CN110257557A - 一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组 - Google Patents

一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术技术领域，特别涉及一种TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的多重RT‑PCR检测引物组。所述的TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的多重RT‑PCR检测引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示，本发明还提供了一种包含上述引物组的试剂盒，该引物组和试剂盒采用一次性PCR反应，可快速区分鉴定TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV，特异性好，灵敏度高，重复性与稳定性好，适用于TGEV、PEDV、SADS‑CoV和PDCoV的鉴别诊断，该多重PCR试剂盒非常适用于疫病病原确诊、病原净化检测和流行病学调查，例如：实验室、出入境现场、养殖场等。

Description

一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，特别涉及一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组。
背景技术
猪腹泻性疾病是造成散养或规模化猪场经济损失的一个主要因素，特别是导致哺乳仔猪死亡和发育不良的重要原因。猪腹泻性疾病自发生起一直是困扰着全世界养殖业的难题之一。近年来，随着饲养方式向更加规模化和集约化饲养方式的转变，猪腹泻病的病因也变得越来越复杂。在所有引起猪群腹泻的因素中，病毒性腹泻是最主要且最严重的因素，病毒性腹泻病原对仔猪的危害最大。仔猪病毒性腹泻相关的病原主要以冠状病毒为主，主要包括TGEV、PEDV、PDCoV和SADS-CoV。由于这这些病原在临床症状上的相似性，而且都属于冠状病毒，因此难以从感染猪的临床特征和病原的形态上加以区分。
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)是两种传统的腹泻病原体。PEDV和TGEV同为不分节段的单股正链RNA病毒，且两者均属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α-冠状病毒属(Coronavirus)。PEDV和TGEV均可引起发病猪只的严重腹泻性疾病，临床症状主要以急性和严重水样腹泻，呕吐和脱水为主要特征，但PEDV对断奶前(3～4周龄)仔猪的影响明显大于TGEV。此外，在养殖条件较差的情况下，PEDV和TGEV通常呈现混合感染的趋势，存在协同致病的可能。猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)不仅在中国、韩国、日本、泰国和越南等亚洲国家被广泛报道，甚至在德国、美国等欧美国家也出现流行。PEDV和TGEV俨然已经成为影响全球养猪产业的重要病原体。
猪德尔塔冠状病毒(又名猪丁型冠状病毒，Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)和猪急性腹泻综合症冠状病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus，SADS-CoV)是近年来新发现的两种冠状病毒。PDCoV和SADS-CoV的基因组同为单股正链不分节段的RNA。PDCoV属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、δ-冠状病毒属(Coronavirus)；SADS-CoV属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α-冠状病毒属(Coronavirus)。PDCoV和SADS-CoV所引起的的临床症状类似于其他已知的猪肠道冠状病毒引起的临诊症状，包括严重且急性的呕吐和腹泻，新生仔猪体重迅速减轻导致急性死亡。PDCoV于2012年首次在香港被报道，2014年2月美国在腹泻仔猪和母猪的粪便中首次检测到PDCoV，随后该病毒在加拿大、韩国、印度、泰国和中国等国家被发现，在全球呈蔓延趋势。SADS-CoV于2018年首次在中国广东被报道，己造成中国四个农场共24693头小猪死亡，同时在广东其他地区的蝙蝠体内也检测到病毒的存在。
由于TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV同属于冠状病毒，且感染猪只后可引起相似的临床症状，而疫病病原的确定是疫病防控的关键一步，因此快速且灵敏地实施对于这四种腹泻病原的鉴别诊断尤为重要。现有的对于TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV鉴别诊断方法种类很多。血清学技术检测中的ELISA方法被广泛应用于病原的检测与鉴别，该方法的优点是特异性好，灵敏度高，缺点是影响因素多，成本较高。另外，间接免疫荧光和免疫组织化学也被应用于病原的鉴别诊断，这两种方法的检测原理相似，具有很高的特异性和敏感性，但这两种方法对于仪器设备和检测人员的要求很高。以聚合酶链式反应(reversetranscription PCR)为基础的核酸分子生物学检测方法具有检测快速，操作简便，特异性强，敏感性高，重复性好等优点，现已经广泛应用到畜禽疫病病原的快速鉴别诊断。多重PCR方法是基于普通PCR方法开发出来的一种更加高效的病原鉴定方法，多重PCR方法是利用一次PCR反应，可以同时检测、鉴别出多种病原体，多重PCR是以方便实用、敏感性高和特异性强为主要的优点，所以更加适用于疫病混合感染的快速诊断。
发明内容
为了克服现有技术中检测TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV成熟技术方案的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组，该引物组能快速、准确、高效地一次性检测鉴定TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV四种病原，特异性好，灵敏度高。
本发明的另一目的在于提供一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述引物组，可高效、准确地检测鉴定TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV，对于该类病原感染的早期疫情诊断、防控和流行病学调查具有重要意义。
本发明的再一目的在于提供上述引物组和试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组，包含引物TGEV-F、TGEV-R、PEDV-F、PEDV-R、SADS-F、SADS-R、PDCoV-F和PDCoV-R，其核苷酸序列如下所示：
引物TGEV-F：5′-GTATGAAGCGTAGTGGTTATGGTC-3′；
引物TGEV-R：5′-AATAGGTTATGACAGGTTCACAATC-3′；
引物PEDV-F：5′-TTTCACATGGAATATCATACTGACG-3′；
引物PEDV-R：5′-ATGAAGCACTTTCTCACTATCTGT-3′；
引物SADS-F：5′-TCCTGAGGAAGAGGTTGAGATGGT-3′；
引物SADS-R：5′-CGTGCTTACCATTGTGTATGAGAC-3′；
引物PDCoV-F：5′-AGACACTGAGAAGACGGGTATGG-3′；
引物PDCoV–R：5′-CTTCTTGTCCTTAGTTGGTTTGGT-3′；
所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组在检测TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV领域中的应用；
所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组在检测TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV中的应用，不包含疾病的诊断目的；
一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒包含上述TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组；
所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒还包含RNase FreeddH2O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer(Mg2++plus)、Random primer、RNaseinhibitor、M-MLV、5×M-MLV Buffer；
所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒进一步优选包含RNase Free ddH2O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer(Mg2++plus)、Randomprimer、RNase inhibitor、M-MLV、5×M-MLV Buffer；浓度为10μmol/L的TGEV-F、浓度为10μmol/L的TGEV-R、浓度为10μmol/L的PEDV-F、浓度为10μmol/L的PEDV-R、浓度为10μmol/L的SADS-F、浓度为10μmol/L的SADS-R、浓度为10μmol/L的PDCoV-F、浓度为10μmol/L的PDCoV-R；
所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒在检测TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV中的应用；
所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒在检测TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV中的应用，优选包含如下步骤：
(1)以待测样品RNA为模板，以Random primer为扩增引物，配制反转录反应体系，进行样品RNA的反转录反应，得到cDNA；
(2)以步骤(1)制得的反转录反应产物cDNA为模板，以混合引物TGEV-F、TGEV-R、PEDV-F、PEDV-R、SADS-F、SADS-R、PDCoV-F、PDCoV-R为扩增引物，配制多重PCR反应体系，进行多重PCR反应；
(3)将步骤(2)制得的多重PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；结果判定方法为：在801bp处出现目的条带的判定为TGEV阳性扩增，616bp处出现目的条带的判定为PEDV阳性扩增，368bp处出现目的条带的判定为SADS-CoV阳性扩增，250bp处出现目的条带的判定为PDCoV阳性扩增，在801bp处未出现目的条带的判定为TGEV阴性扩增，616bp处未出现目的条带的判定为PEDV阴性扩增，368bp处未出现目的条带的判定为SADS-CoV阴性扩增，250bp处未出现目的条带的判定为PDCoV阴性扩增；
步骤(1)中所述的反转录反应的反应体系优选为：
步骤(1)中所述的反转录反应的反应参数如下所示：
42℃反应60min；72℃终止反应1min；
步骤(2)中所述的多重PCR反应的反应体系优选为：
步骤(2)中所述的多重PCR反应的参数如下所示：
95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；
所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒在检测TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV领域中的应用，不包含疾病的诊断目的；
需要指出的是，本发明的检测用于对离体样品的检测，检测的直接结果是病毒的量值，而并非诊断结果，本发明直接目的不是诊断，本发明的引物组、试剂盒的应用以及方法均不属于诊断方法。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的快速区分TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重PCR引物组特异性好，灵敏度高，重复性与稳定性好，适用于TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的鉴别诊断。
(2)本发明提供的快速区分TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重PCR引物组和试剂盒采用一次性PCR反应，该反应机制可高效、快速、特异地实施针对四种病原体的鉴别诊断。
(3)本发明提供的快速区分TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重PCR试剂盒扩增效率高且特异性强。
(4)本发明提供的快速区分TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重PCR试剂盒非常适用于疫病病原确诊、病原净化检测和流行病学调查，例如：实验室、出入境现场、养殖场等。
附图说明
图1是TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的单重RT-PCR反应结果图；其中，泳道M为DNAMarker DL1000，泳道1～4分别代表TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的PCR结果，泳道5～8分别代表TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的阴性对照。
图2是菌液PCR反应产物电泳结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1～8分别代表TGEV菌液PCR、TGEV菌液PCR阴性对照、PEDV菌液PCR、PEDV菌液PCR阴性对照、SADS-CoV菌液PCR、SADS-CoV菌液PCR阴性对照、PDCoV菌液PCR、PDCoV菌液PCR阴性对照。
图3是TGEV的单重RT-PCR最佳退火温度优化电泳结果图；其中，泳道M为DNAMarker DL1000，泳道1～7分别代表53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃共7个温度梯度，泳道8为阴性对照。
图4是PEDV的单重RT-PCR最佳退火温度优化电泳结果图；其中，泳道M为DNAMarker DL1000，泳道1～7分别代表53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃共7个温度梯度，泳道8为阴性对照。
图5是SADS-CoV的单重RT-PCR最佳退火温度优化电泳结果图；其中，泳道M为DNAMarker DL1000，泳道1～7分别代表53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃共7个温度梯度，泳道8为阴性对照。
图6是PDCoV的单重RT-PCR最佳退火温度优化电泳结果图；其中，泳道M为DNAMarker DL1000，泳道1～7分别代表53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃共7个温度梯度，泳道8为阴性对照。
图7是TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV多重RT-PCR退火温度优化电泳结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1～7分别代表53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃共7个温度梯度，泳道8～11分别为TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的阳性对照，泳道12为阴性对照。
图8是TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV多重RT-PCR最佳TaKaRa Taq浓度优化电泳结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1～7分别代表0.02U/μL、0.04U/μL、0.06U/μL、0.08U/μL、0.1U/μL、0.12U/μL、0.16U/μL共7个TaKaRa Taq梯度，泳道8～11分别为TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的阳性对照，泳道12为阴性对照。
图9是TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV多重RT-PCR最佳dNTP浓度优化电泳结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1～7分别代表0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM、0.4mM共7个dNTP梯度，泳道8～11分别为TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的阳性对照，泳道12为阴性对照。
图10是TGEV和PDCoV双重RT-PCR最佳引物比例确定电泳结果图；其中，泳道M为DNAMarker DL1000，泳道1～11分别代表1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、2:3、3:1、3:2、3:4、4:1、4:3共11各引物比例组合，泳道12～13分别代表TGEV和PDCoV的阳性对照，泳道14为阴性对照。
图11是PEDV和PDCoV双重RT-PCR最佳引物比例确定电泳结果图；其中，泳道M为DNAMarker DL1000，泳道1～11分别代表1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、2:3、3:1、3:2、3:4、4:1、4:3共11各引物比例组合，泳道12～13分别代表PEDV和PDCoV的阳性对照，泳道14为阴性对照。
图12是SADS-CoV和PDCoV双重RT-PCR最佳引物比例确定电泳结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1～11分别代表1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、2:3、3:1、3:2、3:4、4:1、4:3共11各引物比例组合，泳道12～13分别代表SADS-CoV和PDCoV的阳性对照，泳道14为阴性对照。
图13是TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR最佳引物浓度优化电泳结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1～9分别代表TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV同比例(3:3:3:4)的9个引物浓度组合,泳道10～13分别代表TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的阳性对照，泳道14为阴性对照。
图14是TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR的敏感性分析结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1～10分别代表TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV混合阳性重组质粒的100～10-9共10个模板稀释度，泳道11为阴性对照。
图15是TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR的特异性分析结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1～4分别代表TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的单重特异性，泳道5～10分别代表TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的双重特异性，泳道11～14分别代表TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的三重特异性，泳道15分别代表TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的四重特异性，泳道16～19分别代表SVA、PRRSV、APPV，泳道20为阴性对照。
图16是TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR的临床检测应用结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1～20分别代表20分粪便拭子样品。
图17是PEDV、TGEV和PDCoV的单重RT-PCR的临床检测验证结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL1000，泳道1～4代表样品4、8、13、16的PEDV阳性粪便拭子，泳道5代表样品10的TGEV阳性粪便拭子，泳道6代表样品13的PDCoV阳性粪便拭子，泳道7为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中：塞尼卡谷病毒(SVV)HN16株(即塞内加谷病毒SVV HN16株)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)Ch-A株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/GDGZ/2012株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)CN12株、猪蓝耳病病毒(PRRSV)YA株已在申请号为“CN201810510587.9”、申请名称为“检测塞尼卡谷病毒的RT-LAMP引物组、试剂盒及应用”的中国专利申请中公开；
猪急性腹泻综合症冠状病毒(SADS-CoV，HN17株)已在参考文献(贺东生,李锦辉,刘博闻,et al.华南猪群猪急性腹泻综合征的诊断和病原鉴定[J].猪业科学,2018,35(10):80-82.)中公开；
非典型性猪瘟病毒(APPV)APPV/CN/HUANAN/201801株已在参考文献(贺东生,殷三鸿,石坚,et al.广东猪群新发非典型瘟病毒病的诊断和病毒鉴定[J].猪业科学,2018,v.35；No.277(07):77-80.)中公开；
RNase Free ddH2O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer(Mg2++plus)均购自TAKARA生物科技有限公司，货号LMP204；Simpiy P总RNA提取试剂盒(Simpiy P TotalRNA Extraction Kit)购自杭州博日科技有限公司，产品编号：BSC52S1。
实施例1
一、引物设计
参考与比对GenBank中TGEV的全基因序列(Accession:KP202948、Accession:KX083668、Accession:HM776941、Accession:KX499468、Accession:HQ462571、Accession:DQ443743、Accession:KT696544、Accession:FJ755618、Accession:EU674218、Accession:DQ811788)，PEDV的全基因序列(Accession:KY963963、Accession:KX981440、Accession:KR610994、Accession:KU297956、Accession:MG781192、Accession:KJ623926、Accession:KT941120、Accession:AF353511、Accession:KP890336、Accession:MF807952)，SADS-CoV的全基因序列(Accession:MF769443、Accession:MF769442、Accession:MF769418、Accession:MF769416、Accession:MF769417、Accession:MG557844、Accession:MF094684、Accession:MF094683、Accession:MF094682、Accession:MF807952)和PDCoV的全基因序列(Accession:KY926512、Accession:MG837131、Accession:MG242026、Accession:KR131621、Accession:MF431743、Accession:KU665558、Accession:KX443143、Accession:KT266822、Accession:KY513725、Accession:KU984334)分别利用MegAlign软件进行序列比对，选TGEV全基因序列中的保守基因片段S区域作为引物设计区域，选择PEDV全基因序列中的保守基因片段M区域作为引物设计区域，选择SADS-CoV全基因序列中的保守基因片段RdRp区域作为引物设计区域，选择PDCoV全基因序列中的保守基因片段N区域作为引物设计区域，分别确定该保守核甘酸序列中的高度保守片段作为扩增区域，利用引物辅助设计软件primer5根据确定的保守核甘酸序列设计出了两套快速区分TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR引物组：每一套多重RT-PCR引物组，包括由TGEV-F、TGEV-R、PEDV-F、PEDV-R、SADS-F、SADS-R、PDCoV-F、PDCoV-R；所述引物序列如下表所示：
表1检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组
二、引物初筛
经过初步筛选，两套引物中第二套引物特异性最好，第一套引物易出现引物二聚体、非特异性扩增，扩增效果不高，故以第二套引物进行下述实验。
实施例2 pMD-19-T-PEDV、pMD-19-T-TGEV、pMD-19-T-SADS和pMD-19-T-PDCoV阳性重组质粒的获取
(1)病毒基因组RNA提取
使用Simpiy P总RNA提取试剂盒(Simpiy P Total RNA Extraction Kit)提取猪传染性胃肠炎病毒(TGEV，CN12株)、猪流行性腹泻病毒(PEDV，CH/GDGZ/2012株)、猪丁型冠状病毒(PDCoV，Ch-A株)和猪急性腹泻综合症冠状病毒(SADS-CoV，HN17株)的RNA，以及对照病毒(塞尼卡谷病毒(SVV)HN16株、猪蓝耳病病毒(PRRSV)YA株以及非典型性猪瘟病毒(APPV)APPV/CN/HUANAN/201801株的RNA。具体操作步骤按照试剂盒进行。
(2)模板RNA的反转录
构建20μL的RNA反转录反应体系，同时建立RNA反转录反应参数，具体反应体系为：5×M-MLV Buffer 4.0μL，dNTP Mixture 1.0μL，Random primer 1.0μL，RNase inhibitor0.5μL，待测样品RNA 5.0μL，M-MLV 0.5μL，RNase Free ddH2O8.0μL；然后42℃反应60min；72℃终止反应1min。以各病毒的总RNA为模板，配制反应体系，将其置于恒温水浴锅中按上述反应参数进行反转录反应，反转录反应结束后获得cDNA。
(3)TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的单重RT-PCR反应
以步骤(2)病毒模板RNA反转录反应的产物cDNA为模板，配制RT-PCR反应体系，然后进行单重RT-PCR扩增，其中，具体反应体系(25μL)为：cDNA2.0μL，正向引物F 1.0μL，正向引物R 1.0μL，dNTP Mixture 2.0μL，10×PCR Buffer(Mg2++plus)2.5μL，TaKaRa Taq 0.5μL，RNase Free ddH2O 16.0μL；RT-PCR反应参数为95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；扩增引物见表1。扩增结束后，制备质量体积比为1.2％的琼脂糖凝胶板，将PCR反应产物按编号依次加入到对应的凝胶板的胶孔中，凝胶板的边孔中加入DNAMarker。于110V恒定电压下电泳45min，电泳结束后用凝胶成像系统进行结果分析并拍照。
以反转录反应产物cDNA为模板，分别用TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的特异性引物(表1第二套引物)进行RT-PCR反应，扩增结果见图1，其中，在801bp、616bp、368bp和250bp处出现目的条带的为阳性扩增，未出现目的条带的为阴性扩增。
(4)单重RT-PCR反应产物的回收
步骤(3)的单重RT-PCR产物进行质量体积比为1.2％的琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统进行结果分析，将确定为阳性扩增的结果在紫外投射下切下含目的DNA的琼脂糖凝胶，将切下的胶块置于1.5mL的EP管内，利用胶回收试剂盒分别进行TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的单重RT-PCR反应产物的回收，具体操作步骤按照试剂盒进行。
(5)目的基因的克隆
将步骤(4)回收后的单重RT-PCR产物分别与载体pMD-19-T连接，其中，连接体系(10μL)为：Ligation Solution I 5μL，PCR回收产物4.5μL，pMD-19-T0.5μL；连接参数为16℃反应3h；将连接产物转化进入感受态细胞DH5α中，具体方法为：
①从-80℃取感受态细胞DH5α，立即放在冰上5～10min自然融化；
②加入连接产物10ul轻轻吹打混匀，冰浴30min；
③42℃水浴中90s进行热休克，然后迅速放回水中，静置2min；
④向其中加入500ul LB液体培养基轻轻混匀。然后固定到摇床的弹簧架上37℃，200～220r/min震荡45～60min；
⑤4℃离心机4000r/min，离心5min；
⑥吸取上清500μl弃去，将剩余液体吹打混匀。分点涂布到含氨苄的LB平板培养皿中，用酒精灯灼烧且冷却的玻璃涂布棒涂布均匀；
⑦在涂好的培养皿做好标记，先放置在37℃恒温培养箱中10～30min直到表面的液体都渗透到培养基里面后，在导致放入37℃恒温箱中过夜；
(6)目的基因阳性克隆的鉴定
从步骤(5)中的培养过夜的氨苄的LB平板培养皿上挑取单个菌落于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温摇床200r/min振荡培养12～16h，获得克隆菌；
以克隆菌为模板，进行菌液PCR，其中，具体反应体系(25μL)为：菌液2.0μL，正向引物F 1.0μL，反向引物R 1.0μL，dNTP Mixture 2.0μL，10×PCR Buffer
(Mg2++plus)2.5μL，TaKaRa Taq 0.5μL，RNase Free ddH2O 16.0μL；反应参数为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；反应结束后按照步骤(3)进行琼脂糖凝电泳检测。对确定为含有阳性重组质粒的克隆菌进行质粒提取，具体操作步骤按照质粒提取试剂盒进行，得到阳性重组质粒pMD-19-T-PEDV、pMD-19-T-TGEV、pMD-19-T-SADS和pMD-19-T-PDCoV。
以克隆菌为模板，分别用TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的特异性引物(表1第二套引物)进行菌液PCR鉴定，鉴定结果见图2，其中，在801bp、616bp、368bp和250bp处出现目的条带的为阳性扩增，未出现目的条带的为阴性扩增。
实施例3 TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR反应体系的建立及优化
构建50μL初始多重RT-PCR反应体系(表2)和反应参数(表3)，依次对退火温度、TaKaRa Taq酶浓度、dNTP、多重RT-PCR反应体系的各引物浓度及比例进行优化，得到的结果进行琼脂糖凝胶(质量体积比1.2％)电泳检测；
表2初始多重RT-PCR反应体系
体系成分 含量(体积/μL)
10×Buffer 5.0
2.5mM dNTP 4.0
Primer Mixture F 2.0
Primer Mixture R 2.0
5U/μL TaKaRa Taq 1.0
模板 4.0
RNase Free ddH<sub>2</sub>O 32
总计 50
注：上述体系中，单条引物的终浓度为0.1μmol/L；
表3初始多重RT-PCR反应参数
(1)多重RT-PCR最佳退火温度的优化
①TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV单重RT-PCR退火温度的优化
在进行TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV多重RT-PCR退火温度优化之前，首先进行TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV单重RT-PCR退火温度的优化。设置53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃共7个温度梯度分别对TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV进行单重RT-PCR退火温度的优化，利用已建立的单重RT-PCR反应体系(见实施例2步骤(3))和反应参数(实施例2步骤(3))进行反应，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果表明：TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的单重RT-PCR最佳退火温度分别为56℃、55℃、55℃、56℃(图3、图4、图5、图6)。
②TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV多重RT-PCR退火温度的优化
根据TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV单重RT-PCR反应温度优化的结果，设置53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃共7个温度梯度对TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV进行多重RT-PCR退火温度的优化，根据建立的多重RT-PCR反应体系(表2)和反应参数(表3)进行PCR反应，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR最佳退火温度为55℃(图7)。
(2)最佳TaKaRa Taq终浓度优化
设置0.02U/μL、0.04U/μL、0.06U/μL、0.08U/μL、0.1U/μL、0.12U/μL、、0.16U/μL共7个TaKaRa Taq梯度进行多重RT-PCR反应，其他成分的用量如表2所示，同时根据表3结合已优化的的反应参数进行PCR扩增，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR最佳TaKaRa Taq浓度为0.1U/μL(图8)。
(3)最佳dNTP终浓度优化
设置0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM、0.4mM共7个dNTP梯度进行多重RT-PCR反应，根据表2和表3结合已优化的的条件和成分进行PCR扩增，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR最佳dNTP浓度为0.25mM(图9)。
(4)最佳引物终浓度优化
①TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR最佳引物比例优化
为确定多重PCR中四种病毒引物之间的比例，首先将PEDV、TGEV和SADS-CoV的引物分别与PDCoV引物进行组合，每组组合设定了11组引物组合比(表4)，同时建立双重RT-PCR反应体系(表5)和反应参数(表6)，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：TGEV和PDCoV、PEDV和PDCoV、SADS-CoV和PDCoV的双重RT-PCR最佳引物比例分别为3：4、3：4、3：4(图10、图11、图12)，则初步确定TGEV、PEDV、PDCoV、和SADS-CoV的多重RT-PCR的最佳引物比例为3:3:3:4。
表4引物组合比例
实验组 引物(PEDV/TGEV/SADS-CoV)/μM 引物(PDCoV)/μM 引物比例
1 0.2 0.2 1:1
2 0.2 0.4 1:2
3 0.2 0.6 1:3
4 0.2 0.8 1:4
5 0.4 0.2 2:1
6 0.4 0.6 2:3
7 0.6 0.2 3:1
8 0.6 0.4 3:2
9 0.6 0.8 3:4
10 0.8 0.2 4:1
11 0.8 0.2 4:3
12 0.2 0 P<sub>1</sub><sup>+</sup>
13 0 0.2 P<sub>2</sub><sup>+</sup>
14 0.2 0.2 N
(注：P(positive)代表阳性，N(negative)代表阴性；P1 +代表与PDCoV作引物比例优化的病毒的阳性对照，P2 +代表PDCoV的阳性对照，N代表双重引物比例实验的阴性对照)
表5双重RT-PCR反应体系
体系成分 含量(体积/μL)
10×Buffer 2.5
2.5mM dNTP 2
混合引物 X(表4不同组合的混合引物)
5U/μL TaKaRa Taq 0.5
模板 2
补足RNase Free ddH<sub>2</sub>O 25
表6双重RT-PCR反应参数
②TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR最佳引物终浓度优化
在综合分析三个双重PCR结果的基础上，初步确定TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR的引物比例为3:3:3:4。为确定TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR最佳引物终浓度，保持TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的引物间的比例不变，设置9组相同引物比例条件下的不同的引物终浓度(表7)，根据已经优化的多重RT-PCR反应体系和反应参数进行多重RT-PCR反应。反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR最佳引物终浓度为0.24μM：0.24μM：0.24μM：0.32μM(图13)。
表7恒定比例下的四种引物浓度组合(终浓度)
根据所得的实验结果，最终确定优化的多重RT-PCR反应体系(50μL)和反应参数如表8和表9所示。
表8优化后的多重RT-PCR反应体系
体系成分 含量(体积/μL)
模板混合物 4.0μL
Primer Mixture 5.2μL
dNTP Mixture 4.0μL
10×PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>+plus) 5.0μL
TaKaRa Taq 1.0μL
RNase Free ddH<sub>2</sub>O 30.8μL
总计 50.0μL
表9优化后的多重RT-PCR反应参数
实施例4多重RT-PCR的敏感性分析
利用质粒提取试剂盒提取实施例2制得的pMD-19-T-TGEV、pMD-19-T-PEDV、pMD-19-T-SADS和pMD-19-T-PDCoV阳性重组质粒，测定其浓度分别8.54×109copies/μL、6.48×109copies/μL、7.79×109copies/μL、5.66×109copies/μL，将四种阳性重组质粒等比例混合，用RNase Free ddH2O连续10倍倍比稀释成9个稀释度，以各混合重组质粒的稀释度作为扩增模板，利用优化后的反应体系(表8)和反应参数(表9)进行多种RT-PCR，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：多重RT-PCR检测方法对于TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的敏感性分别为8.54×105copies/μL、6.48×105copies/μL、7.79×106copies/μL、5.66×105copies/μL(图14)。
实施例5多重RT-PCR的特异性分析
利用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取阳性SVV、PDCoV、PEDV、TGEV、SADS-CoV、PRRSV、APPV共7种病毒(塞尼卡谷病毒(SVV)HN16株、猪丁型冠状病毒(PDCoV)Ch-A株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/GDGZ/2012株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)CN12株、猪蓝耳病病毒(PRRSV)YA株以及非典型性猪瘟病毒(APPV)APPV/CN/HUANAN/201801株的核酸，首先以SVV、PDCOV、PEDV、TGEV、SADS-CoV、PRRSV和APPV的RNA为模板进行反转录以获取cDNA，然后以各病毒的cDNA和水为模板利用优化后的反应体系(表8)和反应参数(表9)进行多重RT-PCR扩增，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明：TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR具有良好的特异性。(图15)。
实施例6多重RT-PCR的临床检测应用
利用TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测从发病猪场送检的20份粪便拭子，利用Simpiy P总RNA提取试剂盒(Simpiy P Total RNA Extraction Kit)提取送检粪便拭子的核酸。以所提取的20份粪便拭子核酸为模板，首先利用提取的RNA为模板进行反转录以获取cDNA，然后利用优化后的反应体系(表8)和反应参数(表9)进行多重RT-PCR反应，反应结束后采用质量体积比1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
经鉴定该送检样品中有3份粪便拭子为PEDV单纯感染，一份粪便拭子为TGEV单纯感染，一份粪便拭子为PEDV和PDCoV双重感染，其他粪便拭子为阴性(图16)，经多重RT-PCR检测确定为阳性的样本进行单重RT-PCR验证(图17)，单重RT-PCR的结果和多重RT-PCR检测一致，两种检测方法的检测符合率为100％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组
<130> 1
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物TGEV-F
<400> 1
gtatgaagcg tagtggttat ggtc 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物TGEV-R
<400> 2
aataggttat gacaggttca caatc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物PEDV-F
<400> 3
tttcacatgg aatatcatac tgacg 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物PEDV-R
<400> 4
atgaagcact ttctcactat ctgt 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物SADS-F
<400> 5
tcctgaggaa gaggttgaga tggt 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物SADS-R
<400> 6
cgtgcttacc attgtgtatg agac 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物PDCoV-F
<400> 7
agacactgag aagacgggta tgg 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物PDCoV-R
<400> 8
cttcttgtcc ttagttggtt tggt 24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物TGEV-F1
<400> 9
gtatgaagcg tagtggttat g 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物TGEV-R1
<400> 10
tagaataggt tatgacagg 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物PEDV-F1
<400> 11
tcacatggaa tatcatact 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物PEDV-R1
<400> 12
actcggatta ctcacagc 18
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物SADS-F1
<400> 13
acggttggtc gttttaggag 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物SADS-R1
<400> 14
acaagcggaa agtgacagga at 22
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物PDCoV-F1
<400> 15
actccgattc ctccatcct 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物PDCoV-R1
<400> 16
agattggtcg cgtttcctg 19

Claims (10)

1.一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组，其特征在于包含引物TGEV-F、TGEV-R、PEDV-F、PEDV-R、SADS-F、SADS-R、PDCoV-F和PDCoV-R，其核苷酸序列如下所示：
引物TGEV-F：5′-GTATGAAGCGTAGTGGTTATGGTC-3′；
引物TGEV-R：5′-AATAGGTTATGACAGGTTCACAATC-3′；
引物PEDV-F：5′-TTTCACATGGAATATCATACTGACG-3′；
引物PEDV-R：5′-ATGAAGCACTTTCTCACTATCTGT-3′；
引物SADS-F：5′-TCCTGAGGAAGAGGTTGAGATGGT-3′；
引物SADS-R：5′-CGTGCTTACCATTGTGTATGAGAC-3′；
引物PDCoV-F：5′-AGACACTGAGAAGACGGGTATGG-3′；
引物PDCoV–R：5′-CTTCTTGTCCTTAGTTGGTTTGGT-3′。
2.权利要求1所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组在检测TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV领域中的应用。
3.一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组。
4.根据权利要求3所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于还包含RNase Free ddH2O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、Randomprimer、RNase inhibitor、M-MLV、5×M-MLV Buffer。
5.根据权利要求4所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包含RNase Free ddH2O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、Randomprimer、RNase inhibitor、M-MLV、5×M-MLV Buffer；浓度为10μmol/L的TGEV-F、浓度为10μmol/L的TGEV-R、浓度为10μmol/L的PEDV-F、浓度为10μmol/L的PEDV-R、浓度为10μmol/L的SADS-F、浓度为10μmol/L的SADS-R、浓度为10μmol/L的PDCoV-F、浓度为10μmol/L的PDCoV-R。
6.权利要求3～5任一项所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒在检测TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV中的应用。
7.根据权利要求6所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒在检测TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV中的应用，其特征在于包含如下步骤：
(1)以待测样品RNA为模板，以Random primer为扩增引物，配制反转录反应体系，进行样品RNA的反转录反应，得到cDNA；
(2)以步骤(1)制得的反转录反应产物cDNA为模板，以混合引物TGEV-F、TGEV-R、PEDV-F、PEDV-R、SADS-F、SADS-R、PDCoV-F、PDCoV-R为扩增引物，配制多重PCR反应体系，进行多重PCR反应；
(3)将步骤(2)制得的多重PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；结果判定方法为：在801bp处出现目的条带的判定为TGEV阳性扩增，616bp处出现目的条带的判定为PEDV阳性扩增，368bp处出现目的条带的判定为SADS-CoV阳性扩增，250bp处出现目的条带的判定为PDCoV阳性扩增，在801bp处未出现目的条带的判定为TGEV阴性扩增，616bp处未出现目的条带的判定为PEDV阴性扩增，368bp处未出现目的条带的判定为SADS-CoV阴性扩增，250bp处未出现目的条带的判定为PDCoV阴性扩增。
8.根据权利要求7所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒在检测TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV中的应用，其特征在于：
步骤(1)中所述的反转录反应的反应体系为：
9.根据权利要求7所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒在检测TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV中的应用，其特征在于：
步骤(2)中所述的多重PCR反应的反应体系为：
10.根据权利要求7所述的TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测试剂盒在检测TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV中的应用，其特征在于：
步骤(2)中所述的多重PCR反应的参数如下所示：
95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
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