CN104263838B - 单增李斯特菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种单增李斯特菌快速检测试剂盒及其检测方法。所述技术可用于单增李斯特菌型的检测。其特征是：试剂盒中含有LAMP特异性引物组SEQ ID NO：1‑4和1个特异性探针SEQ ID NO：5，该技术将环介导等温扩增技术与横向流胶体金试纸条检测技术相结合，能够肉眼直观的判定检测结果。该技术具有准确、快速、方便、高效、特异、灵敏的特点，适用于进出口检疫、食品卫生检验等的现场检测，对于保障食品安全具有重要意义。

Description

单增李斯特菌LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于动物卫生和食品检验技术领域，涉及一种用于检测单增李斯特菌菌株的LAMP-LFD试剂盒及其检测方法。
背景技术
单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM），简称单增李斯特菌，是一种重要的人畜共患病的病原菌。该菌属兼性厌氧革兰氏阳性菌，其pH值生长范围为4.39～9.40，在4℃条件下可生长繁殖，因此对冷藏食品的危害性很大。单增李斯特菌广泛存在于各种环境中，极易污染各类食品，据统计，单增李斯特菌主要是通过污染乳制品生奶和软奶酪、畜禽产品、生熟肉制品、蔬菜等，引起食源性李斯特菌病，病死率高达30%。近几年来，因食品污染单增李斯特菌导致的食物中毒事件日渐增多，已引起不少国家的广泛关注。1986年WHO将其列为食品四大致病菌之一，并于2000年在WHO食品安全工作计划中，将该菌列为重点检测的食源性致病菌之一。及时有效地控制食品中单增李斯特菌的污染，是当今食品安全的重要课题之一。因此建立一种快速、准确而又适用于临床的检测方法对于有效诊断单增李斯特菌感染，监测食品污染具有重要的实际应用价值。
对于突发性传染病，快速检测和鉴定病原体是控制疫情的关键。传统的单增李斯特菌诊断主要通过病原分离与生化鉴定完成，但其存在细菌培养操作繁琐、耗时长，不易鉴别相近物种或亚型等缺点。随着分子生物学检测技术的发展，以hlyA基因、inl基因、iap基因等为靶标建立的PCR或实时定量荧光PCR技术已成功应用于单增李斯特菌的实验室诊断，具有特异性强、灵敏度高和速度快等优点，但该方法必须配备昂贵的仪器设备，需专门的操作人员，在适应性上有一定的缺陷。环介导等温扩增技术是Notomi等于2000年建立的，该技术通过针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNApolymerase）在等温65℃左右，几十分钟，即可实现核酸的高效扩增。该方法仅需要简单的水浴锅或加热器，操作简便、特异性强、灵敏度高、检测快速，适合于基层及现场使用。
2008年Kiatpathomchai首次将横向流动试纸条技术与环介导等温扩增技术相结合(LAMP-LFD)，用于LAMP扩增产物的检测(Kiatpathomchai et al., 2008)。目前，该方法已被成功用于嗜盐弧菌、人的非洲锥虫病、副溶血霍乱弧菌、桃拉病毒、传染性肌肉坏死病毒、对虾白斑症病毒等病原的检测。在横向流动试纸条技术检测反应中FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，并与胶体金标记的抗FITC的抗体结合形成三元复合物，并结合在横向流动试纸条具有生物素抗体的检测线上；未杂交的FITC标记探针与胶体金标记的抗FITC的抗体形成不含生物素的两元复合物，通过检测线，结合在控制线上。这样可以通过检测带是否显色判断扩增产物的有无。该检测方法依赖于序列之间的特异性扩增，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。并且不需要电泳装置和凝胶成像系统，无需EB等有毒试剂，检测时间短，结果可肉眼观察。因此，LAMP-LFD方法安全、快速、高效且无设备及技术限制，具有其他技术无法替代的优势。
本专利将环介导等温扩增技术（LAMP)）与横向流动试纸条技术（LFD）相结合，针对单增李斯特菌重要的毒力因子hlyA基因设计一套引物和探针，优化反应条件，建立单增李斯特菌LAMP-LFD检测技术。本试剂盒操作简便，作为单增李斯特菌的初筛工具,尤其适用于基层检验检疫机构,为单增李斯特菌的疫情监控和快速检测提供了新的发展方向。
发明内容
本发明的一个目的是提供了一种用于检测单增李斯特菌的LAMP特异性引物组和1个特异性探针，它包括：
LM-F3 GAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTA SEQ ID NO：1
LM-B3 GGTAAGTTCCGGTCATCAA SEQ ID NO：2
LM-FIP ATGTGAAATGAGCTAGCTTGCT-CGAAATTGTTCAACATAAAAACTGG SEQ ID NO：3
LM-BIP TTGCCTGGTAACGCGAGAAA-TACCGTTCTCCACCATTC SEQ ID NO：4
LM-HP GTTTACGCTAAAGAATGC SEQ ID NO：5
其中LM-F3 0.5μL；LM -B3 0.5μL；LM -FIP 0.5μL；LM -BIP 0.5μL；LM-HP 为20pmol；所述LM-FIP引物的5’端标记生物素， LM-HP探针的5’端标记有异硫氰酸荧光素。
本发明进一步公开了采用用于检测单增李斯特菌 LAMP-LFD特异性引物组和1个特异性探针制成的检测试剂盒，其特征在于它的组成如下：
（1）LAMP反应液：
LAMP反应液中含有：2×Buffer（含Mg2+） 2.5μL；LM-F3 0.5μL；LM -B3 0.5μL；LM -FIP 0.5μL；LM -BIP 0.5μL； dNTPs 3.5μL
（2）超纯水
（3）Bst酶（8U/μL）
（4）LM-HP探针 20pmol
（5）横向流动试纸条
（6）用于检测单增李斯特菌的LAMP特异性引物和1个特异性探针；其中的引物和探针指的是：
LM-F3 GAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTA SEQ ID NO：1
LM-B3 GGTAAGTTCCGGTCATCAA SEQ ID NO：2
LM-FIP ATGTGAAATGAGCTAGCTTGCT-CGAAATTGTTCAACATAAAAACTGG SEQ ID NO：3
LM-BIP TTGCCTGGTAACGCGAGAAA-TACCGTTCTCCACCATTC SEQ ID NO：4
LM-HP GTTTACGCTAAAGAATGC SEQ ID NO：5
其中LM-FIP和LM-HP分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素。
本发明更进一步公开了采用此试剂盒，用于检测食源性单增李斯特菌的LAMP-LFD方法，其特征在于，按如下的步骤进行：
（1）LAMP扩增反应体系为：2×Buffer（含Mg2+） 2.5μL；LM-F3 0.5μL；LM -B3 0.5μL；LM-FIP 0.5μL；LM-BIP 0.5μL； dNTPs 3.5μL；8U/μL Bst酶lμL；加入样品DNA模板1至5μL；用超纯水补充至终体积25μL
（2） 扩增反应过程： 63 ℃进行60min。
（3）扩增反应结束后不经过终止反应，而在反应体系中加入20pmol的探针LM-HP，63℃杂交5min。杂交结束后，从反应液中取8µL杂交液加入到100µL Buffer 中混匀，将LFD试纸条浸入其中，反应约5分钟读取检测结果。
（4）结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现紫红色条带，检测结果为阳性，则说明样品中含有单增李斯特菌；试纸条只有质控线出现紫红色条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。
本发明同时也公开了用于检测单增李斯特菌的LAMP特异性引物组在制备用于检测单增李斯特菌 LAMP-LFD试剂盒中的应用。实验结果表明：采用本发明所公开的单增李斯特菌的LAMP特异性引物组制备的试剂盒在检测单增李斯特菌 LAMP-LFD方面具有良好的积极效果。
本发明公开的用于检测单增李斯特菌的试剂盒与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）本发明采用的LAMP技术具有操作简便、快速、敏感等特点，其敏感性可达到1至10pg，比常规PCR高10倍以上；而且检测过程只需恒温水浴锅即可完成，不需要PCR仪等昂贵的设备，更适合于基层推广应用。此外，本发明将LAMP技术与横向流动试纸条技术相结合，可以通过肉眼直接观察和判定结果，仅需5-10min，比PCR方法（琼脂糖凝胶电泳）缩短15-20min，且避免了电泳染料对环境的污染，使检测更为便捷、环保。
（2）基于LAMP-LFD方法的敏感、特异，成本低廉，便于操作等诸多优势，本发明在一定程度上提高了我国单增李斯特菌菌株的检测能力，为单增李斯特菌疾病的临床实时快速诊断、动物和食品的出入境检验检疫中该菌的快速准确检测提供了新技术来源，对提高我国检验检疫机构单增李斯特菌的疫情监控和快速检测水平，以及普及先进技术在基层检验检疫机构的推广应用均具有重要意义。
附图说明
图1 为LAMP-LFD试验图；自左向右，依次为1：单增李斯特菌；2：空白对照；
图2为食品样品的单增李斯特菌 LAMP-LFD试验图；自左向右，依次为1-9：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释；10：阴性对照；
图3为LAMP-LFD特异性试验图；自左向右，依次为1：空白；2：单增李斯特菌；3：金黄色葡萄球菌；4：沙门氏菌；5：志贺氏菌；6：副溶血性弧菌；7：大肠埃希氏菌O157；8：空肠弯曲杆菌； 9：布鲁氏杆菌。
具体实施方式
为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测单增李斯特菌的LAMP-LFD引物组和1个特异性探针的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中所用的试剂原料均有市售。本发明所述的单增李斯特菌引物组和探针序列见表1。
表1
注：其中LM-FIP引物和LM-HP探针分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素。
实施例1
1、单增李斯特菌 DNA的提取：采用天根生物公司的细胞/组织DNA提取试剂盒，方法参考说明书。
（1）取菌液1ml 12,000rpm离心5分钟，去上清，沉淀中加入200μLGA，重悬混匀。
（2）加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。在65℃水浴1小时，期间颠倒混合样品2-3次。从水浴锅中取出，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
（3 ）加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
（4）加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
（5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
（6）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
（7）向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
（8）向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液。
（9）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置3分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
（10）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE（80℃水浴已预热），室温放置3分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
（11）将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
2、扩增反应
（1）试剂：BioLabs（NEW ENGLAND）生产的Bst DNA聚合酶大片段；LAMP反应液；单增李斯特菌 LAMP引物；Milenia Biotec GmbH公司生产的横向流动试纸条
（2）扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer（含Mg2+） 2.5μL；LM-F3 0.5μL； LM-B3 0.5μL；LM-FIP 0.5μL；LM-BIP 0.5μL； dNTPs3.5μL；8U/μL Bst酶lμL；水 7μL；DNA 样品2μL。
（3） 扩增反应过程： 63 ℃进行60min。
（4）扩增反应结束后不经过终止反应，而在反应体系中加入20pmol的探针LM-HP，63℃杂交5min。杂交结束后，从反应液中取8µL杂交液加入到100µL Buffer 中混匀，将LFD试纸条浸入其中，反应约5分钟读取检测结果。
（5）结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现紫红色条带，检测结果为阳性，则说明样品中含有单增李斯特菌；试纸条只有质控线出现紫红色条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。结果见图1。
3、结果说明：从图可知，使用本专利的引物和试剂盒可以扩增出单增李斯特菌。
实施例2
1、食品中单增李斯特菌 DNA提取：
将过夜培养的单增李斯特菌菌液（原始菌浓度为3.6×106cfu/ml）稀释至10-1～10-8，取各稀释度菌液1ml，加入到市售的猪肉中，制成模拟检测样本。按实例1的方法提取组织中的DNA。取3μLDNA模板分别进行LAMP-LFD检测。
2、扩增：
（1）试剂：BioLabs（NEW ENGLAND）生产的Bst DNA聚合酶大片段；LAMP反应液；单增李斯特菌 LAMP引物；Milenia Biotec GmbH公司生产的横向流动试纸条
（2）扩增反应体系 扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer（含Mg2+） 2.5μL；LM-F3 0.5μL； LM -B3 0.5μL；LM -FIP 0.5μL；LM -BIP 0.5μL；；dNTPs 3.5μL；8U/μL Bst酶lμL；水 6μL；DNA 样品 3μL。
（3） 扩增反应过程： 63 ℃进行60min。
（4）扩增反应结束后不经过终止反应，而在反应体系中加入20pmol的探针LM-HP，63℃杂交5min。杂交结束后，从反应液中取8µL杂交液加入到100µL Buffer 中混匀，将LFD试纸条浸入其中，反应约5分钟读取检测结果。
（5）结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现紫红色条带，检测结果为阳性，则说明样品中含有单增李斯特菌；试纸条只有质控线出现紫红色条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。结果见图2。
3、结果说明：从图可知，本专利的试剂盒可以用于临床样品的检测。
实施例3
1、单增李斯特菌LAMP-LFD试剂盒的特异性试验：
（1）对照菌株包括：
（2）病毒DNA提取：采用天根生物公司的细胞/组织DNA提取试剂盒，方法参考说明书。
2、扩增反应：
（1）试剂：BioLabs（NEW ENGLAND）生产的Bst DNA聚合酶大片段；LAMP反应液；单增李斯特菌 LAMP引物；Milenia Biotec GmbH公司生产的横向流动试纸条
（2）扩增反应体系 扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer（含Mg2+） 2.5μL；LM-F3 0.5μL； LM -B3 0.5μL；LM -FIP 0.5μL；LM -BIP 0.5μL；；dNTPs 3.5μL；8U/μL Bst酶lμL；水 6μL；DNA 样品 3μL。
（3） 扩增反应过程： 63 ℃进行60min。
（4）扩增反应结束后不经过终止反应，而在反应体系中加入20pmol的探针LM-HP，63℃杂交5min。杂交结束后，从反应液中取8µL杂交液加入到100µL Buffer 中混匀，将LFD试纸条浸入其中，反应约5分钟读取检测结果。
（5）结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现紫红色条带，检测结果为阳性，则说明样品中含有单增李斯特菌；试纸条只有质控线出现紫红色条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。结果见图3。
结果说明：从图可知，本专利的试剂盒具有很好的特异性，可以用于单增李斯特菌的检测。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市动物疫病预防控制中心
<120> 单增李斯特菌 LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaagtaaatt atgatcctga aggta 25
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtaagttcc ggtcatcaa 19
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtgaaatg agctagcttg ctcgaaattg ttcaacataa aaactgg 47
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttgcctggta acgcgagaaa taccgttctc caccattc 38
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtttacgcta aagaatgc 18

Claims (3)

1.一种用于检测单增李斯特菌的LAMP特异性引物组，其特征在于它是由下述引物组成：
LM-F3 GAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTA SEQ ID NO：1
LM-B3 GGTAAGTTCCGGTCATCAA SEQ ID NO：2
LM-FIP ATGTGAAATGAGCTAGCTTGCT-CGAAATTGTTCAACATAAAAACTGG SEQ ID NO：3
LM-BIP TTGCCTGGTAACGCGAGAAA-TACCGTTCTCCACCATTC SEQ ID NO：4
其中LM-FIP的5’端标记生物素。
2.一种含有权利要求1所述用于检测单增李斯特菌的LAMP特异性引物组的试剂盒，其特征在于它的组成如下：
（1）LAMP反应液：
LAMP反应液中含有：2×Buffer含Mg2+ 2.5μL；LM-F3 0.5μL；
LM-B3 0.5μL；LM-FIP 0.5μL；LM-BIP 0.5μL；dNTPs 3.5μL
超纯水
Bst酶8U/μL
（4）LM-HP探针 20pmol
（5）横向流动试纸条
（6）用于检测单增李斯特菌的LAMP特异性引物和1个特异性探针；其中的引物和探针指的是：
LM-F3 GAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTA SEQ ID NO：1
LM-B3 GGTAAGTTCCGGTCATCAA SEQ ID NO：2
LM-FIP ATGTGAAATGAGCTAGCTTGCT-CGAAATTGTTCAACATAAAAACTGG
SEQ ID NO：3
LM-BIP TTGCCTGGTAACGCGAGAAA-TACCGTTCTCCACCATTC SEQ ID NO：4
LM-HP GTTTACGCTAAAGAATGC SEQ ID NO：5
所述的LM-FIP引物和LM-HP探针分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素。
3.权利要求1所述用于检测单增李斯特菌的LAMP特异性引物组在制备用于检测单增李斯特菌LAMP试剂盒中的应用。
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