CN102154477A

CN102154477A - 用于检测猪肺炎支原体的lamp试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN102154477A
Application number: CN 201110033271
Authority: CN
Inventors: 刘茂军; 邵国青; 冯志新; 熊祺琰
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2031-01-31
Also published as: CN102154477B

Abstract

本发明属于卫生检验领域，涉及一种用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒及其建立的方法和应用。该试剂盒包含由四条LAMP引物的LAMP反应液构成的检测体系。经检测验证，本发明试剂盒具有良好的特异性、灵敏度，扩增快速、高效，且鉴定简便。本发明的检测体系在63℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏度地检测到猪肺炎支原体，不需要复杂仪器，能较好满足对猪肺炎支原体的现场检测，为兽医安全卫生的检测提供了新的技术平台，能较好的满足目前对猪场养殖现场检测的迫切需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

Description

用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属卫生检验领域，涉及一种用于检测猪肺炎支原体的试剂盒，特别涉及一种用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒及其建立方法和应用。

技术背景

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起猪气喘病(MPS)的病原。后者是猪群中流行最广、传播最快、最难净化的疫病之一。猪肺炎支原体通过呼吸道传播，感染呼吸道上皮后导致呼吸道纤毛萎缩、脱落、损坏，上皮细胞坏死，降低呼吸道黏膜的免疫功能，引起肺部功能损伤，容易产生其它呼吸道病原的继发感染。据报道，该病可使猪的饲料转化率降低10％，生长速度降低12％～15％，出栏时间延长1个月，与胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染时，情况更为严重，该病一旦爆发就难以控制，给养殖业造成巨大的经济损失。

目前对该病致病机理还不十分清楚。在检测方面，国内外已建立了多种血清学检测方法，如免疫琼扩和间接血凝等，但免疫琼扩和间接血凝法存在着灵敏度不高等问题。由于Mhp与非致病支原体之间存在着交叉反应，所以血清学检测方法的研发困难重重。

环介导等温扩增技术(LAMP)是由T.Notomi(2000)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。今年来，国外已将该技术广泛应用于病原体的检测。Masaki Imai等人(2007)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(2007)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以用于检测其他与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血症(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、造血组织坏死病毒(IHHNV)、番茄黄化曲叶病毒等。LAMP还可以用于对动物早期胚胎性别鉴定等。目前国内外均未见有用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒及在猪肺炎支原体检测中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述LAMP试剂盒的制备方法。

本发明的用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒包含如下成分：

(1)LAMP反应液：

每24μl LAMP反应液中含有：ddH₂O1.5μL；10×ThermoPol buffer 2.5μL；100mM MgSO₄1.5μl；5MBetaine2.0μL；2.5mM dNTP 12μL；0.2μM Primer F31μL；0.2μM Primer B31μL；1.6μM Primer FIP 0.5μL；1.6μMPrimerBIP0.5μL；8U/μLBst酶1.5μL；

(2)四条LAMP引物(排序序列1-4)：

Forward Outer F3 AGTATTATTGTTGCTAATCCTGT

Reverse Outer B3 GTTCACCCATCACGTAGG

Forward Inner FIP CACTACCGATAACTTTTTGATCGGATGATATAATTACAAGGGCTTACC

Reverse Inner BIP GAACTGTTTTAGATACAGCAAGGCTTGAACCGAATTAGGCGATAC

本发明的LAMP试剂盒的制备方法通过下述方法和步骤制备(参见附图4)：

1)从基因数据库检索获得猪肺炎支原体基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，获得P36序列的猪肺炎支原体的特异性的保守靶序列；

2)根据步骤1)所得的保守靶的DNA序列，设计序列1-4的LAMP引物；

3)根据所得的LAMP的引物配置LAMP反应液，构成检测体系。

表1 24μL LAMP反应液的具体配置。

本发明的进一步目的是提供所述试剂盒的应用方法。

上述的用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒检测猪肺炎支原体的方法为：首先配置LAMP反应液，然后提取待测样品中的核酸，取该核酸提取液加入上述已配制得的LAMP反应液中，置63℃恒温60min进行LAMP扩增，然后80℃2min进行酶的灭活；取出扩增反应管，根据反应产物的浑浊度初步判断结果：浊则说明待测样品中存在猪肺炎支原体，澄清透明则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体；取5μL LAMP产物进行1.5％琼脂糖电泳：梯状条带则说明待测样品中存在猪肺炎支原体，没有梯状条带则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体；剩余LAMP产物7000r/min离心5min：离心有沉淀则说明待测样品中存在猪肺炎支原体、没有沉淀则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体。

上述用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒的应用方法具体包括以下步骤：

(1)配置上述24μLLAMP反应液；

(2)提取待测样品的核酸；

(3)取1μL所述(2)核酸的提取液，加入步骤(1)配置的LAMP反应液中，使终反应体积为25μL，10000r/min瞬时离心30S以混匀反应液；

(4)置63℃恒温60min进行LAMP扩增，然后80℃2min进行酶的灭活；

(5)取出扩增反应管，根据反应产物的浑浊度初步判断结果：浊则说明待测样品中存在猪肺炎支原体，澄清透明则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体；

(6)取5μL LAMP产物进行1.5％琼脂糖电泳：离心有沉淀则说明待测样品中存在猪肺炎支原体、没有沉淀则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体；

(7)剩余LAMP产物7000r/min离心5min：梯状条带则说明待测样品中存在猪肺炎支原体，没有梯状条带则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体。

本发明以十一种与猪肺炎支原体类似病毒DNA为模板检测体系的特异性，结果显示，本发明方法只能扩增猪肺炎支原体核酸而不能检测到其他非目标细菌、病毒核酸，证实所建立的LAMP具有良好的特异性；以10^-1、10^-2……10^-9稀释度的猪肺炎支原体为模板进行LAMP试验，结果显示本LAMP可以检测到10^-5浓度核酸，敏感性为1.43pg/25μL，证实所建立的LAMP具有良好的灵敏度；用Mob I内切酶确定产物的特异性，结果显示，LAMP扩增产物在凝胶电泳图谱上呈阶梯状，经过内切酶消化，出现188bp电泳条带，与预期理论值相符合，说明是特异性扩增。

本发明具有下列突出的优点：

1)高特异性：4条引物对靶序列8个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中，找出相应的靶序列进行扩增(图1)。

2)高灵敏度：LAMP灵敏度可与PCR相媲美或更高，其所需扩增模板可达1.43pg/25μl或更少(图2)。

3)鉴定简便：扩增反应结束后，肉眼就可以根据反应产物的浑浊度初步判断结果：浊则说明待测样品中存在猪肺炎支原体，澄清透明则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体。

4)操作简单：一旦LAMP引物设计成功，只要将检测样品(靶核酸)和试剂一起放入63℃水浴锅1小时，然后放入80℃的水浴锅2分钟就可以判断扩增与否。

5)快速、高效扩增：整个扩增反应一小时即可完成，且产率可达到0.8mg/ml。

本发明的检测体系可以在等温条件下，快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度地检测到猪肺炎支原体，不需要复杂仪器，为兽医安全卫生的检测提供了新的技术平台，能较好的满足目前对猪场养殖现场检测的迫切需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明：

图1为猪肺炎支原体LAMP检测体系的特异性检测结果电泳图；

其中，M.DNA Marker；1泳道为猪肺炎支原体DNA；2泳道为阴性对照；3-13泳道分别为：副猪嗜血杆菌DNA、传染性胸膜肺炎DNA模板、猪链球菌DNA模板、多杀性巴氏杆菌DNA模板、鸡毒支原体DNA模板、猪鼻支原体DNA模板、絮状支原体DNA模板、蓝耳病毒DNA模板、圆环病毒DNA模板、猪瘟病毒DNA模板、伪狂犬病毒DNA模板。

图2为猪肺炎支原体LAMP检测体系的灵敏度验证电泳图；

其中，M.DNAMarker；1泳道为阴性对照；2泳道为猪肺炎支原体DNA；3-11泳道分别为以10^-1、10^-2……10^-9稀释度的猪肺炎支原体核酸。

图3为LAMP扩增特异性确认电泳图；

其中，泳道1：LAMP扩增产物在凝胶电泳图谱上成阶梯状；

泳道2：经内切酶消化，出现188bp电泳条带，与理论预期值相符合。

图4为本发明的LAMP试剂盒的建立方法及步骤的方框图。

具体实施方式

实施例1

1，特异性DNA序列查找

从美国基因数据库GenBank检索获得多株猪肺炎支原体基因租序列，通过BLAST软件进行同源性分析即找到特异性的保守靶序列进行LAMP引物设计。

2，LAMP引物设计

通过专门的LAMP引物设计软件设计引物

Primer design 4.0(http://primerexlorer.jp；Eiken Chemical Co.Ltd，Janpan)，

设计的具体引物为(排序序列1-4)：

3，建立检测体系

设置不同终浓度的镁离子(2mM，4mM，6mM，8mM)、nNTP(1.0mM，1.2mM，1.4mM，1.6mM)、内外引物浓度比例(1∶4，1∶6，1∶8，1∶10)，内外引物浓度(外引物0.1μM，内引物0.4μM；外引物0.2μM，内引物0.8μM；外引物0.4μM，内引物1.6μM；外引物0.8μM，内引物3.2μM)，不同Bst酶(4U，8U，12U，16U)，不同Betaine(0，0.2，0.4，0.6，0.7M)和温度(61℃，63℃，65℃)。

优化的检测体系(24μL)如下：

ddH₂O1.5μL；10×ThermoPol buffer 2.5μL；100mM MgSO₄1.5μl；5M Betaine2.0μL；2.5mM dNTP12μL；0.2μM Primer F31μL；0.2μM Primer B31μL；1.6μM Primer FIP 0.5μL；1.6μM Primer BIP 0.5μL；8U/μLBst酶1.5μL；检测反应条件为：63℃恒温1小时，80℃2分钟。

4，分析检测体系的灵敏性、特异性

以副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、鸡毒支原体、猪鼻支原体、絮状支原体、蓝耳病毒、圆环病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒十一种细菌、病毒核酸目标检测体系的特异性，结果显示，LAMP检测体系的特异性良好，可以在众多细菌、病毒中特异性的检测到猪肺炎支原体。

以10^-1、10^-2……10^-9稀释度的猪肺炎支原体为模板进行LAMP试验，结果显示本LAMP可以检测到10^-5浓度核酸，敏感性为1.43pg/25μL。

其检测程序为：

(1)按下述配比配制反应体系(24μL)

(2)LAMP扩增

用TIANGEN或其他商品化DNA提取试剂盒提取待测样品中的核酸。取lμL核酸提取液加到上述已配制好的LAMP反应液中，使终反应体积为25μL，10000r/min瞬时离心30秒以混匀反应液。然后放于63℃恒温1小时进行LAMP扩增，扩增结束后放至80℃2分钟。

(3)结果判断

取出扩增反应管，根据反应产物的浑浊度初步判断结果：浊则说明待测样品中存在猪肺炎支原体，澄清透明则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体；取5μL LAMP产物进行1.5％琼脂糖电泳：梯状条带则说明待测样品中存在猪肺炎支原体，没有梯状条带则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体；剩余LAMP产物7000r/min离心5min：离心有沉淀则说明待测样品中存在猪肺炎支原体、没有沉淀则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体。

为验证本发明效果的可靠性，进行以下鉴定：

1、LAMP扩增特异性确认

用Mob I内切酶判定产物结构，确定其为特异性扩增产物。经内切酶消化，出现188bp的电泳条带(泳道2)，与理论预期值相符合，说明是特异性扩增(图3)。

2、猪肺炎支原体LAMP检测体系的特异性

Claims

1.一种用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒，其特征包含如下组分：

(1)LAMP反应液：

每24μlLAMP反应液中含有：ddH₂O 1.5μL；10×ThermoPol buffer 2.5μL；100mM MgSO₄1.5μl；5M Betaine 2.0μL；2.5mM dNTP 12μL；0.2μM Primer F31μL；0.2μM Primer B31μL；1.6μM Primer FIP 0.5μL；1.6μM Primer BIP 0.5μL；8U/μL Bst酶1.5μL；

(2)排序序列1-4的LAMP引物：

Forward Outer F3 AGTATTATTGTTGCTAATCCTGT

Reverse Outer B3 GTTCACCCATCACGTAGG

Forward Inner FIP CACTACCGATAACTTTTTGATCGGATGATATAATTACAAGGGCTTACC

Reverse Inner BIP GAACTGTTTTAGATACAGCAAGGCTTGAACCGAATTAGGCGATAC

2.用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒的制备方法，其特征是包括下述步骤：

(1)从基因数据库检索获得猪肺炎支原体特异性P36基因序列，通过BLAST软件进行同源性分析，获得序列的保守靶部分；

(2)根据步骤(1)所得的保守靶的DNA序列，设计序列1-4的LAMP引物；

(3)根据所得的LAMP的引物配置LAMP反应液，构成检测体系。

3.按权利要求2所述的制备方法，其特征是所述的LAMP反应液是权利要求1所述的24μL LAMP反应液。

4.如权利要求1所述用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒的使用方法，其特征是包括以下步骤：

(1)配置上述24μLLAMP反应液；

(2)提取待测样品的核酸；

(4)置63℃恒温60min进行LAMP扩增，然后80℃2min进行酶的灭活；

(5)取出扩增反应管，根据反应产物的浑浊度初步判断结果；

(6)取5μLLAMP产物进行1.5％琼脂糖电泳；

(7)剩余LAMP产物7000r/min离心5min。

5.如权利要求4所述的使用方法，其中所述步骤(5)所述的结果判断为：浑浊则说明待测样品中存在猪肺炎支原体，澄清透明则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体；其中所述步骤(6)所述的结果判断为沉淀则说明待测样品中存在猪肺炎支原体、没有沉淀则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体；其中所述步骤(7)所述的结果判断为：梯状条带则说明待测样品中存在猪肺炎支原体，没有梯状条带则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体。