CN105567872A - 一种快速检测小反刍兽疫病毒的rt-rpa检测试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测小反刍兽疫病毒的RT-RPA检测试剂盒及其用途。所述试剂盒包括有一对引物和一条探针，所述引物的序列如SEQ？ID？NO.1以及SEQ？ID？NO.2所示，所述探针的序列如SEQ？ID？NO.3所示。实验证明本发明的试剂盒能够特异性的检测小反刍兽疫病毒，并且在同等条件下对绵羊痘病毒、山羊痘病毒、羊口疮病毒以及口蹄疫病毒等其他重要的羊感染病毒没有扩增，说明该方法具有很好的特异性。灵敏度实验表明本发明所设计的用于检测小反刍兽疫病毒的RT-RPA引物和探针能够在40℃下，扩增20min的条件下最少可检出150个拷贝的模板，且与RT-qPCR具有很高的符合度。因此，本发明的试剂盒能够快捷、高效、灵敏的检测小反刍兽疫病毒，为小反刍兽疫病毒的鉴别诊断提供了有效技术手段。

Description

一种快速检测小反刍兽疫病毒的RT-RPA检测试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及一种检测小反刍兽疫病毒的试剂盒及其用途，特别涉及一种快速检测小反刍兽疫病毒的RT-RPA检测试剂盒及其用途，本发明属于预防兽医学检验领域。

背景技术

自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。但是该技术需要特殊昂贵的热循环仪器以及熟练的操作人员，费时费力，难以用在现场诊断以及实验条件差的地方。重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)自从2006年被英国TwistDxInc公司开发出来以来，就被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。以此为基础的核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。标准试剂盒的运行温度在37℃-42℃之间。进行实时监控的体系(如exo试剂盒)，需要能够激发和检测荧光团的恒温装置，比如酶标仪或实时检测的热循环仪。

自开发以来，该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业上，比如用于检测土拉弗朗西斯菌、细螺旋体、HIV-1DNA、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、天花病毒、B型链球菌、大肠杆菌产生的志贺毒素、中东呼吸综合征冠状病毒、裂谷热病毒、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、施马伦贝格病毒、牛病毒性腹泻病毒、黄热病毒以及戈登病毒等病原。与常规方法相比较，等温扩增实验具有很高的敏感性和特异性，这促使不同的公司商业化不同的等温扩增技术，比如，环介导的扩增(LAMP；Eiken,日本)，RPA(RPA；Alere,USAandTwistDx,UK)，链置换扩增(stranddisplacementamplification,BectonDickson,USA)。LAMP技术已经比较成熟，并且得到广泛使用，到目前为止，已经超过1000份关于LAMP在不同疾病诊断中应用的科研文章。与RPA相比较，LAMP技术具有试验设计比较麻烦(3对引物)，特异性相对较弱(能扩增很多条带)，时间仍然相对较长，以及易于污染等不足的地方。

小反刍兽疫(Pestedespetitsruminants，PPR)又名小反刍兽伪牛瘟，是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病，发病率和死亡率均非常高。OIE曾将该病列为法定必报的A类动物传染病，一旦发现必须采取紧急严厉的措施控制和扑灭。自从1940年首次确认该病的存在以来，该病随后在大多数非洲国家、中东地区以及印度、巴基斯坦以及中国等国均有报道，对我国养羊业构成了严重威胁。PPRV基因组全长为15,948个核苷酸，含有6个转录单位编码6个连续的非重叠的蛋白，这些蛋白以5`-L-HN-F-M–P/C/V-N-3`的顺序编排。基于N蛋白的不同，PPRV可以被分为四大类，这种分类方式能很好的反映PPRV存在的地域差异。N蛋白虽然不具有免疫保护作用，但是该蛋白是PPRV编码的所有蛋白中丰度最高以及最具有免疫原性的蛋白，这是N蛋白被广泛的应用到诊断方法的开发中的原因。

JingyueBao等(Developmentofone-stepreal-timeRT-PCRassayfordetectionandquantitationofpestedespetitsruminantsvirus.JournalofVirologicalMethods148(2008)232–236)建立了一种一步法实时荧光定量RT-PCR方法用于检测小反刍兽疫病毒，该方法能够检测并定量PPRV，特异性较强，在临床上得到了较为广泛的应用。但是该方法需要复杂的试验设备以及熟练的操作人员，且需要较长的实验时间(大约1.5h)。

LinLi等(Rapiddetectionofpestedespetitsruminantsvirusbyareversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationassay.JournalofVirologicalMethods170(2010)37–41)建立了一种用于检测小反刍兽疫病毒的RT-LAMP方法，该方法能够更加便捷和快速的检测PPRV。但是，通过RT-LAMP的扩增结果表明，该方法能够出现很多扩增条带，因此存在非特异性扩增，而且该方法需要设计三对引物来进行扩增，因此增加了实验设计的难度，并且增加了其与其他检测平台相结合的难度。并且检测温度较高(63℃)，检测时间较长(60min)，还需要通过核酸电泳对扩增产物进行检测，增加了污染的可能性。

针对现有技术中存在的问题，本发明中针对PPRV的N基因，研发并评估了基于荧光探针的实时荧光RT-RPA方法(PPRVreal-timeRT-RPA)，可用于快速检测PPRV。重组酶聚合酶技术(recombinasepolymeraseamplification，RPA)由于其具有快速、简便、无需特殊仪器等优点，目前已被应用于多种重要疾病病原的检测中。但是目前国内外尚无基于RPA诊断小反刍兽疫病毒的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能快速、简单、特异的鉴定小反刍兽疫病毒的检测方法及试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明发明人针对小反刍兽疫病毒N区域设计引物和探针。同时通过对来自于GenBank中的X74443,L39878,EU267274,EU267273,AJ849636,FJ905304,AY560591和AJ563705的N基因同源序列进行比对分析，以进一步确定小反刍兽疫病毒的保守区域，以期能够检测到尽可能多的小反刍兽疫病毒。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中国)合成。本发明分别设计合成了三对上游引物和三对下游引物，通过对引物与探针组合进行扩增效果评价，最终将其中一对能够产生最强的扩增信号的引物对与探针组合应用到本发明中。

特异性实验表明本发明方法能够特异性的检测小反刍兽疫病毒，并且在同等条件下对绵羊痘病毒、山羊痘病毒、羊口疮病毒以及口蹄疫病毒等其他重要的羊感染病毒没有扩增，说明该方法具有很好的特异性。灵敏度实验表明本发明所设计的用于检测小反刍兽疫病毒的RT-RPA引物和探针能够在40℃下，扩增20min的条件下最少可检出150个拷贝的模板。本发明不仅仅对该方法的敏感性和特异性进行了评估，并同时用临床样品对该试验结果进行评估，并与RT-qPCR相对应的结果进行比较，结果证明本发明方法与RT-qPCR具有很高的符合度。因此，本发明的鉴定小反刍兽疫病毒的检测方法能够快捷、高效、灵敏的检测小反刍兽疫病毒，为小反刍兽疫病毒的鉴别诊断提供了有效技术手段。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种用于快速检测小反刍兽疫病毒的RT-RPA检测试剂盒，其包括有一对引物和一条探针，

其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5’-CCAAGGCGGTTACGGCACCGGATACGGCAGCTGAC-3’(SEQIDNO.1所示)；

下游引物：5’-ACTGCGTCCAGCCACCCTTTGTCAAGGCGAAATTC-3’(SEQIDNO.2所示)；

探针：5’-GATACGGCAGCTGACTCAGAACTGAGAAGG

-(FAM-dT)-G-(THF)-G-(BHQ1-dT)-TAAATACACACAACA-P-3’(SEQIDNO.3所示)。

其中，BHQ1-dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，FAM-dT表示携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，P表示磷酸阻止链的延伸。

在本发明中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓冲液(rehydrationbuffer，TwistDxexoKit,Cambridge,UnitedKingdom)，醋酸镁以及ddH₂O。

在本发明中，优选的，所述试剂盒用于检测小反刍兽疫病毒时，反应体系如下：13.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.3μL的10μM探针，2μL的PPRVRNA模板，4.6μL的ddH₂O以及1.25μL的280mM醋酸镁；

扩增反应在温度设定为40-42℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min-1h，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。

进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测小反刍兽疫病毒试剂中的用途。

相较于现有技术，本发明的方法具有以下优点：

(1)能够节约试验时间：本发明的real-timeRT-RPA检测方法整个试验过程只需要20min，该时间远远低于RT-qPCR的1.5小时以及RT-LAMP的60min。加上样品处理以及准备试验的时间，real-timeRT-RPA整个检测过程能够在一个小时之内完成。

(2)能够降低反应温度：本发明的real-timeRT-RPA检测方法只需要恒温40℃即可完成试验，该温度远远低于RT-qPCR的60℃-95℃以及RT-LAMP的63℃。

(3)方法更加简单、便于携带：扩增所需的酶和一些其他必要的东西已经冻干保存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应即可，不需要熟练的试验人员。

(4)特异性高：因该试验中添加了探针，增加了该方法特异性，基于荧光试剂的RT-LAMP方法因为没有探针，特异性相对较差。

(5)更加不易于污染：该试验中添加了核酸外切酶III，对扩增产物进行切割，因此降低了产物污染的可能性，RT-qPCR没有添加切割产物的酶，RT-LAMP需要跑核酸电泳胶，因此，均有污染的可能性。

(6)检测结果真实可靠：与现有的RT-qPCR有很高的符合度，如图3所示。

附图说明

图1(A)为将合成的针对小反刍兽疫病毒引物和探针的标准品质粒体外转录RNA进行十倍倍比稀释，转录RNA浓度范围为1.5×10⁶-1.5×10¹拷贝，随后用PPRVreal-timeRT-RPA试验进行敏感性检测，如图所示为扩增20min后实时荧光定量PCR仪的结果。从此图可看出本发明所设计的引物和探针可以在40℃条件下，很好的检测1.5×10⁶-1.5×10²拷贝的模板。其中NC代表阴性对照。

图1(B)为利用PRISM5.0软件(GraphPadSoftware,USA)对PPRVreal-timeRT-RPA试验的可重复性进行验证。阈值为平均值±标准方差(SD)。该试验进行过4次重复性试验。

图1(C)为对PPRVreal-timeRT-RPA试验的四次重复性结果进行退行性分析。我们用三角符号标出95％可能性的检测限制。

图2为对PPRVreal-timeRT-RPA试验的特异性进行分析，如图所示，结果表明，该方法能特异性的扩增PPRV，而不能扩增绵羊痘病毒、山羊痘病毒、羊口疮病毒和口蹄疫病毒。

图3为比较PPRV阳性样品(n＝14)和PPRV混合组织样品(n＝24)的PPRVreal-timeRT-RPA和real-timePPRVRT-qPCR检测结果，用excel软件来进行退行性分析，其中Y轴为RT-RPA的时间阈值，X轴为RT-qPCR循环数阈值。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1快速检测小反刍兽疫病毒的real-timeRT-RPA检测试剂盒及检测方法的建立

1.序列的制备

针对小反刍兽疫病毒N区域设计引物和探针。同时我们比较了来自于GenBank的X74443,L39878,EU267274,EU267273,AJ849636,FJ905304,AY560591和AJ563705的N基因同源序列，以进一步确定小反刍兽疫病毒的保守区域，以期能够检测到尽可能多的小反刍兽疫病毒。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中国)合成。

2.毒株、细胞以及临床样品

本研究中使用的所有的毒株均由本实验室保存：PPRV/Nigeria75/1，ORFV/Vaccine/CHA，ORFV/Gansu/CHA，ORFV/HB/CHA，GPVAV40，SPVJingtai2011以及口蹄疫病毒(FMDVtypeA/CHA/2009；FMDV/O/CHA；FMDV/Asia1/CHA)。RT-qPCR确认的PPRV阳性样品(n＝14)以及PPRV阴性样品(n＝10)来自于本实验室保存的PPRV细胞毒样品以及动物试验羊PPRV阴性样品，PPRV混合组织样品(n＝24)是由羊的心、脾、肺、肾、淋巴结以及皮肤以1：10的比例制成组织悬液并混合PPRV阳性样品，临床疑似样品(n＝18)来自于甘肃省临洮，RT-qPCR确认的阴性样品(n＝5)来自于健康绵羊组织。

3.病毒基因组提取

使用高纯度的病毒核酸提取方法(Roche)按照说明书来提取病毒RNA，并最终用50μL的无RNase水洗脱。提取的RNA存放到-80℃冰箱中以待随后的使用。

4.产生RNA标准品

金维智合成PPRVN基因片段(354bp)，并克隆到pUC57载体，位于T7启动子的下游，命名为pPPRV/RPA。用质粒提取方法(Promega,USA)来提取pPPRV/RPA质粒。按照体外转录方法(kit,Ambion)体外转录操作手册来进行体外转录，用1μg线性化的质粒来进行体外转录。用DNase来处理转录后的RNA，并随后用(RNeasyMiniKIT,Qiagen)RNA清洁操作手册来进行操作。用Nanovue(GElifescience)来定量纯化的RNA,并随后储存于-80℃备用。

5.RT-RPA试验扩增条件优化

以提取纯化的病毒DNA/RNA或者标准RNA为模板进行扩增，反应体系如下：13.75μL水解缓冲液(rehydrationbuffer，TwistDxexoKit,Cambridge,UnitedKingdom)，1.05μL上游引物(10μM)，1.05μL下游引物(10μM)，0.3μL的RPAexo探针(10μM)，2μL的病毒DNA/RNA模板，4.6μL的ddH₂O以及1.25μL的醋酸镁(magnesiumacetate，280mM)。反应条件为40℃，反应可在20min之内完成。同时我们分别设计合成了三对上游引物(F1，F2，F3)和三对下游引物(R1，R2，R3)(表1所示)，并用该体系对引物与探针组合进行评价，评价结果表明其中一对(F2/R2)能够产生最强的扩增信号，因此，该引物对与探针进行组合应用到本发明中。

表1本发明设计的PPRVRT-RPA引物和探针

PPRVRT-RPAF和R：代表RPA引物；PPRVRT-RPAP：代表RPA探针

6.反应温度和时间的优化

在进行RT-RPA引物的反应温度的确定时，按照上述体系加入反应物。反应温度设定为40℃，41℃和42℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。通过对结果的分析表明，40℃，41℃和42℃对于试验结果几乎没有影响，所以本发明所设计的小反刍兽疫病毒RT-RPA扩增温度可以选择40℃，41℃和42℃中任意一个温度。本发明选用40℃进行一下试验。

在进行RT-RPA引物的反应时间的确定时，按照上述体系加入反应物。并将温度设定为40℃时，试验反应不同时间扩增差异。我们将时间分别设定为20min、30min和1h，结果表明，扩增20min之后的阴性在一个小时之后仍然为阴性，20min之后的阳性在一个小时之后仍然为阳性，因此，我们选择20min为本发明的扩增设定时间。

7.反应灵敏度检测

在进行RT-RPA引物的反应灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。使用模板为上述合成的标准质粒反转录的标准RNA，通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓度梯度为1.5×10⁶-1.5×10¹个拷贝共计6个梯度作为模板。反应温度设为40℃的qPCR仪中进行，时间设定为20min，通过实时荧光实时监控扩增结果。如图1A所示，该试验的敏感性为150拷贝/反应。并且具有较广的检测范围，至少在1.5×10⁶-1.5×10²范围内的样品均能被检测出来。

8.可重复性实验

在PPRVreal-timeRT-RPA敏感性试验中，对于同一个试验进行了四次重复，结果表明四次试验的检测结果一致，均能够很好的检测150个拷贝的标准RNA，本发明利用PRISM5.0软件(GraphPadSoftware,USA)对试验的可重复性进行统计分析，结果如图1B所示，表明该发明具有很好的可重复性。阈值为平均值±标准方差(SD)。同时，本发明利用Exle软件对PPRVreal-timeRT-RPA试验的四次重复性结果进行退行性分析，结果如图1C所示，该试验能够很好的检测PPRV。

9.反应特异性检测

在进行RT-RPA引物的反应特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。其中使用模板分别为小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒(SPV)、山羊痘病毒(GPV)、羊口疮病毒(ORFV)、口蹄疫病毒(FMDV)。反应温度设为40℃的qPCR仪中进行，反应时间设定为20min。结果表明，只有小反刍兽疫病毒能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，结果如表2及图2所示，表明该方法具有很好的特异性。

表2.评估PPRVRT-PRA试验的特异性

neg:代表阴性对照

实施例2PPRVreal-timeRT-RPA检测试剂盒在田间检测中的用途

1、样品

18份收集自疑似PPRV感染的羊样品，以及5份来自于健康羊的组织样品，病毒基因组提取同实施例1。

2、检测方法

(1)PPRVreal-timeRT-PRA方法

以提取纯化的病毒RNA为模板进行扩增，反应体系如下：13.75μL水解缓冲液(rehydrationbuffer，TwistDxexoKit,Cambridge,UnitedKingdom)，1.05μL上游引物(10μM)，1.05μL下游引物(10μM)，0.3μL的RPAexo探针(10μM)，2μL的病毒RNA模板，4.6μL的ddH₂O以及1.25μL的醋酸镁(magnesiumacetate，280mM)。引物和探针的序列如下所示：

上游引物：5’-CCAAGGCGGTTACGGCACCGGATACGGCAGCTGAC-3’(SEQIDNO.1所示)；

下游引物：5’-ACTGCGTCCAGCCACCCTTTGTCAAGGCGAAATTC-3’(SEQIDNO.2所示)；

探针：5’-GATACGGCAGCTGACTCAGAACTGAGAAGG

-(FAM-dT)-G-(THF)-G-(BHQ1-dT)-TAAATACACACAACA-P-3’(SEQIDNO.3所示)。

扩增反应在温度设定为40℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。

一个样品所有的重复试验，在特定的时间内(20min)扩增结果均大于背景值3.5个标准方差(3.5SD)的为阳性，反之，该样品为阴性。

(2)RT-qPCR方法

以提取纯化的病毒RNA为模板，参考文献(Developmentofone-stepreal-timeRT-PCRassayfordetectionandquantitationofpestedespetitsruminantsvirus.JingyueBaoet.alJournalofVirologicalMethods148(2008)232–236))方法进行检测。

3、结果

同时采用real-timeRT-PRA以及RT-qPCR方法对18份田间组织样品以及5份健康羊的组织样品进行了检测，结果如表3和图3所示。

表3.采用real-timeRT-PRA以及RT-qPCR方法对临床样品进行检测结果的比较

综上可见，本发明设计合成的一对引物和一条探针基因序列以及其形成的RT-RPA方法及检测方法可以快速鉴定小反刍兽疫病毒，而且该检测方法简单、快速、检测结果真实可靠。

Claims (4)

1.一种用于快速检测小反刍兽疫病毒的RT-RPA检测试剂盒，其特征在于包括有一对引物和一条探针，

其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5’-CCAAGGCGGTTACGGCACCGGATACGGCAGCTGAC-3’

下游引物：5’-ACTGCGTCCAGCCACCCTTTGTCAAGGCGAAATTC-3’

探针：5’-GATACGGCAGCTGACTCAGAACTGAGAAGG

-FAM-dT-G-THF-G-BHQ1-dT-TAAATACACACAACA-P-3’。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH₂O。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于用于检测小反刍兽疫病毒时，反应体系如下：13.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.3μL的10μM探针，2μL的PPRVRNA模板，4.6μL的ddH₂O以及1.25μL的280mM醋酸镁；

扩增反应在温度设定为40-42℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min-1h，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。

4.权利要求1-3任一项所述的试剂盒在制备检测小反刍兽疫病毒试剂中的用途。