CN102925548B - 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌lamp试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测猪传染性胸膜放线杆菌的LAMP试剂盒及使用方法。该试剂盒包含8U/μl的BstDNA聚合酶50μl；BstDNA聚合酶缓冲液125μl；0.1mol/l的MgSO4100μl；12.5mmol/l甜菜碱100μl；17.5mmol/l dNTP100μl；引物。经多次实践检验表明，该试剂盒能在63℃-64℃恒温水浴锅中特异、敏感、快速、高效地检测出微量的多种血清型的猪传染性胸膜放线杆菌。此方法不需要复杂的仪器，亦不需要太多的专业技能，能较好地满足目前对猪传染性胸膜放线杆菌现场检测的迫切需要，可用于进出口检疫、食品卫生部门、畜牧饲养场等的现场检测，特别适合于广大兽医基层工作者对猪肉传染性胸膜肺炎放线杆菌的野外和实时检测。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域中的疾病诊断技术，具体涉及一种可简单快速检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的LAMP试剂盒及使用方法。
背景技术
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)是一种革兰氏阴性小球菌，属于巴氏杆菌科放线杆菌属。根据生长时对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的依赖性可将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分为两个生物型，即生物I型和生物II型，其中生物I型对猪具有致病性。又根据其荚膜多糖与脂多糖的差异，可将生物I型分为15个血清型，血清1型又分为1a和1b两个亚型，血清5型又分为5a、5b亚型。各血清型间的交叉保护力不强，其中1、4和6型间及3、6和8型间有交叉反应，可能这些血清型间存在着相似的细胞结构。生物I型菌株具有外毒素、内毒素、细胞毒性毒素及溶血活性毒素，除此之外，荚膜多糖、脂多糖、通透因子等也与本菌的致病性有关，但溶血活性毒素在致病性上发挥着更重要的作用。值得一提的是，不同血消的菌株的重要特性如致病毒素产量不相同，产生毒素种类也有差异，由于以上原因不同菌株对猪的致病力也不同。一般来说，血清型1、5、9、10及11比其他血清型毒力强，也常见于暴发严重、死亡率高和肺脏病变严重的病倒，而血清3型和6型的致病性则被认为很低。
自从1957年Pattison等第一次报道猪传染性胸膜肺炎起，世界大部分国家和地区如美国、英国、加拿大、意大利、法国、丹麦等多数养猪业发达的国家也相继报道了本病的发生和流行。由于其造成的严重损失，现已成为世界性工业化养猪的五大疫病之一。近年来随着生猪的跨国运输及我国养猪业的发展，在1987年哈尔滨兽医研究所发现本病的临诊病例，证明了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌在我国存在和流行。随着国内养猪业规模的逐渐扩大，，加之缺乏严格有效的兽医卫生管理制度，自2000年以来，猪传染性胸膜肺炎在我国多处出现爆发性流行，给我国的养猪业带来了惨重的经济损失。我国幅员辽阔，各地流行的血清型有所差异，各地的饲养管理水平和环境条件差异较大，所以本病的导致的临床症状和病理变化也不尽相同，这就给本病的诊断带来了困难。
2000年，T.Notomi及其团队发明了一种新型核酸扩增技术：环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，该方法依赖不同的4种特异性引物来识别并扩增靶基因中的6个特定区域，扩增效率高，可在30～60min将目的片段扩增109～1010倍。由于扩增依赖于靶序列的多个特异性区域，其特异性和敏感性均较普通PCR和荧光定量PCR高。此外，所运用的DNA聚合酶具有链置换功能，扩增反应可在恒温的条件下进行，不需要昂贵的仪器，仅仅使用普通的水浴锅即能进行扩增反应，加之所需时间短及反应产物易于观察(可以通过肉眼判定扩增样本是否为阳性)，这就给广大缺乏专业设备基层兽医工作站带来了福音。基于以上优点，LAMP自发明之门起，已被广泛用于病原的检测，其中包括猪瘟病毒，猪繁殖与呼吸系统综合征病毒，圆环病毒2型，猪伪狂犬病毒，猪传染性胃肠炎病毒，猪流行性腹泻病毒，副猪嗜血杆菌，大肠杆菌，巴氏杆菌等，但到目前为止，未发现将LAMP方法用于检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的专利申请。
发明内容
为了克服现有检测猪传染性胸膜肺炎PCR技术中所存在的设备昂贵、耗时长等问题，本发明提供一种用于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的LAMP检测方法，该检测方法能在短时间内检测出微量的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，所需时间比PCR缩短3倍，敏感性是常规PCR检测的100倍以上，而且不需要昂贵的PCR仪，反应后通过离心(扩增的副产物焦磷酸镁沉在管底产生白色沉淀)即可判别阳性反应。
为实现上述目的本发明提供如下的技术方案：
1.本试剂盒所包含的组分及每次检测时各组分的使用量如下表1所示
表1.本试剂盒包含的组分及用量
说明：以上试剂运用无菌双蒸水配制，加完上述试剂后再加入2.5μl双蒸水使每个反应所包含LAMP反应试剂的终体积为24μl。
2.本LAMP试剂盒用于检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)配制如表1中所述的24μl LAMP反应液。
(2)取患猪接触传染性胸膜肺炎(感染猪传染性胸膜肺炎放线杆菌引起)病猪的鼻拭子于灭菌的反应管内，加入30μl灭菌的双蒸水，在95℃条件下作用10min使细菌破裂释放出其基因组，作用完成后立即将反应管置于冰上3min，使细菌基因组保持单链状态。再10000r/min离心3min，于3℃保存。
(3)提取步骤(2)中所得的样品上清1μl加入步骤(1)中24μl LAMP反应液中，使终反应体积为25μl，上下颠倒数次，使反应物均匀混合。再10000rpm瞬时离心0.5min，使反应液全部沉到管底。
(4)将步骤(3)中所得反应物于64℃恒温水浴锅中。反应60min。
(5)取出反应管4000rpm离心3min，通过观察管底是否有沉淀，或取5μl反应终产物于2％琼脂糖凝胶(含EB染料)中电泳20min后于紫外灯下观察电泳图像来判断阴阳性。判断标准：1)沉淀产生情况：若管底有沉淀产生则认为被检样品中存在猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，反之则相反(如图4)；2)电泳图像：若扩增出如图1所示梯状条带则认为反应为阳，即样品中存在猪传染性胸膜放线杆菌，反之则相反(如图1)。
本发明所拥有优点在于：
(1)操作简单，本发明所涉及的操作步骤不需要繁锁的操作过程，一般人通过短时间的培训即可熟练掌握；(2)不需要昂贵的专业设备，整个反应在恒温条件进行，这样就只需要一个恒温水浴锅即可；(3)特异性高，由于本扩增反应涉及靶基因上的六个特异性区域，故反应的特异相当高，不容易产生假阳性反应，参见图1；(4)敏感性高，本发明涉及的LAMP检测方法最低可检测到5个拷贝的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的基因组，其敏感性常规PCR的100倍以上，参见图2；(5)能检测绝大多数血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，在设计本发明所使的引物时参考了血清型1-14的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的dsbE-like基因，由于该基因的序列在所有血清型的猪传染性胸膜放线杆菌中几乎完全一样，理论上可以检测出1-14型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，经验证可检测出本实验室所拥有12种血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，参见图3；(6)反应耗时短，本反应高效快速，整个反应在小时内即可完。
本发明针对血清型1-14的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的高度保守基因序列(dsbE-like基因)建立了LAMP检测方法，该检测方法最低可检测到5个拷贝的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的基因组，其敏感性是常规PCR方法的100倍以上，且能检测出绝大多数血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。本发明在一定程度上提供了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的检测技术和理论依据。此外，基于LAMP所拥有的特异性及敏感性高，成本低廉，不需要专业的操作技能等诸多优点，对猪传染性胸膜肺炎入线杆菌的实时检测和出入境检疫提供了新的技术来源，极大地方便了对由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌引起的猪接触传染性胸膜肺炎病的监控和制定行之有效的防制措施，对防止我国猪接触传染性胸膜肺炎病的发生和提高该病的免疫防制水平具有重要意义。
附图说明
图1用于检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP方法的特异性，其中：M.DNAMarker；1-12.分别为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、波氏杆菌、链球菌、沙门氏菌、葡萄球菌、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒。
图2用于检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP方法的敏感性，其中：M.DNAMarker；1-7分别为包含105、104、103、102、10、5及3个拷贝的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的基因组。
图3本LAMP方法检测出的12种血清型的传染性胸膜肺炎放线杆菌，其中：M.DNAMarker；1-12分别为血清1型、血清2型、血清3型、血清5a型、血清6型、血清7型、血清8型、血清9型、血清10型、血清11型、血清12型、血清13型。
图4LAMP反应完成后通过离心后阳性与阴性结果的判断，若有沉淀(左图所示)则判定为阳性，若无沉淀(右图所示)则判定为阴性。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
1、特异性基因序列的查找
登陆美国国立生物技术中心(NCBI)，检索出编码血清型1-14的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的disulfide bound formation protein E(dsbE)蛋白基因序列(AF458418，AF458420，AF458421，AF458422，AF458423，AF458425，AF458426，AF458427，AF458428，AF458429，AF458430，AF458431，AF458432，AF458433)，再通过Blast、AlignX软件进行比对并找出在1-14血清都高度保守的区域。找出的特异性序列如下：TACCTTTATTATTGTTGATT GCACTGGTAG CGTTTTTAAC CGTGCCGTTA ATGAATAAGG ATGCCCTTTC GCTGACCGAAGATTGGCGAG ATAAACCTTT TCCGGAATTT GTCGGTAAAA ATTTACTCGA TCATAATGCG CATATTAATAATAACAGTTT GCCGAAAGAG CCTTATATTT TAAACGTGTG GGCAAGTTGG TGTACTTGGT GTATTAAAGA
2、LAMP引物的设计
登陆网页https://primerexplorer.jp/e/，通过专门的LAMP引物设计本发明所涉及的引物，引物序列如下：
3、病原基因组的提取
取患猪接触传染性胸膜肺炎(感染猪传染性胸膜肺炎放线杆菌引起)病猪的鼻拭子于灭菌的反应管内，加入30μl灭菌的双蒸水(其它细菌或病毒核酸用Trizon或RNeasy Mini Kit等商品试剂盒提取)，在95℃条件下作用5min使细菌破裂释放出其基因组，作用完成后立即将反应管置于冰上3min，使细菌基因组保持单链状态，再10000r/min离心3min，取上清1μl于24μl LAMP反应液中，1000rpm于瞬时离心，然后放于64℃恒温1小时进行反应。
4、结果判断
取出反应管，4000rpm离心3min，通过观察管底是否有沉淀，或取5μl反应终产物于2％琼脂糖凝胶(含EB染料)中电泳20min后于紫外灯下观察电泳图像来判断阴阳性。若反应管管底有沉淀产生则说明待样品中存在猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(如图4)，反之相反；若电泳跑出如图1所示梯状条带则认为反应为阳性，即样品中存在猪传染性胸膜放线杆菌，反之则相反。
5、确定合适的反应体系
为了找出本反应合适的反应条件，设置不同的反应温度：62℃、63℃、64℃、65℃，不同浓度的dNTP：0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mmol/L，不同浓度的MgSO4：2、4、6、8、10mmol/L，不同内部引物(F3，B3c)与外引物(FIP，BIP)浓度比例：1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12。通过比较找出最适当的反应体系，最终确定最佳的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP检测体系，其组分如下：
Bst DNA聚合酶8U；Bst DNA聚合酶缓冲液(20mmol/l Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/l KCl，10mmol/l(NH4)2SO4，，0.1％Triton X-100)；MgSO4 8mmol/l；甜菜碱lmmol/l；dNTP 1.4mmol/l；引物F3 0.2μmol/l；引物B3c 0.2μmol/l；引物FIP 1.6μmol/l；引物BIP1.6μmol/l。
通过分析在4种温度下进行的反应结果，表明最佳反应温度为64℃。
6、检测体系特异性、敏感性分析
特异性：为分析本检测反应可能出现的假阳性，以副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、波氏杆菌、链球菌、沙门氏菌、葡萄球菌、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒，11种在猪身上经常检测出的病原核酸为模板来分析本检测方法的特异性。结果如图1所示，表明本检测方法特异性良好，在以上11种病原中均未出现阳性反应。再提取本实验室保存的12种血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的基因组作为模板来分析本检测方法对各种血型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的检测能力，结果如图3所示，表明本检测方法能检测出12种血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。
敏感性：为分析本检测方法所能检测到的最低检测极限，将包含105、104、103、102、10、5及3个拷贝的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的基因组为模板进行LAMP反应。结果如图2所示，表明本LAMP检测方法能检测出5个拷贝的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组，此结果优于常规PCR100倍以上。
7、试剂盒的制备与组装(以50个反应为例)
本发明所述试剂盒仅由LAMP反应液构成，将配制好的LAMP反应液置-20℃或-80℃冷冻保存运输，尽量避免反复冻融。
(1)酶的配制：取浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶大片段48μl，浓度为0.1μmol/μl的DTT2μl，装置无核酸酶的塑料瓶中。
(2)缓冲液的配制：取浓度为1mol/l的Tris-HCl 25μl，浓度为0.5mol/l的(NH4)2SO4 25μl，浓度为0.5mol/l的KCl 25μl及浓度为2.5％的Triton X-100 50μl混合后，装于无核酸酶的塑料瓶中。
(3)引物的配制：取浓度为2.5μmol/l的F3100μl，取浓度为2.5μmol/l的B3c 100μl，取浓度为10μmol/l的FIP 200μl，取浓度为10μmol/l的BIP 200μl，装于无核酸酶的塑料瓶中。
(4)dNTP的配制：取浓度为17.5mmol/l的dNTP 100μl，装于无核酸酶的塑料瓶中。
(5)MgSO4的配制：取浓度为0.1mol/l的MgSO4 100μl，装于无核酸酶的塑料瓶中。
(6)甜菜碱的配制：取浓度为12.5mmol/l的甜菜碱100μl，装于无核酸酶的塑料瓶
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (1)
1.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP试剂盒，其特征在于，包含LAMP反应液：每个LAMP试剂盒中所包含的LAMP反应液的成分及其浓度、体积如下表所示，下表为50个反应的量：
所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)配制上述24μl LAMP反应液，运用无菌双蒸水配置，加完上述试剂后再加入2.5μl双蒸水，使每个反应所包含LAMP反应试剂的终体积为24μl；
(2)取患猪接触传染性胸膜肺炎病猪的鼻拭子于灭菌的反应管内，加入30μl灭菌的双蒸水，在95℃条件下作用5min使细菌破裂释放出其基因组，作用完成后立即将反应管置于冰上3min，使细菌基因组保持单链状态，再10000r/min离心3min，于3℃保存；
(3)提取(2)中所得的样品上清1μl加入(1)中24μl LAMP反应液中，使反应终体积为25μl，上下颠倒数次，使反应物均匀混合，再10000rpm瞬时离心0.5min，使反应液全部沉到管底；
(4)将(3)中所得反应物于64℃恒温水浴锅中，反应60min；
(5)取出反应管4000rpm离心3min，通过观察管底是否有沉淀，或取5μl反应终产物于2％琼脂糖凝胶中电泳20min后于紫外灯下观察电泳图像来判断阴阳性。
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