CN103320435B - 含内标的单核细胞增生李斯特氏菌lamp检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒及检测方法，属于食品安全的分子生物学检测方法领域。本发明的LAMP检测试剂盒中检测引物组包括检测引物组及内标引物组；检测试剂盒包括引物组、反应液、DNA聚合酶、核酸荧光染料、阳性对照和内标。其检测方法是通过提取待检样品，在63～65℃对样品模板进行30-45分钟的扩增，不仅可检测待检样品是否含有单核细胞增生李斯特氏菌，同时可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、适合现场检测等优点，并且可有效防止假阴性的发生，适于推广应用。

Description

含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒

技术领域

本发明属于食品安全的分子生物学检测方法领域，特别涉及一种含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌是是李斯特菌属中的一种，广泛分布于自然界，在肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品和蔬菜类都能检出，其感染严重时可引起血液和脑组织疾病，是引起动物和人类疾病的重要致病菌。

单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特菌属中致病力最强的细菌，也是迄今发现唯一能对人致病的、典型的胞内寄生菌，能在巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞和肝细胞内增殖。目前发现LM染色体基因有2个毒力岛，分别为李斯特菌毒力岛1（LIPI-1）和李斯特菌毒力岛2（LIPI-2）。LIPI-1有6个基因，分别为prfA、plcA、hlY、mpI、actA、plcB。LIPI-2为内化素小岛，有inIAB基因和inIC基因，分别编码不同的致病物质。它能引起人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症、心内膜炎、流产、脓肿和局部的脓性损伤，可造成孕妇流产、死胎等疾病，发病者死亡率可达20%～70%。人类李斯特菌病感染对象主要是新生儿、孕妇、老年人和免疫功能低下者，免疫正常人群很少感染。其在4℃的环境下仍能生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要的重要致病菌。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患的致病菌，也是重要的食源性致病菌。近年来，单核细胞增生李斯特氏菌在法国、美国、加拿大和德国等国曾多次引起食物中毒，轻者为一般胃肠炎症状，重症者主要表现为败血症、脑膜炎、神经症状及单核细胞增多等，临床死亡率高达20%～70%。

为了寻求快速、准确、简便、微量的检验方法，国内外学者进行了大量的研究，从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法,并在实践检验中不断取得新进展。

目前，包括我国在内的许多国家对单核细胞增生李斯特氏菌的检测普遍采用传统培养方法，报告检验结果大致需4～5d，加之检测方法繁琐、费时费力，不仅成为检验部门的一项沉重负担，而且越来越不能满足日益发展的国际贸易的需要。20世纪50年代以来，为了寻求快速、准确、简便、微量的检测方法，国内外学者进行了大量的研究，从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法，并在实践检验中不断取得新进展。

以抗体为基础的ELISA方法和免疫荧光标记方法将检测时间缩短了一半，灵敏性高和但特异性差；以核酸为基础的PCR技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于单核细胞增生李斯特氏菌检测，但检测样品复杂，对假阴性的检测结果没有控制，存在漏检的可能。因单核细胞增生李斯特氏菌危害严重，漏检造成的危害无法估量。但PCR扩增需要昂贵的仪器，很多基层检测单位不具备相应检测条件。因此，建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的的检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。

单核细胞增生李斯特氏菌作为食品卫生检验一项重要目的菌有着重要的意义，提高单核细胞增生李斯特氏菌检出率，缩短检测时间，防止因样品复杂性、抑制因子多等原因抑制反应而发生漏检的现象发生，对保证食品的安全性和消费者的身体健康具有重要的意义。

发明内容

为克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组，包含检测引物组及内标引物组。

本发明的另一目的在于提供包含上述检测引物组的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒。可根据试剂盒内的检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果。为目前无法判断检测结果是否是假阴性结果的情况，提供一种新的LAMP检测方法。不仅降低检测成本，摆脱对昂贵仪器的依赖，同时提高检测的准确性。

本发明的再一目的在于提供上述的LAMP检测试剂盒检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。本发明的检测方法采用环介导等温扩增技术，在恒温条件下实现对靶标基因的扩增，通过加入内标，可有效的检测到假阴性的检测结果。同时环介导等温扩增技术整体检测成本低，有利于基层的推广与应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组，包含检测引物组及内标引物组。可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果。

检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

LMhly-F3：ATTAGTATACCACGGAGATGC；

LMhly-B3：TCCACTAATGTATTTACTGCGT；

LMhly-FIP：

GAATTCGCTTTCACGAGAGCGCAGATATCCAAGTTGTGAATG；

LMhly-BIP：

CAACCCGATGTTCTTCCTGTCACTTGATTAGTCATTCCTGGCA；

LMhly-LF：ACCTGGATATGTTAGGCTCG；

LMhly-LB：CGTGATTCATTAACACTTAGCA；

内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

LMprfA-F3：TGAACGCTCAAGCAGAAG；

LMprfA-B3：AGCTAGACTGTATGAAACTTGT；

LMprfA-FIP：TGATGGTCCCGTTCTCGCTACCAATGGGATCCACAAGAA；

LMprfA-BIP：

TGATACAGAAACATCGGTTGGCTTGATAACGTATGCGGTAGC；

LMprfA-LF：TACTCGTGAGCTTTGTGATACC；

LMprfA-LB：TTAGAAGTCATTAGCGAGCAG。

一种含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒，包括上述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组。

所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP检测试剂盒，具体由以下成分组成：上述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组；DNA聚合酶；LAMP反应液；核酸荧光染料；内标；阳性对照和阴性对照。

所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组中，检测引物组及内标引物组的引物浓度比例为：外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。

所述DNA聚合酶优选为Bst DNA聚合酶；

所述LAMP反应液含有：8mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO₄水溶液；三者的体积比是7：4：3；

所述的核酸荧光染料优选为10×SYBR Green I；

所述的内标为含有单核细胞增生李斯特氏菌prfA基因片段的T载体克隆，内标的使用浓度为10pg/μl；此处的10pg/μl为内标引物组的最低检出限；所述的含有单核细胞增生李斯特氏菌prfA基因片段的T载体克隆通过下述方法制备：以分离鉴定的单核细胞增生李斯特氏菌为模板，利用内标引物组的外引物LMprfA-F3和LMprfA-B3进行扩增，所得prfA基因扩增片段序列，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为内标含有单核细胞增生李斯特氏菌prfA基因片段的T载体克隆。

所述的单核细胞增生李斯特氏菌按照中华人民共和国国家标准GB/T4789.30-2010《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行分离鉴定。

所述的阳性对照为含有单核细胞增生李斯特氏菌LMhly基因片段的T载体克隆；通过下述方法制备：以分离鉴定的单核细胞增生李斯特氏菌为模板，利用检测引物组的外引物LMhly-F3和LMhly-B3进行扩增，所得hly基因扩增片段序列，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照含有单核细胞增生李斯特氏菌LMhly基因片段的T载体克隆。

所述的阴性对照为超纯水。

所述的LAMP检测试剂盒检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括如下步骤：

（1）待检样品的提取：按照DNA提取试剂盒进行；

（2）恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：LMhly-F30.2μM，LMhly-B30.2μM，LMhly-FIP1.6μM，LMhly-BIP1.6μM，LMhly-LF0.8μM，LMhly-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR GreenI0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl置于PCR管中；同时设置阳性对照和阴性对照；

（3）恒温基因扩增内标反应体系及条件：25μl反应体系含有：LMprfA-F30.2μM，LMprfA-B30.2μM，LMprfA-FIP1.6μM，LMprfA-BIP1.6μM，LMprfA-LF0.8μM，LMprfA-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreen I0.5μl，待检样品2μl，内标2μl，用超纯水补齐到25μl置于PCR管中；同时设置阳性对照和阴性对照；

（4）将步骤（2）、（3）配置的含反应体系在PCR管中混匀后离心，置于荧光检测仪器中于63～65℃反应30～45min，并在80℃持续2min，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果，通过待测样品的检测反应和内标反应两者的扩增结果来判断检测结果。

待测样品的检测反应和内标反应结果全为阳性时，检测结果为阳性；

待测样品的检测反应结果为阴性，内标反应结果为阳性时，检测结果为阴性；

待测样品的检测反应结果为阳性，内标反应结果为阴性时，检测结果为阴性；

待测样品的检测反应结果为阴性，内标反应结果为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测或采用其他方法检测。

步骤（4）中所述的荧光检测仪器为ESE-Quant Tube Scanner或荧光PCR仪；所述的荧光PCR仪优选为AB0I7500。

本发明的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP检测试剂盒的最低检出度为10³CFU/ml。

本发明相对于现有技术具有以下的优点和效果：

本发明具有快速高效、操作便捷、高特异性、高灵敏度、鉴定简单、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等有益效果，更重要是该方法提高了检测的准确性，可有效防止因样品中抑制因子和操作原因导致的假阴性检测结果的发生。

（1）快速高效：整个扩增只用30～45min即可完成，扩增产量可达10⁹～10¹⁰个拷贝；

（2）操作便捷：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒温荧光检测仪就能反应和检测，条件温和；

（3）高特异性：

本发明根据单核细胞增生李斯特氏菌hly基因设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；

（4）高灵敏度：最低检测极限可达到10fg/μl；

（5）鉴定简单：可通过观察扩增曲线判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。

（6）提高检测的准确性：内含内标基因。可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果，有效预防因抑制等原因造成的假阴性检测结果的发生，为目前无法判断检测结果是假阴性结果的情况提供一种新的LAMP检测方法，提高检测的准确性。

附图说明

图1为单核细胞增生李斯特氏菌内标基因灵敏度图。

图2为单核细胞增生李斯特氏菌内标基因最低检出限重复性图。

图3为单核细胞增生李斯特氏菌检测基因hly灵敏度图。

图4为单核细胞增生李斯特氏菌检测基因hly特异性图，对英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、威尔斯李斯特菌、格氏李斯特菌、默氏李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、普通变形杆菌、克雷伯氏菌、藤黄微球菌无非特异性扩增。

图5为无抑制因子的实际样品检测。

图6为有抑制因子的实际样品检测。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒的建立

含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP检测试剂盒，包括LAMP引物组、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、10×SYBR、阳性对照、阴性对照和内标。

（1）LAMP引物组：以单核细胞增生李斯特氏菌hly为靶基因、prfA为内标基因，利用在线设计软件Primer Explorer version4(http://primerexplorer.jp/e)进行LAMP引物的设计。

Hly检测引物组序列如下所示：

LMhly-F3：ATTAGTATACCACGGAGATGC；

LMhly-B3：TCCACTAATGTATTTACTGCGT；

LMhly-FIP：

GAATTCGCTTTCACGAGAGCGCAGATATCCAAGTTGTGAATG；

LMhly-BIP：

CAACCCGATGTTCTTCCTGTCACTTGATTAGTCATTCCTGGCA；

LMhly-LF：ACCTGGATATGTTAGGCTCG；

LMhly-LB：CGTGATTCATTAACACTTAGCA。

prfA内标引物组序列如下所示：

LMprfA-F3：TGAACGCTCAAGCAGAAG；

LMprfA-B3：AGCTAGACTGTATGAAACTTGT；

LMprfA-FIP：TGATGGTCCCGTTCTCGCTACCAATGGGATCCACAAGAAT；

LMprfA-BIP：

TGATACAGAAACATCGGTTGGCTTGATAACGTATGCGGTAGC；

LMprfA-LF：TACTCGTGAGCTTTGTGATACC；

LMprfA-LB：TTAGAAGTCATTAGCGAGCAG。

（2）LAMP反应液：8mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mM MgSO₄水溶液、三者的体积比是7：4：3。

（3）阳性对照及内标分别为含有单核细胞增生李斯特氏菌LMhly基因部分片段和prfA基因部分片段的T载体克隆，其制备方法为：以分离鉴定的单核细胞增生李斯特氏菌（按照中华人民共和国国家标准GB/T4789.30-2010《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行分离鉴定）为模板，分别利用的hly外引物LMhly-F3和LMhly-B3和prfA内标外引物LMprfA-F3和LMprfA-B3进行扩增，所得hly基因扩增片段序列和prfA基因扩增片段序列，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照和内标。

（4）阴性对照为超纯水。

（5）检测方法：

1）待检样品的提取：按照DNA提取试剂盒进行。

2）恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：LMhly-F30.2μM，LMhly-B30.2μM，LMhly-FIP1.6μM，LMhly-BIP1.6μM，LMhly-LF0.8μM，LMhly-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR GreenI0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl置于PCR管中；同时设置阳性对照和阴性对照；

3）恒温基因扩增内标反应体系及条件：25μl反应体系含有：LMprfA-F30.2μM，LMprfA-B30.2μM，LMprfA-FIP1.6μM，LMprfA-BIP1.6μM，LMprfA-LF0.8μM，LMprfA-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreen I0.5μl，待检样品2μl，内标2μl，用超纯水补齐到25μl置于PCR管中；同时设置阳性对照和阴性对照；

4）结果判断：将步骤3）配置的含反应体系在PCR管中混匀后离心，置于荧光PCR仪（ABI7500）中于63～65℃反应30～45min，并在80℃持续2min，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。根据hly基因检测结果和内标基因(prfA)检测结果进行判断。

hly基因检测结果与内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；

hly基因检测结果为阴性，内标基因检测结果为阳性时，检测结果为阴性；

hly基因检测结果为阳性，内标基因检测结果为阴性时，检测结果为阳性；

hly基因检测结果为阴性，内标基因检测结果为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测或采用其他方法检测。

实施例2灵敏度实验

用实施例1构建的内标质粒进行灵敏度实验，将l质粒作10倍梯度稀释梯度作为质控标准，用实施例1的操作进行检测，63℃反应45min，通过灵敏度实验确定内标基因的最低检出限10fg/μl（如图1），将内标浓度定位最低检出限的浓度（图2）。

将培养的单核细胞增生李斯特氏菌进行培养（按照中华人民共和国国家标准GB/T4789.30-2010《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行分离鉴定），将培养后的菌进行10倍梯度稀释，按照实施例1中的方法提取DNA，同时将稀释的菌液进行平板培养计数，将平板培养计数结果与本试剂盒的最低灵敏度进行对比，本试剂盒的最低检出度为10³CFU/ml，检测结果见图3。

实施例3特异性实验

用实施例1的方法分别对培养的单核增生李斯特氏菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、威尔斯李斯特菌、格氏李斯特菌、默氏李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、普通变形杆菌、克雷伯氏菌、藤黄微球菌进行提取，按照实施例1进行检测，63℃反应45min，结果如图4显示阳性对照及内标基因扩增正常，对英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、威尔斯李斯特菌、格氏李斯特菌、默氏李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、普通变形杆菌、克雷伯氏菌、藤黄微球菌均无非特异性扩增。

实施例4实际样品检测

用上述试剂盒进行实际样品的检测。

（1）待检样品DNA的提取：

1）取单核细胞增生李斯特氏菌及含有EDTA抑制因子单核细胞增生李斯特氏菌菌液1～2ml，12000rpm离心5min，弃上清；

2）加入500μl质量份数为0.8%NaCl水溶液，12000rpm离心5min，尽量弃净上清液；

3）沉淀中加入100μl DNA提取液，剧烈涡旋混匀，100℃加热10min，加热后迅速冷却（置于-20℃冰箱）10min；

4）12000rpm离心2min，将上清转移至新的离心管中备用（2μl上清用于核酸扩增）。

（2）恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：LMhly-F30.2μM，LMhly-B30.2μM，LMhly-FIP1.6μM，LMhly-BIP1.6μM，LMhly-LF0.8μM，LMhly-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreen I0.5μl，待检2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；

（3）恒温基因扩增内标反应体系及条件：25μl反应体系含有：LMprfA-F30.2μM，LMprfA-B30.2μM，LMprfA-FIP1.6μM，LMprfA-BIP1.6μM，LMprfA-LF0.8μM，LMprfA-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreen I0.5μl，待检样品2μl，内标基因2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；

（4）结果判断：将上述步骤（2）、（3）中配制好的PCR管混匀后离心，置于荧光PCR仪（ABI7500）中，并于63℃反应45min，并在80℃持续2min；反应管中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。根据hly基因检测结果和内标基因(prfA)检测结果进行判断。

检测结果见图5和图6，图5为不含抑制因子的样品，内标基因及样品检测结果为阳性，图6中试剂盒各浓度梯度均能检出，且出峰时间正常，但含抑制因子的内标基因及样品检测结果均为阴性，提示样品中含有抑制因子。因此该方法可有效的鉴别检测结果是否为假阴性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组，其特征在于包含检测引物组及内标引物组；

所述的检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

LMhly-F3：ATTAGTATACCACGGAGATGC；

LMhly-B3：TCCACTAATGTATTTACTGCGT；

LMhly-FIP：

GAATTCGCTTTCACGAGAGCGCAGATATCCAAGTTGTGAATG；

LMhly-BIP：

CAACCCGATGTTCTTCCTGTCACTTGATTAGTCATTCCTGGCA；

LMhly-LF：ACCTGGATATGTTAGGCTCG；

LMhly-LB：CGTGATTCATTAACACTTAGCA；

所述的内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

LMprfA-F3：TGAACGCTCAAGCAGAAG；

LMprfA-B3：AGCTAGACTGTATGAAACTTGT；

LMprfA-FIP：

TGATGGTCCCGTTCTCGCTACCAATGGGATCCACAAGAAT；

LMprfA-BIP：

TGATACAGAAACATCGGTTGGCTTGATAACGTATGCGGTAGC；

LMprfA-LF：TACTCGTGAGCTTTGTGATACC；

LMprfA-LB：TTAGAAGTCATTAGCGAGCAG。

2.一种含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒，其特征在于由以下成分组成：权利要求1所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组；DNA聚合酶；LAMP反应液；核酸荧光染料；内标；阳性对照和阴性对照；

所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；

所述LAMP反应液含有8mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和120mMMgSO₄水溶液三种成分；

所述的核酸荧光染料为10×SYBR Green I；

所述的内标为含有单核细胞增生李斯特氏菌prfA基因片段的T载体克隆；

所述的阳性对照为含有单核细胞增生李斯特氏菌LMhly基因片段的T载体克隆；

所述的阴性对照为超纯水。

3.根据权利要求2所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的含有单核细胞增生李斯特氏菌prfA基因片段的T载体克隆通过下述方法制备：以分离鉴定的单核细胞增生李斯特氏菌为模板，利用内标引物组的外引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8进行扩增，所得prfA基因扩增片段序列，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，获得含有单核细胞增生李斯特氏菌prfA基因片段的T载体克隆。

4.根据权利要求2所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的含有单核细胞增生李斯特氏菌LMhly基因片段的T载体克隆通过下述方法制备：以分离鉴定的单核细胞增生李斯特氏菌为模板，利用检测引物组的外引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行扩增，所得hly基因扩增片段序列，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为含有单核细胞增生李斯特氏菌LMhly基因片段的T载体克隆。

5.根据权利要求2所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组中，检测引物组及内标引物组的引物浓度比例为：外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。

6.根据权利要求2所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述LAMP反应液中8mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和120mM MgSO₄水溶液三者的体积比是7：4：3。

7.权利要求2～6任一项所述的检测试剂盒检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)待检样品的提取：按照DNA提取试剂盒进行；

(2)恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：LMhly-F30.2μM，LMhly-B3 0.2μM，LMhly-FIP 1.6μM，LMhly-BIP 1.6μM，LMhly-LF0.8μM，LMhly-LB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR GreenI 0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl置于PCR管中；同时设置阳性对照和阴性对照；

(3)恒温基因扩增内标反应体系及条件：25μl反应体系含有：LMprfA-F30.2μM，LMprfA-B3 0.2μM，LMprfA-FIP 1.6μM，LMprfA-BIP 1.6μM，LMprfA-LF0.8μM，LMprfA-LB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreen I 0.5μl，待检样品2μl，内标2μl，用超纯水补齐到25μl置于PCR管中；同时设置阳性对照和阴性对照；

(4)将步骤(2)和(3)配置的含反应体系在PCR管中混匀后离心，置于荧光检测仪器中于63～65℃反应30～45min，并在80℃持续2min，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果，通过待测样品的检测反应和内标反应两者的扩增结果来判断检测结果；

待测样品的检测反应和内标反应结果全为阳性时，检测结果为阳性；

待测样品的检测反应结果为阴性，内标反应结果为阳性时，检测结果为阴性；

待测样品的检测反应结果为阳性，内标反应结果为阴性时，检测结果为阴性；

待测样品的检测反应结果为阴性，内标反应结果为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测或采用其他方法检测；

所述的检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法用于非疾病诊断或/和治疗目的。

8.根据权利要求7所述的检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤(4)中所述的荧光检测仪器为ESE-Quant Tube Scanner或荧光PCR仪。

9.权利要求2～6任一项所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒的最低检出度为10³CFU/ml。