CN109055581A - 食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的检测方法 - Google Patents
食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109055581A CN109055581A CN201810656021.7A CN201810656021A CN109055581A CN 109055581 A CN109055581 A CN 109055581A CN 201810656021 A CN201810656021 A CN 201810656021A CN 109055581 A CN109055581 A CN 109055581A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- follows
- vibrio
- bacterium
- pcr
- comma bacillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法，其特征在于：其检测步骤为：待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，最后用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。本发明的优点在于：可同时检测食品中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的检测方法。
背景技术
目前，国内关于致病性弧菌的检测方法还是传统的微生物学检测方法，尚不够完善，每种检测方法仅能检测一种致病性弧菌，而国外的传统微生物学检测方法(如FDA、AOAO、ISO等)也是以单一或少数目标菌为目的设计的程序。因此，几乎每检测一种致病性弧菌都需配制不同的培养基和试剂，耗时又耗力。在分子生物学检测方法方面，FDA2004标准仍是以检测一种致病性弧菌为目的设计PCR程序，检测不同的弧菌需要不同的反应条件。国内的检测人员设计PCR检测方法时也是以毒力基因为待扩增序列，而且关注的大都是O1型和O139型霍乱弧菌与副溶血弧菌，PCR方法检测创伤弧菌的报道只有2000年有过1例，拟态弧菌、至今仍未见到过。
除了常见的霍乱弧菌和副溶血弧菌外，许多国家已开始关注其它致病性弧菌在食物中的存在。目前，由于在水产品检测中经常是一份样品同时检测几种致病性弧菌，因此，有必要研究一种方法，可同时检测多个致病性弧菌。这样，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本，以适应加入WTO后的新的形势需求，与国际方法接轨。
发明内容
本发明提供了一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的检测方法，其优点在于：可同时检测以上三种致病性弧菌，在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本。
本发明所提供的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的检测方法，其特征在于：其检测步骤为：待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，最后用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。
本发明所提供的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的检测方法，采用霍乱弧菌的胶原酶基因(vcc，AE004243)、拟态弧菌的溶血素基因(vmh，VMU68271)和副溶血弧菌的不耐热溶血毒素基因(tlh)为一组检测霍乱弧菌、拟态弧菌和副溶血弧菌(三重PCR)，检测出霍乱弧菌后再以vcc、霍乱肠毒素基因(ctx，AF516349)为一组确定霍乱弧菌是否具有霍乱肠毒素基因(V.c二重PCR)。其优点在于：可同时检测以上三种致病性弧菌，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本。
具体实施方式
本发明所提供的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的检测方法，其特征在于：其检测步骤为：待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。
所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步骤为：在无菌条件下，取充分剪碎的样品，加入盛有9倍量的3％的NaCl碱性蛋白胨水的灭菌容器内，在37℃±3℃条件下培养4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步骤为：吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，在37℃±3℃条件下培养4h～15h。
所述的水煮法提取弧菌基因组DNA，其操作步骤为：取培养的菌液加入离心管中，以13000rpm离心1min，弃上清液，然后加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀后，96-100℃水浴10min，12000rpm离心5min，取上清液作为DNA模板，-20℃环境下储存备用。
所述的PCR反应为先做三重PCR反应，检出霍乱弧菌后再做V.c二重PCR反应。其中，三重PCR反应反应体系为：H2O：12.3μl，Buffer：2.6μl，dNTP：0.5μl，引物Pn：(0.4*6)μl，Taq酶：0.2μl，模板DNA：2.0μl，总体积为20μl，所述的V.c二重PCR反应，其反应体系为：H2O：12.5μl，Buffer：2.6μl，dNTP：0.5μl，Pvcc：(0.4*2)μl，Pctx：(0.7*2)μl，Taq酶：0.2μl，模板DNA：2.0μl，总体积为20μl。PCR反应循环参数为：94℃预变性3min；然后94℃变性1min，60℃退火1min，72℃复性1min循环35次，最后72℃延伸7min。
所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳，其操作步骤为：PCR反应结束后以98V电压2.5％凝胶电泳90min。
所述的染色为在溴化乙锭溶液中染色20min。
以下结合具体实施例子说明：
实施例一：墨鱼的检测
1.无菌操作，取25g面包虾样品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。
3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液，加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min，弃上清。
4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀，100℃水浴10min。
5.12000rpm离心5min，取上清作为DNA模板，-20℃备用。
6.加样，做PCR
7.取10μlPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
实施例二：甲鱼蛋的检测
1.无菌操作，取25g文蛤样品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。
3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液，加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min，弃上清。
4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀，100℃水浴10min。
5.12000rpm离心5min，取上清作为DNA模板，-20℃备用。
6.加样，做PCR
7.取10μlPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
Claims (1)
1.一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的检测方法，其特征在于：其检测步骤为：
(1)检测的样品经二次增菌：所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步骤为：在无菌条件下，取充分剪碎的样品，加入盛有3％的NaCl碱性蛋白胨水的灭菌容器内，所述样品与碱性蛋白胨水的用量为：每25克样品加入225ml的碱性蛋白胨水，在37℃±3℃条件下培养4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步骤为：吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，所述增菌液与碱性蛋白胨水的用量为：每1ml增菌液加入9ml的碱性蛋白胨水，在37℃±3℃条件下培养4h～15h；
(2)水煮法提取弧菌基因组DNA：吸取1.5ml培养的菌液，加入1.5ml离心管中，以13000rpm离心1min，弃上清液，然后加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀后，96-100℃水浴10min，12000rpm离心5min，取上清液作为DNA模板，-20℃环境下储存备用；
(3)PCR反应：所述的PCR反应为先做三重PCR反应，检出霍乱弧菌后再做V.c二重PCR反应：所述的三重PCR反应，其反应体系为：H2O：12.3μl，Buffer：2.6μl，dNTP：0.5μl，引物Pn：(0.4*6)μl，Taq酶：0.2μl，模板DNA：2.0μl，总体积为20μl，所述的V.c二重PCR反应，其反应体系为：H2O：12.5μl，Buffer：2.6μl，dNTP：0.5μl，Pvcc：(0.4*2)μl，Pctx：(0.7*2)μl，Taq酶：0.2μl，模板DNA：2.0μl，总体积为20μl；所述的PCR反应循环参数为：94℃预变性3min；然后94℃变性1min，60℃退火1min，72℃复性1min循环35次，最后72℃延伸7min；
(4)电泳：所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳，其操作步骤为：PCR反应结束后以98V电压2.5％凝胶电泳90min；
(5)染色：所述的染色为在溴化乙锭溶液中染色20min；
(6)漂洗；
(7)用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果，所述的谱图分析包括阳性对照和阴性对照，对于谱图中是否有相应特征位置条带的出现，即可判别被检测对象中是否有霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的存在。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810656021.7A CN109055581A (zh) | 2018-06-23 | 2018-06-23 | 食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810656021.7A CN109055581A (zh) | 2018-06-23 | 2018-06-23 | 食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109055581A true CN109055581A (zh) | 2018-12-21 |
Family
ID=64820978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810656021.7A Pending CN109055581A (zh) | 2018-06-23 | 2018-06-23 | 食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109055581A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110669857A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-01-10 | 临沂大学 | 水产品中拟态弧菌的微滴式数字pcr快速检测方法 |
| CN110699473A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-01-17 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法 |
-
2018
- 2018-06-23 CN CN201810656021.7A patent/CN109055581A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110669857A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-01-10 | 临沂大学 | 水产品中拟态弧菌的微滴式数字pcr快速检测方法 |
| CN110699473A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-01-17 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种在养殖现场快速检测轮虫弧菌的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Takahashi et al. | Biofilm formation ability of Listeria monocytogenes isolates from raw ready-to-eat seafood | |
| CN100585394C (zh) | 食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的pcr检测方法 | |
| CN109055581A (zh) | 食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的检测方法 | |
| CN104263838B (zh) | 单增李斯特菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN104232784A (zh) | 一种牛肉中三种主要致病菌多重pcr检测方法 | |
| CN109266772A (zh) | 柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量pcr的检测方法 | |
| Le Dimna et al. | Validation of two commercial real-time RT-PCR kits for rapid and specific diagnosis of classical swine fever virus | |
| CN104328194B (zh) | 一种基于lamp技术的植物源性食品中动物源性成分检测方法 | |
| CN102816831A (zh) | 弯曲菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用 | |
| CN101363061A (zh) | 检测食品沙门氏菌的Taqman探针荧光定量PCR方法 | |
| CN107419034A (zh) | 五种猪腹泻病毒多重pcr快速诊断试剂盒及其应用 | |
| CN107629951A (zh) | 微流控基因检测芯片 | |
| CN107385077A (zh) | 用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用 | |
| CN103276104A (zh) | 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用 | |
| CN106086206A (zh) | 绿色魏斯氏菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法 | |
| CN105695384A (zh) | 表达红色荧光蛋白的重组沙门氏菌及其构建方法 | |
| CN100585396C (zh) | 食品中河弧菌的pcr检测方法 | |
| CN100585395C (zh) | 食品中创伤弧菌和溶藻弧菌的pcr检测方法 | |
| CN102816863A (zh) | 猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量定量检测试剂盒及检测方法 | |
| CN104328207A (zh) | 一种沙门氏菌的快速检测试剂盒及其应用 | |
| CN102041298B (zh) | 凝结芽孢杆菌的pcr快速检测方法 | |
| CN103981270A (zh) | 美人鱼发光杆菌快速检测引物、试剂盒及应用 | |
| CN107604098A (zh) | 用于检测鸽TTV的EvaGreen实时荧光定量PCR引物及试剂盒 | |
| CN106282392A (zh) | 一种肠炎沙门氏菌pcr检测引物、检测试剂盒及检测方法 | |
| CN106011314B (zh) | 一种用于检测猪细小病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20181221 |