CN101153343A

CN101153343A - 特异检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的荧光定量pcr引物及方法

Info

Publication number: CN101153343A
Application number: CNA2007100501611A
Authority: CN
Inventors: 岳华; 汤承; 刘小银; 杨发龙; 张焕容
Original assignee: Southwest Minzu University
Current assignee: Southwest Minzu University
Priority date: 2007-09-30
Filing date: 2007-09-30
Publication date: 2008-04-02

Abstract

本发明涉及一种特异检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的荧光定量PCR引物及方法，采用序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物进行荧光定量PCR，只有强毒型和中毒型病毒株呈现阳性，而弱毒型病毒株为阴性。本发明根据不同毒力的鸡新城疫病毒F基因核苷酸序列组成的区别设计特异性引物，并与荧光定量PCR技术相结合，建立了快速、敏感、特异的新城疫病毒强毒型及中毒型病毒的检测方法。

Description

特异检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的荧光定量PCR引物及方法

技术领域

本发明属病毒鉴别领域，尤其是涉及一种特异检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的荧光定量PCR引物。

背景技术

新城疫病毒属于副粘病毒科，引起鸡的急性传染病，该病对养鸡业危害巨大。根据新城疫病毒的毒力差异可将其分为强毒型、中毒型、弱毒型3种类型，其中强毒型、中毒型新城疫病毒可引起鸡新城疫病症，因此，建立快速检测强、中毒力型新城疫病毒的方法就显得十分重要。聚合酶链式反应(PCR)技术是快速检测病毒的最有效的方法之一，但目前采用PCR技术检测鸡新城疫病毒时，所设计合成的引物为通用性的，对各种毒力的新城疫病毒都呈现阳性结果，不能区分强、中、弱毒型。此外，传统PCR技术在热循环反应结束后还需要进行电泳来进行结果判定，相对比较繁琐，且采用肉眼观察的方法其敏感度相对不是很高。

发明内容

鉴于区别强、中毒力型新城疫病毒在疫病防治方面的特定实际意义，本发明的目的是根据不同毒力新城疫病毒F基因核苷酸序列组成的不同，设计并合成了一对能专门检测强毒型及中毒型鸡新城疫病毒的引物，旨在用于特异检测强毒型及中毒型鸡新城疫病毒的荧光定量PCR技术中，并使之具有较好的使用便利性和良好的敏感性。

检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的特异引物的核苷酸链序列如下，分别为上游引物和下游引物：

SEQ ID NO：1 5′-GTGAATTCTTGATGGCAGGCCTCTTGC-3′

SEQ ID NO：2 5′-GCTTATTGCTACACTGCCG-3′

采用所示序列引物进行荧光定量PCR，只有强毒型和中毒型病毒株呈现阳性，而弱毒型病毒株为阴性。

PCR反应模板制备：从待测样本提取RNA并反转录合成cDNA作为模板。PCR反应：采用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的引物；PCR反应体系为25μl时，在PCR管中依次加入SYBR^Premix Ex Taq^TM 12.5μl，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列引物(浓度为10μM)各0.5μl，去离子水10.5μl，最后加入模板到25μl，混合后在荧光定量PCR仪上进行热循环，其条件为：95℃变性3min；然后进行共40个94℃30s，58℃30s，72℃40s的循环，反应结束后进行溶解曲线分析；在无模板对照和空白对照没有出现扩增曲线的条件下，凡出现扩增曲线且熔解温度为86±1.0℃的均为阳性结果，不出现扩增曲线的为阴性结果。

用24株已知病毒类型的样本进行检测，采用所述引物进行SYBRGreen I模式的荧光定量PCR，结果显示，本发明所设计的引物只对鸡新城疫病毒强毒型及中毒型病毒株有阳性扩增，而对该病毒弱毒株及其他非新城疫病毒来源的核酸没有扩增曲线，呈现阴性，最后结果如图1所示。

综上所述，本发明根据不同毒力新城疫病毒F基因核苷酸序列组成的不同，设计并合成了一对能专门检测强毒型及中毒型鸡新城疫病毒的引物，可以在鸡新城疫病毒的荧光定量PCR技术中提供对强毒型及中毒型病毒株的特异性检测。实施例2敏感性实验结果证明了引物和方法的良好敏感性。实施例3对两只疑似NDV强毒株感染的鸡只进行检测并经核苷酸测序验证实验，证实了本发明引物和方法明显的特异性。这样可以对引起鸡新城疫病症的强毒型和中毒型新城疫病毒进行有效辨识，有利于快速防治措施的施行。

附图说明

图1为采用本发明的引物及方法对已知病毒类型的样本进行SYBR Green I模式的荧光定量的PCR扩增曲线图，其中，扩增曲线高于基线者为阳性；而低于基线者为阴性。

图2为图1之判断结果列表。

图3为本发明与常规血凝试验定量检测敏感度比较结果列表。

图4为本发明实施例3荧光定量PCR的扩增曲线图。

具体实施方式

实施例1：引物的特异性试验

对本发明所涉及引物的特异性进行试验。SYBR^Premix ExTaq^TM试剂为日本TaKaRa公司产品；PCR反应体系及条件如上所述，使用定量PCR仪为美国Bio-Rad公司iCycler iQ^TM real-time PCRsystem。以下列各来源的cDNA或DNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，具体包括：F48E9(强毒型NDV)、SC01(强毒型NDV)、SD01(强毒型NDV)、SD02(强毒型NDV)、SD03(强毒型NDV)、SD04(强毒型NDV)、SD05(强毒型NDV)、SD06(强毒型NDV)、SP01(强毒型NDV)、SP02(强毒型NDV)、I系(中毒型NDV)、V4(无毒型NDV)、La Sota(弱毒型NDV)、B1(弱毒型NDV)、Clone30(弱毒型NDV)、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、禽白血病病毒、鸭瘟病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、健康鸭组织。同时设立无模板对照(NTC)和空白对照。

结果显示，本发明所设计的引物只对鸡新城疫病毒强毒型及中毒型病毒株有阳性扩增，而对该病毒弱毒型及其他非新城疫病毒来源的核酸没有扩增曲线，呈现阴性结果，扩增曲线如图1。判定结果如图2所示，其中“+”表示有扩增曲线，结合熔解温度辅助验证，判定为阳性；“-″表示没有扩增曲线，为阴性。

实施例2：敏感性实验

1.与常规PCR检测的敏感度比较：对同一模板进行10倍系列稀释，并分别采用常规PCR与荧光定量PCR进行检测，比较两种方法的灵敏度。结果，荧光定量PCR比常规PCR灵敏度要高10倍。

2.与血凝试验(HA)定量检测的敏感度比较：用荧光定量PCR与血凝试验对同一病毒样本的2倍系列稀释物进行定量检测。结果见图3。

实施例3：疑似强毒株实证与核苷酸测序验证实验

对临床上2只疑似NDV强毒株感染的鸡只进行剖杀，取肝脏进行RNA提取并反转录为cDNA，以此为模板，采用本发明所述特异性引物，通过上述荧光定量PCR方法进行检测，同时对其F基因进行克隆和测序。

结果，本发明所述特异引物对2个临床样本均呈现阳性结果，其扩增曲线分别如图4中的曲线1和2表示。对判定为阳性的该2个临床样本进行核苷酸测序验证实验，对其F基因的测序结果表明2毒株均具有强毒株的核苷酸和氨基酸序列。具体序列如下：

毒株1的F基因核苷酸序列(加粗下划线部分为强毒株特有序列)：

ATTCTTGATGGCAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGGATTGTGGTAAC

AGGAGATAAAGCAATCAATATATACACCTCATCTCAGACAGGGT

CAATCATAGTCAAGTTGCTCCCGAATATGCCCAAGGACAAAGA

GGCATGTGCAAAAGCCCCTCTAGAAGCATACAACAGAACACTG

ACCACTTTACTCACCCCCCTAGGTGATTCCATCCGCAGGATACA

AGGGTCTGTGTCCACATCAGGGGAAAAGAGGCAAAAACGGTT

TATAGGTGCCATTATCGGCAGTGTAGCAATAAGCAAT

毒株2的F基因核苷酸序列(加粗下划线部分为强毒株特有序列)：

GTGAATTCTTGATGGCAGGCCTCTTGCGCTGCAGGAATTGTAGT

AACTGGTGATAAGGCAGTCAATGTATACACCTCGTCTCAGACGG

GGTCAATCATAGTCAAGTTGCTCCCGAATATGCCCAGGGATAAG

GAGGCGTGTGCGAAAGCCCCATTGGAGGCATATACAGAACAC

TGACTACTTTGCTCACTCCTCTTGGCGACTCCATCCGCAAGATT

CAAGGGTCTGTGTCCACGTCTGGAGGAAGGAGACAAAAACGC

TTTATAGGTGCTGTTATGCTTATTGCTACACTGCCG

对以上两毒株F基因核苷酸片段所编码的氨基酸序列进行推导，由下划线所示的核苷酸序列所推导出的氨基酸序列分别为KRQKRF和RRQKRF，均为强毒株所特有序列。

序列表

1110>西南民族大学

<120>用于特异检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的荧光定量PCR

引物及方法

<160>2

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

GTGAATTCTTGATGGCAGGCCTCTTGC 27

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

GCTTATTGCTACACTGCCG 19

Claims

1.用于特异检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的荧光定量PCR引物，引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列。

2.荧光定量PCR特异检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的方法，其特征在于，所述方法是根据样品中核酸的PCR反应的扩增曲线结果提供强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的特异性指示；从待测样本中提取RNA并反转录合成cDNA作为模板；PCR反应中采用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的引物；PCR反应体系为25μl时包括：在PCR管中依次加入SYBR^Premix Ex Taq^TM 12.5μl，浓度为10μM的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2引物各0.5μl，去离子水10.5μl，最后加入模板到25μl，混合后在荧光定量PCR仪上进行热循环，其条件为：95℃预变性3min；然后进行共40个94℃30s，58℃30s，72℃40s的循环，反应结束后进行溶解曲线分析；在无模板对照和空白对照没有出现扩增曲线的条件下，凡出现扩增曲线且产物的熔解温度为86±1.0℃的均为阳性结果，不出现扩增曲线的为阴性结果。