CN104372110A - 一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒 - Google Patents
一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测小反刍兽疫病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，包含扩增预混液、阴性对照、阳性对照以及序列SEQIDNO.1至SEQIDNO.2的扩增引物及SEQIDNO.3的探针引物的混合物。本发明的有益效果在于：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，用来检测小反刍兽疫病毒的试剂盒，使得该试剂盒特异性高、稳定性好、操作简便；并且比普通PCR的灵敏度高，能够用于检测低微含量样品的小反刍兽疫病毒；不仅适用于科研单位定量分析，而且适合于各级防控单位，基层兽医站，大中型养殖场等的病原检测分析，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及小反刍兽疫防治技术领域，具体说是一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR（探针法实时-定量聚合酶链反应）试剂盒，本发明还包括该试剂盒的使用方法。
背景技术
小反刍兽疫（Peste des petits Ruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种严重的传染病，主要感染小反刍动物，特别是山羊高度易感。该病毒是副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbolivirus)的成员，同属的其他成员还有牛瘟病毒(Rinderpest virus,
RPV)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)、海豹瘟病毒(Porpoise distemper virus，PDV)等。PPRV主要侵害淋巴组织及消化道上皮组织，以突然发热、眼鼻排出分泌物、口腔溃疡、呼吸失调、咳嗽、恶臭的腹泻和死亡为特征。本病1942年首次报告发生于西非之象牙海岸，1972年正式确认病原为反刍兽疫，PPRV有4个群，但只有1个血清型。目前已确认发生的国家有象牙海岸、贝宁、多哥、尼日利亚、塞内加尔、加纳、马里、尼日尔、冈比亚、毛里塔尼亚、乍得、苏丹、沙特阿拉伯、阿曼、约旦、以色列、印度、孟加拉国。近几年该病在我国的周边国家频频发生，特别是2007年首次在我国西藏发现该病后，2003年年底至今， PPR在我国新疆、内蒙、甘肃、安徽等地流行非常严重，现已严重威胁到我国小反刍动物的健康。本病流行猖撅，发病率和死亡率均很高，对山羊生产和畜牧经济造成严重损失。被世界动物卫生组织（OIE）[《国际动物卫生法典》(1999)]动物卫生法典列为必须报告的动物疫病，我国《法定动物疫病病种名录》中将其列为I类动物疫病。小反刍兽疫严重破坏畜牧业生产，造成了动物及其产品的国际贸易障碍，所带来的巨大经济损失不可估量。快速准确的诊断是控制和扑灭小反刍兽疫至关重要的一个环节。
常规的病原学诊断方法主要有病毒的分离与鉴定、病毒抗原检测等，每种诊断方法都有其适用的范围。用常规病原学方法对血液、淋巴结、脾脏等病毒含量低微的样品进行检测，往往得不到正确的结果。分子诊断方法是一种敏感的新技术，RT-PCR技术已广泛应用于生命科学的各个领域，它具有敏感、特异和操作快速简便等特点，能使原本诊断十分困难的某些传染病和遗传病在分子水平上得到确诊。近年来，该方法在PPRV的研究与诊断上已得到了应用，但在检测PPRV隐性感染和肉品检疫等方面仍有不足之处。Real-Time RT-PCR是在常规RT-PCR方法的基础上，除了常规PCR的扩增以外，还额外增加了一条探针引物，只有在探针引物的有效结合下，才能产生有效扩增，因此检测的特异性和敏感性大大提高。不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
本发明针对目前的现状，在长期研究的基础上，建立并优化出一种简捷、廉价、敏感的Real-Time RT-PCR PPRV检测方法，并组装成试剂盒。该方法无需体外单独进行反转录，在同一反应管内就可完成反转录和PCR的过程，通过荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，结果更为准确直观，且无需电泳观察结果。大大缩短了时间和减少了污染的机率，保证了我国对PPRV的诊断与国外检测方法的一致性。该方法具有以下特点：特异性好：与牛瘟、口蹄疫、羊痘、羊口疮等无交叉反应，假阳性率低于2%；敏感性高：可检测到100个拷贝数的病毒；稳定性强：在12个月内检测数据稳定可靠；该方法与国外同类产品相比符合率大于90%。该方法应用的可行性强，对我国小反刍尤其羊免受PPR的威胁，提高农村养羊户收入，促进国际贸易增长等均具有极其重要的现实意义和社会意义。已成为病原体检测的重要方法。
本发明通过反复试验以及引物浓度和探针浓度的优化，（1）制作标准曲线的相关系数R2大于0.98；斜率位于-3～-3.5之间；PCR扩增效率E位于0.9～1.2之间，符合线性关系、扩增效率要求；（2）35Cycles内可得到好的定量结果，符合灵敏度要求；（3）阴性对照35 Cycles内无引物二聚体产生，符合阴性要求。因此，该方法以其快速、灵敏、特异、定性、定量、低污染率等特点优于普通PCR方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术不能适应快速、敏感和准确及定量的检测需求，从而提供一种能够快速、敏感、准确以及定量地检测病毒的一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用方法。
为解决上述问题，本发明所述一种用于检测PPRV的Taqman Real-time RT- PCR试剂盒，所述试剂盒包含扩增预混液、阴性对照、阳性对照、序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2的扩增引物和序列SEQ ID NO.3的探针引物的混合物。
所述扩增引物序列SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.2为：
SEQ ID NO.1：上游引物TTAATTGATTGGGCTGATGGTCT，
SEQ ID NO.2：下游引物GCTGCCGGCAATGATGTCTC。
所述探针引物序列为：
SEQ ID NO.3：GTTCTTGACATCGGGTATTTCCGGGAC。
所述扩增引物扩增出的条带序列为：
SEQ ID NO.4（176 bp）：
TTAATTGATTGGGCTGATGGTCTAGAGTTCTTGACATCGGGTATTTCCGGGACCCGCAAGATTTTCCCGCCTTGGAATCTTCCTCCTTTACTCTTCTGGGAGTTAAGAACTTCTTGAATGTCATCACCTTCTAATTTTTCGACTTCTGTTGACCTAGAGACATCATTGCCGGCAGC。
所述阴性对照为无RNA酶水。
所述阳性对照为含有PPRV基因序列的阳性质粒pGM-176以及制作的标准曲线；其构建方式如下：
a. PPRV基因组RNA（核糖核酸）的提取按QIAGEN RNeasy Mini Kit（凯杰公司核糖核酸提取试剂盒）说明书进行操作。以提取的病毒RNA为模版进行反转录合成cDNA（互补脱氧核糖核酸）。以SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2作为引物扩增，反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50s, 54℃退火50s, 72℃延伸1min, 共30个循环；72℃再延伸10min，4℃ 5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
b. PCR产物的克隆及序列分析
PCR产物用AXYGEN（爱思进）公司的胶回收试剂盒回收，与pGMD-T-Easy克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12～16h。经蓝白斑筛选后，用AXYGEN质粒提取试剂盒提取质粒，将序列测定为阳性的质粒命名pGM-176。
其标准曲线制作如下：
a. 对pGM-176阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其为：10-1～10-15，每个梯度重复三次进行定量PCR。
b. 根据扩增情况从中选取5～6个点制作适合标准曲线要求的标准曲线。如图1所示。
本发明还提供了所述用于检测PPRV的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
a.使用权利要求1所述的检测试剂盒进行PCR扩增，条件如下：94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度54℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。
b. 结果分析
根据扩增结果判定：在NTC（阴性对照）没有Ct（循环数）值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
本发明应用分子生物学技术研制和开发出了特异性高、敏感性强、能准确定量和计算待检样品拷贝数及价格便宜的PPRV Taqman Real-time RT-PCR试剂盒,一方面可以弥补我国对于PPRV检测的薄弱环节，同时有利于剔除阴性带毒动物。本发明使用了探针法，只有当探针引物特异的结合到扩增的靶序列上时才会产生有效的结果，而且闭管操作的实时检测可以有效防止反应产物的污染，使该方法与普通PCR方法相比具有更高的准确性，有助于PPRV的防控和隐性带毒动物的剔除，避免造成大范围的传染。本发明适用于待测羊的气管、肠、全血、淋巴结、肉品及血清等低微含量样品，所述方法适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的其中一个实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 为本发明制作标准曲线
图2为本发明样本检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中一个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、引物的设计和制备：
参照GenBank（基因库）查找十株毒株，经序列比对寻找每个序列上均保守的区域，选取保守区域并设计一对扩增引物，一条探针引物，序列如下：
扩增引物序列为：
SEQ ID NO.1：上游引物TTAATTGATTGGGCTGATGGTCT，
SEQ ID NO.2：下游引物GCTGCCGGCAATGATGTCTC。
探针引物序列为：
SEQ ID NO.3：GTTCTTGACATCGGGTATTTCCGGGAC。
上述引物由大连宝生物工程有限公司合成并进行标记。
阳性对照：本发明试剂盒的阳性对照及其标准曲线是由中国农业科学院兰州兽医研究所构建并保存。
2、制备试剂盒：
本试剂盒由以下组分组成：
a. 2×One Step RT-PCR bufferIII：12.5μL；
b. Ex Taq HS：0.5μL；
c. PrimerScript RT Enzyme Mix II: 0.5μL；
d.引物浓度均为10pmol/μl的三条引物混合液3μl，其中176 bp上游引物1μl，176bp下游引物1μl，探针引物1μl；
e. 无RNA酶水5.5μL；
f. 阳性对照pMD-176阳性质粒3μl；
g. 阴性对照无RNA酶水3μl。
3、用本发明试剂盒检测PPRV的使用方法：
（1）PCR总体系为25 μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×One Step RT-PCR bufferIII：12.5μL；b. Ex Taq HS：0.5μL；c. PrimerScript RT Enzyme Mix II: 0.5μL；d.三条引物共3 μl；f.无RNA酶水5.5μl，加入到0.2 ml扩增管中；
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3μl、从待检羊气管中提取的RNA模板3μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5～30s，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度54℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
4、结果分析：
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
实施例2
步骤1～2 同实施例1；
3、用本发明试剂盒检测PPRV的使用方法：
（1）PCR总体系为25μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×One Step RT-PCR bufferIII：12.5μL；b. Ex Taq HS：0.5μL；c. PrimerScript RT Enzyme Mix II: 0.5μL；d.三条引物共3 μl；f.无RNA酶水5.5μl，加入到0.2 ml扩增管中；
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3μl、从待检羊肠道中提取的RNA模板3μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5～30s，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度54℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
4、结果分析：
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
实施例3
步骤1～2 同实施例1；
3、用本发明试剂盒检测PRV的使用方法：
（1）PCR总体系为25 μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×One Step RT-PCR bufferIII：12.5μL；b. Ex Taq HS：0.5μL；c. PrimerScript RT Enzyme Mix II: 0.5μL；d.三条引物共3 μl；f.无RNA酶水5.5μl，加入到0.2 ml扩增管中；
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3μl、从待检羊淋巴结中提取的RNA模板3μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5～30s，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度54℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
4、结果分析：
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
实施例4
步骤1～2 同实施例1；
3、用本发明试剂盒检测PPRV的使用方法：
（1）PCR总体系为25μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×One Step RT-PCR bufferIII：12.5μL；b. Ex Taq HS：0.5μL；c. PrimerScript RT Enzyme Mix II: 0.5μL；d.三条引物共3μl；f.无RNA酶水5.5μl，加入到0.2 ml扩增管中；
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3μl、从待检羊血液中提取的RNA模板3μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5～30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增: 94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度54℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
4、结果分析：
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
Organization Applicant
----------------------
Street : 兰州市城关区盐场堡徐家坪1号
City : 兰州
State : 甘肃
Country : 中国
PostalCode : 730046
PhoneNumber : 0931-8343385
FaxNumber : 0931-8340977
EmailAddress : hnxiangtaohotmail.com；jingningcaixiong163.com
<110> OrganizationName : 中国农业科学院兰州兽医研究所
Application Project
-------------------
<120> Title : 一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒
<130> AppFileReference : Detection of porcine parvovirus using a taqman-based real-time pcr with primers and probe designed for the NS1 gene
<140> CurrentAppNumber :
<141> CurrentFilingDate : ____-__-__
Sequence
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<213> OrganismName : Sus scrofa
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ttaattgatt gggctgatgg tct 23
<212> Type : DNA
<211> Length : 23
SequenceName : SEQ ID NO.1
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Sequence
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<213> OrganismName : Sus scrofa
<400> PreSequenceString :
gctgccggca atgatgtctc 20
<212> Type : DNA
<211> Length : 20
SequenceName : SEQ ID NO.2
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Sequence
--------
<213> OrganismName : Sus scrofa
<400> PreSequenceString :
gttcttgaca tcgggtattt ccgggac 27
<212> Type : DNA
<211> Length : 27
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Sequence
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<213> OrganismName : Sus scrofa
<400> PreSequenceString :
ttaattgatt gggctgatgg tctagagttc ttgacatcgg gtatttccgg gacccgcaag 60
attttcccgc cttggaatct tcctccttta ctcttctggg agttaagaac ttcttgaatg 120
tcatcacctt ctaatttttc gacttctgtt gacctagaga catcattgcc ggcagc 176
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<211> Length : 176
SequenceName : SEQ ID NO.4
SequenceDescription :
Claims (8)
1.一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，包含扩增预混液、阴性对照，其特征在于：还包含有阳性对照、序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2的扩增引物和序列SEQ ID NO.3的探针引物的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述序列SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.2为：
SEQ ID NO.1：上游引物TTAATTGATTGGGCTGATGGTCT，
SEQ ID NO.2：下游引物GCTGCCGGCAATGATGTCTC。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT- PCR试剂盒，其特征在于：所述探针引物序列为：
SEQ ID NO.3：GTTCTTGACATCGGGTATTTCCGGGAC。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述序列SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.2的扩增引物和序列SEQ ID NO.3的探针引物浓度均为10pmol/μL，扩增引物及探针引物配比为1:1:1。
5.根据权利要求1或2所述的一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT- PCR试剂盒，其特征在于：所述扩增引物扩增出的条带序列为：
序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2的由5’端向3’端延长的序列；
SEQ ID NO.4（176 bp）：
TTAATTGATTGGGCTGATGGTCTAGAGTTCTTGACATCGGGTATTTCCGGGACCCGCAAGATTTTCCCGCCTTGGAATCTTCCTCCTTTACTCTTCTGGGAGTTAAGAACTTCTTGAATGTCATCACCTTCTAATTTTTCGACTTCTGTTGACCTAGAGACATCATTGCCGGCAGC。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为构建的pGM-176阳性质粒以及利用其制作的标准曲线，该质粒是扩增引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所扩增的小反刍兽疫病毒基因序列，长度176bp，克隆至pGEM-T Easy克隆载体，筛选为阳性的命名为pGM-176。
7.根据权利要求1所述的一种用于小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒组分的配比为：
a. 2×One Step RT-PCR buffer III：25份；
b. Ex Taq HS：1份；
c. PrimerScript RT Enzyme Mix II：1份；
d.引物浓度均为10pmol/μl的三条引物混合液6份，176bp上游引物2份，176bp下游引物2份，探针引物2份；
e. 无RNA酶水11份；
f. 阳性对照pMD-176阳性质粒6份；
g. 阴性对照无RNA酶水6份。
8.一种如权利要求1所述用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
a．使用权利要求1所述的检测试剂盒进行PCR扩增，条件如下： 94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度54℃ 30s，72℃ 20s，40个循环；
b. 结果分析；
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测；再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
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- 2014-12-09 CN CN201410745664.0A patent/CN104372110B/zh active Active
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| CN104372110B (zh) | 2016-03-16 |
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