本发明的环烯酮类化合物GIBH022可从真菌GIBH-Mf082的发酵培养液中提取分离得到，制备方法具体如下：
(1)真菌Trichoderma sp.GIBH-Mf082CCTCC NO：CCTCC M 208080的种子培养：配制种子培养基100毫升。种子培养基：MHB液体培养基，购于广东省环凯生物科技公司，按说明书进行配制，121℃高压灭菌20分钟。取-80℃保藏菌种，于37℃水浴锅迅速溶解后，吸取0.1毫升菌液于种子培养基，置于摇床上，转速为100rpm，27℃培养3天。
(2)真菌Trichoderma sp.GIBH-Mf082的CCTCC NO：CCTCC M 208080的发酵培养：发酵培养基成分：取大米20克、酵母浸膏0.1克、葡萄糖0.1克、水30毫升于250毫升三角瓶，121℃高压灭菌20分钟。取种子培养液1毫升于发酵培养基，27℃静置培养10天。共发酵10升，即333瓶。
(3)将固体发酵物用10升95％乙醇萃取3次，浓缩此乙醇萃取液至胶状，加入2升蒸馏水，用1/3体积的石油醚分别萃取3次后，再用1/3体积的三氯甲烷萃取3次，浓缩三氯甲烷萃取液，浓缩物(3.4g)在硅胶柱中进行色谱分离，以三氯甲烷-甲醇为洗脱剂，按100∶0-0∶100的比例进行梯度洗脱。
(4)分别收集比例为100∶0，98∶2，95∶5，90∶10，80∶20，0∶100的三氯甲烷-甲醇洗脱液，共6个部位，其中95∶5部位再以反相硅胶柱进行分离，以60％的甲醇水溶液为洗脱剂，得到黄色油状物GIBH022。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明经实验证明，环烯酮类化合物GIBH022能抑制肿瘤细胞株的生长，能用于开发抗肿瘤药物，应用前景广阔。
具体实施方式
实施例1化合物GIBH022的制备
(1)真菌Trichoderma sp.GIBH-Mf082CCTCC NO：CCTCC M 208080的种子培养：配制种子培养基100毫升。种子培养基：MHB液体培养基，购于广东省环凯生物科技公司，按说明书进行配制，121℃高压灭菌20分钟。取-80℃保藏菌种，于37℃水浴锅迅速溶解后，吸取0.1毫升菌液于种子培养基，置于摇床上，转速为100rpm，27℃培养3天。
(2)真菌Trichoderma sp.GIBH-Mf082CCTCC NO：CCTCC M 208080的发酵培养：发酵培养基成分：取大米20克、酵母浸膏0.1克、葡萄糖0.1克、水30毫升于250毫升三角瓶，121℃高压灭菌20分钟。取种子培养液1毫升于发酵培养基，27℃静置培养10天。共发酵10升，即333瓶。
(3)将固体发酵物用10升95％乙醇萃取3次，浓缩此乙醇萃取液至胶状，加入2升蒸馏水，用1/3体积的石油醚分别萃取3次后，再用1/3体积的三氯甲烷萃取3次，浓缩三氯甲烷萃取液，浓缩物在硅胶柱中进行色谱分离，以三氯甲烷-甲醇为洗脱剂，按100∶0-0∶100的比例进行梯度洗脱。
(4)分别收集比例为100∶0，98∶2，95∶5，90∶10，80∶20，0∶100的三氯甲烷-甲醇洗脱液，共6个部位，其中95∶5部位再以反相硅胶柱进行分离，以60％的甲醇水溶液为洗脱剂，得到黄色油状物GIBH022。
GIBH022的试验数据：
ES-MS：143(M+1).[a]20D＝-4.838°(CH3Cl).1HNMR(400Mz，CDCl3，TMS)：5.99(brs，H-2)，4.66(brs，H-4)，4.23(brs，H-5)，2.42(m，H-6a)，2.63(m，H-6b)，1.2(t，7.2Hz，CH3-7).13CNMR(CDCl3，TMS)：202.8(C-1)，125.6(C-2)，180.1(C-3)，77.7(C-4)，81.8(C-5)，23.0(C-6)，10.9(C-7).
实施例2MTT还原法检测化合物GIBH022的抗肿瘤活性实验
1、材料：
(1)细胞培养基(1640完全培养基)：RPMI 1640培养基(HyClone)、10％小牛血清(HyClone)、100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素。(2)细胞株：人肺癌细胞系A549、NCI-H460，人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-435s，人宫颈癌细胞系Hela，人前列腺癌细胞系DU-145，正常的人胚肺细胞系HLF，上述细胞均购自美国典型培养物中心ATCC。
(3)其他：0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索莱宝科技有限公司)；MTT(四脞盐)溶液：用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-diphenytetrazoliumromide)，浓度2.5mg/ml，过滤除菌，分装后4℃避光保存。
2、方法：
(1)细胞贴壁：取对数生长期的HLF、A549、NCI-H460、MCF-7、MDA-MB-435s、Hela、DU-145细胞，胰蛋白酶消化后，用1640完全培养基稀释至2×105cell/ml；以100ul/well接种至96孔细胞培养板，至于细胞培养箱，37℃(5％CO2)培养24小时。
(2)待测化合物的配制：用DMSO(二甲基亚砜)溶解化合物GIBH022，浓度为10ug/ul；用1640培养基完全培养基稀释至0.1ug/ul；用1640完全培养基以1∶3进行梯度稀释。
(3)去除培养液，以100ul/well加入配好的待测化合物，每个浓度设三个复孔；对照组，以100ul/well加入1640完全培养基；至于细胞培养箱，37℃(5％CO2)培养48小时。
(4)MTT检测：以10ul/well将MTT溶液加至上述细胞，37℃(5％CO2)培养4小时，去除培养液；每孔加入100ul DMSO，充分振荡3-5min，溶解；采用酶联免疫检测仪(Bio-Tek Synergy HT)检测每孔的吸光度(OD值)，设定波长570nm、参比波长630nm。
(5)计算抑制率：肿瘤细胞抑制率％＝[(对照组OD570值-加药组OD570值)/对照组OD570值]×100％
(6)计算IC50：以抑制率对药物浓度的对数作图(Sigmaplot)，求得IC50值。
3、结果：
试验结果显示化合物GIBH022对人肺癌细胞系A549和NCI-H460、人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-435s、人宫颈癌细胞系Hela、人前列腺癌细胞系DU-145均有抑制，但是在浓度为7.02mM时对正常的人胚肺细胞HLF仍无抑制，化合物GIBH022对肿瘤细胞的细胞毒有较好的选择性(选择指数＞100)。
| 细胞系 | IC50uM |
| 人肺癌细胞系A549 | 50.2 |
| 人肺癌细胞系NCI-H460 | 164 |
| 人乳腺癌细胞系MCF-7 | 63.5 |
| 人乳腺癌细胞系MDA-MB-435s | 617 |
| 人宫颈癌细胞系Hela | 85.6 |
| 人前列腺癌细胞系DU-145 | 43.2 |
| 正常的人胚肺细胞HLF | ＞7020 |
Claims (3)
1.环烯酮类化合物GIBH022，其化学名称为：3—乙基—4R，5S—二羟基—2-环烯戊酮(3-Ethyl-4R，5S-dihydroxy-cyclopent-2-enone)，其结构式如（I）：
2.权利要求1所述化合物的制备方法：
a.海洋真菌Trichoderma sp.GIBH-Mf082,其保藏号为CCTCC NO:CCTCC M208080的种子培养：配制种子培养基100毫升，所述种子培养基为MHB液体培养基，121℃高压灭菌20分钟；取-80℃保藏菌种，于37℃水浴锅迅速溶解后，吸取0.1毫升菌液于种子培养基，置于摇床上，转速为100rpm，27℃培养3天；
b．海洋真菌Trichoderma sp.GIBH-Mf082,其保藏号为CCTCC NO:CCTCC M208080的发酵培养：发酵培养基成分：取大米20克，酵母浸膏0.1克、葡萄糖0.1克、水30毫升于250毫升三角瓶，121℃高压灭菌20分钟；取种子培养液1毫升于发酵培养基，27℃静置培养10天；共发酵10升，即333瓶；
c．将固体发酵物用10升95%乙醇萃取3次，浓缩此乙醇萃取液至胶状，加入2升蒸馏水，用1/3体积的石油醚分别萃取3次后，再用1/3体积的三氯甲烷萃取3次，浓缩三氯甲烷萃取液，浓缩物在硅胶柱中进行色谱分离，以三氯甲烷-甲醇为洗脱剂，按100：0-0：100的比例进行梯度洗脱；
d．分别收集比例为100:0，98:2，95:5，90:10，80:20，0:100的三氯甲烷-甲醇洗脱液，共6个部位，其中95：5部位再以反相硅胶柱进行分离，以60%的甲醇水溶液为洗脱液，得到黄色油状物GIBH022。
3.权利要求1所述式（I）的环烯酮类化合物GIBH022在制备抗肿瘤药中的应用。
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