CN110699473A - 一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法 - Google Patents

一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于海水养殖病害防控技术领域，具体涉及一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法。通过设计的特异性引物进行荧光定量PCR反应，根据是否有荧光出现定性检测轮虫弧菌，根据荧光的激发强度定量计算被检测样品中轮虫弧菌的数量。本发明可以实现在海水养殖现场对轮虫弧菌精确、快速的检测，从而为养殖生产中有效防控轮虫弧菌的感染提供保障技术。

Description

一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法
技术领域
本发明属于海水养殖病害防控技术领域，具体涉及一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法。
背景技术
轮虫弧菌是一种被新兴的海水养殖病原，可感染鱼、虾等各类海水养殖生物而发病。最早有关轮虫弧菌的报道始是在2003年，由Gomez-Gil等(2003)在褶皱臂尾轮虫中分离得到，此后Chowdhury(2011)和Labbate(2011)等国外学者陆续开展了轮虫弧菌致病机理及生理生化特性等方面的研究。近几年来，国内学者分别在养殖半滑舌鳎(陈政强等,2012)、南美白对虾(金春英等,2013)、线纹海马(杨求华等,2017)和许氏平鲉(王凯等，2018)中分离出了轮虫弧菌。感染轮虫弧菌的半滑舌鳎主要症状为体表溃烂、尾部出血；南美白对虾主要症状为体表发红、肌肉白浊、鳃部变黄溃烂；而许氏平鲉的主要症状为体表出现创伤性溃疡、鳍条溃烂、眼球突出等。因其没有宿主特异性，轮虫弧菌已经成为危害海水养殖产业健康发展的新发病原之一。
值得一提的是，轮虫弧菌在TCBS培养基上生长的菌落为绿色，区别于绝大多数弧菌的黄色菌落，说明其不发酵蔗糖，无法采用TCBS培养基对其进行定性鉴定。因此，研究其特异性的检测方法就成为有效防控轮虫弧菌感染急需突破的关键技术之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是轮虫弧菌因为没有宿主特异性，已经成为危害海水养殖产业健康发展的新发病原之一。而且其不发酵蔗糖，无法采用TCBS培养基对其进行定性鉴定。所以，目前缺乏一种针对轮虫弧菌的特异性检测方法。
为解决上述问题，我们提供了一种准确鉴别轮虫弧菌的特异性引物及其应用方法，可以实现在海水养殖现场对轮虫弧菌精确、快速的检测，从而为养殖生产中有效防控轮虫弧菌的感染提供保障技术。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，通过设计的特异性引物进行荧光定量PCR反应，根据是否有荧光出现定性检测轮虫弧菌，根据荧光的激发强度定量计算被检测样品中轮虫弧菌的数量。
进一步的，所述特异性引物是基于轮虫弧菌toxR基因设计的，分别为DNA正向序列VRF:5'-TCGCAGCTTAGAACAACAAT-3'和反向序列VRR:5'-CTCAATAGCGGCATCAGAAA-3'；运用该特异引物扩增的toxR基因的目的片断长度为500bp。
这两个引物序列是我们测定轮虫弧菌的全基因组序列后，通过对基因组数据的分析，筛选toxR基因的部分序列作为目标片段，用生物学软件设计不同的特异引物，通过PCR反复验证后获得的两对特异性最好的引物。toxR是弧菌科的祖先基因，广泛分布在弧菌科细菌，主要起毒力基因表达调控的作用。很多文献表明，在副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、拟态弧菌(Vibrio.mimicus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)等很多弧菌中发现toxR基因的存在，是一种非常有效的弧菌属鉴定标记。
进一步的，用于检测的PCR反应体系为通过冷冻真空干燥法提前冻干封装的8μL微量预混PCR反应体系，包含5μL的2×Buffer缓冲液，0.5μL的5μM DNA正向序列引物，0.5μL的5μM DNA反向序列引物，0.5μL的5μL SYBR GREEN荧光染料，0.5μL的5U DNA聚合酶，1μL的去离子H2O。
上述各个成分混合后即成为一个PCR的反应体系，2×ChamQ Universal SYBRqPCR Master Mix包括了快速反应酶、dNTP、荧光染料等，引物用于扩增用。相当于提前将PCR反应体系配好，冻干后可以长期保存，进行检测时携带到现场加入无菌水和DNA模板后就可以直接进行PCR反应，简化了程序，更方便操作。
进一步的，上述预混PCR反应体系的制备方法包括以下步骤：
(1-1)首先在200μL的PCR反应管中制作8μL的PCR微量反应体系，包含5μL的2×Buffer缓冲液，0.5μL的5μM DNA正向序列引物，0.5μL的5μM DNA反向序列引物，0.5μL的5μLSYBR GREEN荧光染料，0.5μL的5U DNA聚合酶，1μL的去离子H2O，共计8μL；依次添加到反应管中混合即可；
(1-2)将装有上述8μL微量反应体系的PCR管在-80℃的超低温冰箱预冻1小时候后，再用冷冻真空干燥法冻干，形成预混反应体系，将PCR管盖好后用封口膜封装备用。冻干的目的是将预先配置好的PCR反应体系进行长期保存，方便储存和携带，简化使用时的操作程序，方便在现场进行PCR操作。-80℃超低温预冻，可以使配置好的反应体系迅速降温至共晶点一下，有效保护体系内的活性成分。
进一步的，在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法包括以下步骤：
(2-1)剪取养殖动物0.2-0.3g待检测部位组织置于1.5mL离心管中，用研磨棒研磨碎后，加入200μL上海创坤生物科技有限公司的2×Lysis Buffer组织裂解液和300μL无RNAse H2O。
(2-2)将上述装有样品的离心管置于掌心中并握拳5～10min，在人体体温(约37℃)条件下使组织充分裂解，然后用掌式离心机8000rpm离心2min，获取上清液。
(2-3)吸取10μL上清液至一个新的无菌离心管中，并加入90μL无RNAse H2O对上清进行稀释，震荡混匀后即作为待检测的核酸模板。
(2-4)在提前冻干封装的预混反应体系中加入2μL(2-3)中制备好的核酸模板，和8μL的无RNAse H2O，充分震荡均匀，形成PCR反应体系。
(2-5)将(2-4)得到的PCR反应体系进行荧光定量PCR反应；PCR程序结束后进行产物荧光检测，目的片段长度约为500bp。
(2-6)反应芯片中的产物有荧光出现，证明被检测样品中含有轮虫弧菌，根据荧光的激发强度可以定量计算被检测样品中轮虫弧菌的数量。
进一步的，步骤(2-5)为将(2-4)得到的PCR反应体系用移液枪转移至PCR:Chipfor GeneChecker反应芯片中，置于GeneChecker UF-150便携式超快速PCR仪中进行荧光定量PCR反应。
进一步的，步骤(2-5)的反应程序为：①95℃预变性30s；②2○95℃变性10s+60℃退火40s+72℃延伸10s，重复②共30个循环。
本发明的有益效果在于：
1.本发明采用了轮虫弧菌toxR基因的一对特异性引物，相比16s rDNA基因和gyrB基因等序列，其保守性更高，具有更好的种间识别性，可以准确鉴定轮虫弧菌。
2.本发明采用预混荧光定量PCR反应体系并冻干封装备用的方式，配合GeneChecker UF-150便携式超快速PCR仪，降低了荧光定量PCR反应的实验场地要求，具备了在养殖现场进行轮虫弧菌检测的条件。同时，该方法还可以进行轮虫弧菌的定量检测，有助于进行海水养殖疾病的精准防控。
3.本发明PCR反应体系体积小、程序简洁，全程检测时间缩短至40min左右，大大提高了检测的效率，适于进行快速检测技术的研发。
附图说明
图1GeneChecker UF-150便携式超快速PCR仪对不同实验组的检测结果；
注：GeneChecker UF-150反应芯片的检测结果。芯片共10个反应通道，其中通道1和通道2是注射了轮虫弧菌的许氏平鲉肌肉组织样品；通道3和通道4是注射了鳗弧菌的许氏平鲉肌肉组织样品；通道5和通道6是注射了迟钝爱德华氏菌的肌肉组织样品；通道7和通道8是注射了1.5％无菌NaCl溶液的许氏平鲉肌肉组织样品；通道9和通道10是无RNAseH2O。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
(1)首先在200μL的PCR反应管中制作8μL的PCR微量反应体系，包含5μL的2×Buffer缓冲液，0.5μL的5μM DNA正向序列引物，0.5μL的5μM DNA反向序列引物，0.5μL的5μLSYBR GREEN荧光染料，0.5μL的5U DNA聚合酶，1μL的去离子H2O，共计8μL；
(2)将装有上述8μL微量反应体系的PCR管在-80℃的超低温冰箱预冻1小时候后，再用冷冻真空干燥法冻干，形成预混反应体系，将PCR管盖好后用封口膜封装备用。
(3)本实施例选取了23株细菌应用本发明所述的特异引物和方法进行了轮虫弧菌的特异性检测，所选用的菌株及其来源如表1所示。
表1用于轮虫弧菌特异性检测的参考菌株
Figure BDA0002290530450000041
Figure BDA0002290530450000051
将上表中所列各个菌株的冻存菌液从实验室-80℃超低温冰箱取出，放于4℃，使菌液缓慢融化后，吸取30μL划线于TSB固体培养基上，倒置于28℃培养24～36小时。待菌落形成后，挑取单菌落再次划线于一个新的TSB固体培养基上于28℃进行纯化培养。纯化培养3次后，刮取单菌落悬浮于0.5mL的无菌1.5％NaCl溶液中，制备细菌菌悬液。
(4)在上述菌悬液中加入100μL上海创坤生物科技有限公司的2×Lysis Buffer组织裂解液，封口并握于掌心10min后，用掌式离心机8000rpm离心2min，吸取上清液转移至一个无菌的离心管中，作为待检测细菌的核酸模板。
(5)在一个预冻封装的PCR反应管中，分别加入上述2μL细菌悬液和8μL的无RNAseH2O，充分震荡均匀。然后用移液枪将10μL的PCR反应体系转移至PCR:Chip forGeneChecker反应芯片中，置于GeneChecker UF-150便携式超快速PCR仪中进行荧光定量PCR反应。反应程序设定为：95℃预变性30s；(95℃变性10s+60℃退火40s+72℃延伸10s)共30个循环。
(6)PCR反应持续了30min。反应结束后，对实验的23株细菌的反应芯片进行荧光检测，结果只有3株轮虫弧菌的反应芯片出现了绿色荧光，证明本发明所述的检测方法对轮虫弧菌具备较好的特异性，同时也具有较短的检测时间，适合进行轮虫弧菌的快速检测。
实施例2：
在本实验室的水族系统内，分别设置4个实验组，每个实验组养殖体重40±5g/尾的许氏平鲉30尾。暂养5天后，分别标记为实验组1、2、3和对照组，其中实验组1的每尾鱼注射0.05mL浓度为1.0×104cfu/mL的轮虫弧菌活菌液，实验组2的每尾鱼注射0.05mL浓度为1.0×104cfu/mL的鳗弧菌活菌液，实验组3的每尾鱼注射0.05mL浓度为1.0×104cfu/mL的迟钝爱德华氏菌活菌液，对照组每尾鱼注射0.05mL的1.5％无菌NaCl溶液。注射部位均为鱼的背部肌肉处。
在注射后的第3天，随机从每组挑选五尾鱼，剪取0.2g注射部位的肌肉组织分别置于5个灭菌的1.5mL离心管中，分别用不同的无菌研磨棒将组织研磨碎后，加入200μL上海创坤生物科技有限公司的2×Lysis Buffe组织裂解液和300μL无RNAse H2O。盖上离心管盖，用封口膜密封，将多个离心管一起放于37℃水温中(模拟掌心温度)保持10min，保证组织充分裂解。
将上述裂解后的组织液用掌式离心机8000rpm离心2min，从每个离心管中吸取10μL上清液至一个新的无菌离心管中，并加入90μL无RNAse H2O对上清进行稀释，震荡混匀后作为待用的核酸模板。
取制备好的冻干封装的预混反应体系，加入2μL上述核酸模板和8μL的无RNAseH2O，充分震荡均匀，形成PCR反应体系。用移液枪转移至PCR:Chip for GeneChecker反应芯片中，置于GeneChecker UF-150便携式超快速PCR仪中进行荧光定量PCR反应。反应程序设定为：95℃预变性30s；(95℃变性10s+60℃退火40s+72℃延伸10s)共30个循环。
30min后，PCR反应程序结束，进行产物荧光检测。结果如图1所示，实验组1的5个反应体系均出现了绿色荧光，而实验组2、3和对照组的5个反应体系均无荧光信号，证明本发明方法对许氏平鲉体内感染的轮虫弧菌检出具有极好的特异性。
其中PCR反应体系的制备与实施例1相同。
最后需要说明，以上实施例虽然描述了本发明的具体实施方式，但是并非限制本发明；本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书所限定的。而一切进行修改或等同替换，其均应包含在本发明的保护范围中。
Figure BDA0002290530450000081
序列表
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法
<130> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<140> 1
<141> 2019-11-21
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgcagctta gaacaacaat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcaatagcg gcatcagaaa 20

Claims (7)

1.一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：通过设计的特异性引物进行荧光定量PCR反应，根据是否有荧光出现定性检测轮虫弧菌，根据荧光的激发强度定量计算被检测样品中轮虫弧菌的数量。
2.如权利要求1所述的在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：所述特异性引物是基于轮虫弧菌toxR基因设计的，分别为DNA正向序列VRF:5'-TCGCAGCTTAGAACAACAAT-3'和反向序列VRR:5'-CTCAATAGCGGCATCAGAAA-3'；运用该特异引物扩增的toxR基因的目的片断长度为500bp。
3.如权利要求1或2所述的在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：用于检测的PCR反应体系为通过冷冻真空干燥法提前冻干封装的8μL微量预混PCR反应体系，含5μL的2×Buffer缓冲液，0.5μL的5μM DNA正向序列引物，0.5μL的5μM DNA反向序列引物，0.5μL的5μL SYBR GREEN荧光染料，0.5μL的5U DNA聚合酶，1μL的去离子H2O。
4.如权利要求3所述的在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：所述预混PCR反应体系的制备方法包括以下步骤：
(1-1)首先在200μL的PCR反应管中制作8μL的PCR微量反应体系，包含5μL的2×Buffer缓冲液，0.5μL的5μM DNA正向序列引物，0.5μL的5μM DNA反向序列引物，0.5μL的5μL SYBRGREEN荧光染料，0.5μL的5U DNA聚合酶，1μL的去离子H2O，共计8μL；
(1-2)将装有上述8μL微量反应体系的PCR管在-80℃的超低温冰箱预冻1小时候后，再用冷冻真空干燥法冻干，形成预混反应体系，将PCR管盖好后用封口膜封装备用。
5.如权利要求1或2所述的在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法包括以下步骤：
(2-1)剪取养殖动物0.2-0.3g待检测部位组织置于1.5mL离心管中，用研磨棒研磨碎后，加入200μL组织裂解液和300μL无RNAse H2O；
(2-2)将上述装有样品的离心管置于掌心中并握拳，在人体温条件下使组织充分裂解，然后用掌式离心机离心，获取上清液；
(2-3)吸取10μL上清液至一个新的无菌离心管中，并加入90μL无RNAse H2O对上清进行稀释，震荡混匀后即作为待检测的核酸模板；
(2-4)在提前冻干封装的预混反应体系中加入2μL(2-3)中制备好的核酸模板，和8μL的无RNAse H2O，充分震荡均匀，形成PCR反应体系；
(2-5)将(2-4)得到的PCR反应体系进行荧光定量PCR反应；PCR程序结束后进行产物荧光检测；
(2-6)反应芯片中的产物有荧光出现，证明被检测样品中含有轮虫弧菌，根据荧光的激发强度可以定量计算被检测样品中轮虫弧菌的数量。
6.如权利要求5所述的在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：步骤(2-5)为将(2-4)得到的PCR反应体系用移液枪转移至PCR:Chip for GeneChecker反应芯片中，置于GeneChecker UF-150便携式超快速PCR仪中进行荧光定量PCR反应。
7.如权利要求5所述的在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法，其特征在于：步骤(2-5)的反应程序为：①95℃预变性30s；②95℃变性10s+60℃退火40s+72℃延伸10s，重复②共30个循环。
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