CN103361429B - 含有内标的金黄色葡萄球菌的lamp检测引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents
含有内标的金黄色葡萄球菌的lamp检测引物、试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了含有内标的金黄色葡萄球菌LAMP检测引物、检测试剂盒和检测方法。引物为SEQ ID NO1-SEQ ID NO12，包括检测引物组及内标引物组；检测试剂盒包括引物组、反应液、DNA聚合酶、阳性对照和内标。其检测方法是通过提取待检样品，在63～65℃对样品模板进行45-60分钟的扩增，不仅可检测待检样品是否含有金黄色葡萄球菌，同时可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、适合现场检测等优点，并且可有效防止假阴性的发生，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及食品安全的检测方法，具体涉及金黄色葡萄球菌LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法，该试剂盒可根据内标检测结果判断检测结果是否为假阴性。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。
金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，食品极易被污染。据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。一般来说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。
为了寻求快速、准确、简便、微量的检验方法,国内外学者进行了大量的研究,从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法,并在实践检验中不断取得新进展。
目前，包括我国在内的许多国家对金黄色葡萄球菌的检测普遍采用传统培养方法，报告检验结果大致需4～5d，加之检测方法繁琐、费时费力，不仅成为检验部门的一项沉重负担，而且越来越不能满足日益发展的国际贸易的需要。20世纪50年代以来，为了寻求快速、准确、简便、微量的检测方法，国内外学者进行了大量的研究，从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法，并在实践检验中不断取得新进展。
以抗体为基础的ELISA方法和免疫荧光标记方法将检测时间缩短了一半，灵敏性高但特异性差；以核酸为基础的PCR技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于金黄色葡萄球菌检测，但检测样品复杂，对假阴性的检测结果没有控制，存在漏检的可能。因金黄色葡萄球菌危害严重，漏检造成的危害无法估量。但PCR扩增需要昂贵的仪器，很多基层检测单位不具备相应检测条件。因此，建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的的检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。
本发明采用环介导等温扩增技术，在恒温条件下实现对靶标基因的扩增，通过加入内标，可有效的检测到假阴性的检测结果。同时环介导等温扩增技术整体检测成本低，有利于基层的推广与应用。
金黄色葡萄球菌作为食品卫生检验一项重要目的菌有着重要的意义，提高金黄色葡萄球菌检出率,缩短检测时间，防止因样品复杂性、抑制因子多等原因等抑制反应而发生漏检的现象发生，对保证食品的安全性和消费者的身体健康具有重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物，包含检测引物组及内标引物组。可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果。为目前无法判断检测结果是否是假阴性结果的情况，提供一种新的LAMP检测方法。不仅降低检测成本，摆脱对昂贵仪器的依赖，同时提高检测的准确性。
本发明的另一个目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法。
本发明所采用的技术方案如下：
一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，包含检测引物组及内标引物组。可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果。检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
SAnuc-F3：ACAAACAGATAACGGCGTAA（SEQ ID NO:1）；
SAnuc-B3：CCAAGCCTTGACGAACTAA（SEQ ID NO:2）；
SAnuc-FIP：AGGATGCTTTGTTTCAGGTGTAAGCGATTGATGGTGATACG（SEQ ID NO:3）；
SAnuc-BIP：GCCCTGAAGCAAGTGCATTTACGCATAAATATACGCTAAGCCAC（SEQ ID NO:4）；
SAnuc-LF：TCTGAATGTCATTGGTTGACCT（SEQ ID NO:5）；
SAnuc-LB：GAAGTCGAGTTTGACAAAGGTC（SEQ ID NO:6）。
内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
SAfemA2-F3：CGCATAACAAGCGAGATAAC（SEQ ID NO:7）；
SAfemA2-B3：AGCATCTTCAGCATCTTCTG（SEQ ID NO:8）；
SAfemA2-FIP：TGCATTTGATGTACCACCAGCACGTCTACAAGAAGAACATGGT（SEQ ID NO:9）；
SAfemA2-BIP：TCCGTCATTTTGCCGGAAGTTATAACGGTCAATGCCATGATT（SEQ ID NO:10）；
SAfemA2-LF：GAAGAAACCAGCAGAGATAGGT（SEQ ID NO:11）；
SAfemA2-LB：GCAGTGCAATGGGAAATGATTA（SEQ ID NO:12）。
用于检测金黄色葡萄球菌的引物，包括权前述的检测引物组和内标引物组SEQ ID NO1-SEQ ID NO12。
一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，该检测试剂盒包括前述的检测引物组和内标引物组。
前述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，包括以下成分：（1）前述的引物SEQ IDNO1-SEQ ID NO12；（2）内标靶标片段；（3）DNA聚合酶；（4）LAMP反应液；（5）阳性对照和阴性对照。
前述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其中，检测引物组及内标引物组，引物浓度的比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。
前述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；
前述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其中，所述LAMP反应液含有：8mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mM MgSO4水溶液、三者的体积比是7：4：3。
前述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其中，阳性对照为含有金黄色葡萄球菌SAnuc基因片段的T载体克隆。阴性对照为超纯水。内标为含有金黄色葡萄球菌(femA2)基因片段的T载体克隆，浓度为内标引物组（femA2）的最低检出限（10pg/μl）。
利用前述的试剂盒检测金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
（1）待检样品的提取：按照DNA提取试剂盒进行。
（2）恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：SAnuc-F30.2μM，SAnuc-B30.2μM，SAnuc-FIP1.6μM，SAnuc-BIP1.6μM，SAnuc-LF0.8μM，SAnuc-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
（3）恒温基因扩增内标反应体系及条件：25μl反应体系含有：SAfemA2-F30.2μM，SAfemA2-B30.2μM，SAfemA2-FIP1.6μM，SAfemA2-BIP1.6μM，SAfemA2-LF0.8μM，SAfemA2-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I0.5μl，待检样品2μl，内标2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～45min，并在80℃持续2min。
（4）结果判断：将上述反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner或荧光PCR仪（如ABI7500）中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。根据nuc基因检测结果和内标基因(femA2)检测结果进行判断。
nuc基因检测结果与内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阳性;
nuc基因检测结果为阴性，内标基因检测结果为阳性时，检测结果为阴性;
nuc基因检测结果为阳性，内标基因检测结果全为阴性时，检测结果为阳性;
nuc基因检测结果为阴性，内标基因检测结果为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测或采用其他方法检测。
本发明具有快速高效、操作便捷、高特异性、高灵敏度、鉴定简单、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等有益效果，更重要是该方法提高了检测的准确性，可有效防止因样品中抑制因子和操作原因导致的假阴性检测结果的发生。
（1）快速高效：整个扩增只用45～60min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
（2）操作便捷：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；
（3）高特异性：
本发明根据金黄色葡萄球菌nuc基因设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
（4）高灵敏度：最低检测极限可达到10fg/μl；
（5）鉴定简单：可通过观察扩增曲线判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
（6）提高检测的准确性：内含内标基因。可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果，有效预防因抑制等原因造成假阴性检测结果的情况发生，为目前无法判断检测结果是假阴性结果的情况提供一种新的LAMP检测方法，提高检测的准确性。
附图说明
图1金黄色葡萄球菌内标基因灵敏度图；
图2金黄色葡萄球菌内标基因最低检出限重复性图；
图3金黄色葡萄球菌检测基因nuc灵敏度图；
图4金黄色葡萄球菌检测基因nuc特异性图，对单核增生李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、克雷伯氏菌、藤黄微球菌无非特异性扩增；
图5无抑制因子的实际样品检测；
图6有抑制因子的实际样品检测。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
实施例1金黄色葡萄球菌LAMP检测试剂盒的建立
金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，包括LAMP引物组、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和内标。
（1）LAMP引物组：以金黄色葡萄球菌nuc为靶基因、femA2为内标基因，利用在线设计软件Primer Explorer version4(http://primerexplorer.jp/e)进行LAMP引物的设计。
nuc引物序列如下：
SAnuc-F3：ACAAACAGATAACGGCGTAA（SEQ ID NO:1）；
SAnuc-B3：CCAAGCCTTGACGAACTAA（SEQ ID NO:2）；
SAnuc-FIP：AGGATGCTTTGTTTCAGGTGTAAGCGATTGATGGTGATACG（SEQ ID NO:3）；
SAnuc-BIP：GCCCTGAAGCAAGTGCATTTACGCATAAATATACGCTAAGCCAC（SEQ ID NO:4）；
SAnuc-LF：TCTGAATGTCATTGGTTGACCT（SEQ ID NO:5）；
SAnuc-LB：GAAGTCGAGTTTGACAAAGGTC（SEQ ID NO:6）。
femA2内标引物组如下所示：
SAfemA2-F3：CGCATAACAAGCGAGATAAC（SEQ ID NO:7）；
SAfemA2-B3：AGCATCTTCAGCATCTTCTG（SEQ ID NO:8）；
SAfemA2-FIP：TGCATTTGATGTACCACCAGCACGTCTACAAGAAGAACATGGT（SEQ ID NO:9）；
SAfemA2-BIP：TCCGTCATTTTGCCGGAAGTTATAACGGTCAATGCCATGATT（SEQ ID NO:10）；
SAfemA2-LF：GAAGAAACCAGCAGAGATAGGT（SEQ ID NO:11）；
SAfemA2-LB：GCAGTGCAATGGGAAATGATTA（SEQ ID NO:12）。
（2）LAMP反应液：8mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mM MgSO4水溶液、三者的体积比是7：4：3。
（3）阳性对照及内标分别为含有金黄色葡萄球菌SAnuc基因部分片段和femA2基因部分片段的T载体克隆，其制备方法为：以分离鉴定的金黄色葡萄球菌为模板，分别利用的nuc外引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）和femA2（SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8）内标外引物进行扩增，所得nuc基因扩增片段序列和femA2基因扩增片段序列，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照和内标。
（4）阴性对照为超纯水。
（5）检测方法：
1)待检样品的提取：按照DNA提取试剂盒进行。
2)恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：SAnuc-F30.2μM，SAnuc-B30.2μM，SAnuc-FIP1.6μM，SAnuc-BIP1.6μM，SAnuc-LF0.8μM，SAnuc-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～60min，并在80℃持续2min；
3)恒温基因扩增内标反应体系及条件：25μl反应体系含有：SAfemA2-F30.2μM，SAfemA2-B30.2μM，SAfemA2-FIP1.6μM，SAfemA2-BIP1.6μM，SAfemA2-LF0.8μM，SAfemA2-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I0.5μl，待检样品2μl，内标2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～45min，并在80℃持续2min。
4)结果判断：将上述反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner或荧光PCR仪（如ABI7500）中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。根据nuc基因检测结果和内标基因(femA2)检测结果进行判断。
nuc基因检测结果与内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阳性;
nuc基因检测结果为阴性，内标基因检测结果为阳性时，检测结果为阴性;
nuc基因检测结果为阳性，内标基因检测结果全为阴性时，检测结果为阳性;
nuc基因检测结果为阴性，内标基因检测结果为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测或采用其他方法检测。
实施例2灵敏度实验
将构建的质粒进行灵敏度实验，将1pg/μl质粒作10倍梯度稀释以1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl四个梯度作为质控标准，用实施例1的操作进行检测，通过灵敏度实验确定内标基因的最低检出限10fg/μl（如图1所示），将内标浓度定位最低检出限的浓度（图2）。
将培养的金黄色葡萄球菌进行培养，将培养后的菌进行10倍梯度稀释，按照实施例1种的方法提取DNA，同时将稀释的菌液进行平板培养计数，将平板培养计数结果与本试剂盒的最低灵敏度进行对比，本试剂盒的最低检出度为103CFU/ml，检测结果见图3。
实施例3特异性实验
用实施例1的方法分别对培养的单核增生李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、克雷伯氏菌、藤黄微球菌进行提取，按照实施例1进行检测，结果显示阳性对照记内标基因扩增正常，对单核增生李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、克雷伯氏菌、藤黄微球菌均无非特异性扩增。
实施例4实际样品检测
用上述试剂盒进行实际样品的检测。
（1）待检样品DNA的提取：
1)取金黄色葡萄球菌及含有EDTA抑制因子金黄色葡萄球菌菌液1-2ml，12000rpm离心5min，弃上清；
2)加入500μl0.8%NaCl水溶液或医用生理盐水，12000rpm离心5min，尽量弃净上清液；
3)沉淀中加入100μl DNA提取液，剧烈涡旋混匀，100℃加热10min，加热后迅速冷却（置于-20℃冰箱）10min；
4)12000rpm离心2min，将上清转移至新的离心管中备用（2μl上清用于核酸扩增）。
（2）恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：SAnuc-F30.2μM，SAnuc-B30.2μM，SAnuc-FIP1.6μM，SAnuc-BIP1.6μM，SAnuc-LF0.8μM，SAnuc-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I0.5μl，待检2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
（3）恒温基因扩增内标反应体系及条件：25μl反应体系含有：SAfemA2-F30.2μM，SAfemA2-B30.2μM，SAfemA2-FIP1.6μM，SAfemA2-BIP1.6μM，SAfemA2-LF0.8μM，SAfemA2-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I0.5μl，待检样品2μl，内标基因2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～60min，并在80℃持续2min；
（4）结果判断：将上述反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner或荧光PCR仪（如ABI7500）中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。根据nuc基因检测结果和内标基因(femA2)检测结果进行判断。
检测结果见图5及图6，图5不含抑制因子的样品，内标基因及样品检测结果为阳性，图6中试剂盒各浓度梯度均能检出，且出峰时间正常，但含抑制因子的内标基因及样品检测结果均为阴性，提示样品中含有抑制因子。因此该方法可有效的鉴别检测结果是否为假阴性。
Claims (9)
1.一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，该方法用于非疾病诊断和治疗，使用了检测引物组及内标引物组，可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果，其中，检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
SAnuc-F3：ACAAACAGATAACGGCGTAA(SEQ ID NO:1)；
SAnuc-B3：CCAAGCCTTGACGAACTAA(SEQ ID NO:2)；
SAnuc-FIP：AGGATGCTTTGTTTCAGGTGTAAGCGATTGATGGTGATACG(SEQ ID NO:3)；
SAnuc-BIP：GCCCTGAAGCAAGTGCATTTACGCATAAATATACGCTAAGCCAC(SEQ ID NO:4)；
SAnuc-LF：TCTGAATGTCATTGGTTGACCT(SEQ ID NO:5)；
SAnuc-LB：GAAGTCGAGTTTGACAAAGGTC(SEQ ID NO:6)；
内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
SAfemA2-F3：CGCATAACAAGCGAGATAAC(SEQ ID NO:7)；
SAfemA2-B3：AGCATCTTCAGCATCTTCTG(SEQ ID NO:8)；
SAfemA2-FIP：TGCATTTGATGTACCACCAGCACGTCTACAAGAAGAACATGGT(SEQ ID NO:9)；
SAfemA2-BIP：TCCGTCATTTTGCCGGAAGTTATAACGGTCAATGCCATGATT(SEQ ID NO:10)；
SAfemA2-LF：GAAGAAACCAGCAGAGATAGGT(SEQ ID NO:11)；
SAfemA2-LB：GCAGTGCAATGGGAAATGATTA(SEQ ID NO:12)；
结果判断：根据nuc基因检测结果和内标基因femA2检测结果进行判断：
nuc基因检测结果与内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
nuc基因检测结果为阴性，内标基因检测结果为阳性时，检测结果为阴性；
nuc基因检测结果为阳性，内标基因检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
nuc基因检测结果为阴性，内标基因检测结果为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测或采用其他方法检测。
2.用于检测金黄色葡萄球菌的引物，其特征在于，引物由权利要求1中所述的检测引物组和内标引物组组成。
3.一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组和内标引物组。
4.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：(1)权利要求1所述的引物组；(2)内标靶标片段；(3)DNA聚合酶；(4)LAMP反应液；(5)阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于检测引物组及内标引物组，引物浓度的比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。
6.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
7.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述LAMP反应液含有：8mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mM MgSO4水溶液、三者的体积比是7：4：3。
8.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：阳性对照为含有金黄色葡萄球菌nuc基因片段的T载体克隆；阴性对照为超纯水；内标为含有金黄色葡萄球菌femA2基因片段的T载体克隆，浓度为内标引物组femA2的最低检出限10fg/μl。
9.利用权利要求3～8任一项所述的试剂盒检测金黄色葡萄球菌的方法，该方法用于非疾病诊断和治疗，包括如下步骤：
(1)待检样品的提取：按照DNA提取试剂盒进行；
(2)恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：SAnuc-F3 0.2μM，SAnuc-B3 0.2μM，SAnuc-FIP 1.6μM，SAnuc-BIP 1.6μM，SAnuc-LF 0.8μM，SAnuc-LB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I 0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～60min，并在80℃持续2min；
(3)恒温基因扩增内标反应体系及条件：25μl反应体系含有：SAfemA2-F30.2μM，SAfemA2-B30.2μM，SAfemA2-FIP 1.6μM，SAfemA2-BIP 1.6μM，SAfemA2-LF0.8μM，SAfemA2-LB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR GreenI 0.5μl，待检样品2μl，内标2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
(4)结果判断：将上述反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner或荧光PCR仪中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果；根据nuc基因检测结果和内标基因femA2检测结果进行判断：
nuc基因检测结果与内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
nuc基因检测结果为阴性，内标基因检测结果为阳性时，检测结果为阴性；
nuc基因检测结果为阳性，内标基因检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
nuc基因检测结果为阴性，内标基因检测结果为阴性时，检测结果可能为假阴性，
建议重新提取DNA进行检测或采用其他方法检测。
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Denomination of invention: LAMP detection primer, kit and detection method for staphylococcus aureus containing internal standard Effective date of registration: 20190104 Granted publication date: 20150603 Pledgee: Oriental Quality Health Food Holding Co.,Ltd. Pledgor: Xiamen Yinxiang Group Co.,Ltd. Registration number: 2019340000014 |
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