CN109439799A - 一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式pcr引物及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式pcr引物及试剂盒 Download PDF

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CN109439799A CN201811313618.8A CN201811313618A CN109439799A CN 109439799 A CN109439799 A CN 109439799A CN 201811313618 A CN201811313618 A CN 201811313618A CN 109439799 A CN109439799 A CN 109439799A
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宋德平
张誉翰
张帆帆
袁为锋
唐玉新
李凯
叶昱
丁珍
吴琼
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    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明涉及一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒，属于生物技术领域，所述套式PCR引物包括：(1)外套引物，包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物；(2)内套引物，包括SEQ ID No.3所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.4所示核苷酸序列的下游引物。本发明还提供包含上述套式PCR引物的试剂盒。本发明提供的套式PCR引物及试剂盒用于检测猪急性腹泻冠状病毒，兼具高灵敏度、便捷性和特异性强的优点。

Description

一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒。
背景技术
2017年2月，在广东的腹泻哺乳仔猪中分离到一种新现的类似蝙蝠-HKU2的猪急性腹泻冠状病毒(又称猪肠溶性alpha冠状病毒，SADS-CoV)，这种猪急性腹泻冠状病毒引起的临床症状与其他冠状病毒如猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒等引起的腹泻症状非常相似，以水样腹泻为主要特征。这是从猪群中发现的第五种冠状病毒，与之前发现的引起猪腹泻的冠状病毒(传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒)类似，SADS-CoV引起的疾病可致新生哺乳仔猪急性剧烈水样腹泻，死亡率可达100％。因此，SADS-CoV引起的腹泻对当前生猪生产造成非常严重的危害，也是困扰养殖业中的难题之一。
随着我国养殖业不断走向现代化养殖模式的超大规模化养殖场，新病原的发现和爆发频率高，给养猪业造成巨大经济损失，对养殖业是巨大的挑战。目前，SADS-CoV的诊断方法还不健全，主要依靠常规PCR、荧光定量PCR和病毒分离等诊断手段。套式PCR是在常规PCR的基础上发展起来的，不仅保留常规PCR的优点，同时还较大的提高了检测的灵敏性、特异性和重复性。此外，套式PCR需要的仪器设备和对人员技术要求不需要荧光定量PCR的高，可以在临床上大面积推广和使用。因此，建立猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测引物组及试剂盒十分必要。本发明根据猪急性腹泻冠状病毒的N基因设计引物组，可用于建立高效、准确、快速的分子生物学诊断技术。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒，本发明提供的套式PCR引物及试剂盒用于检测猪急性腹泻冠状病毒，兼顾高灵敏度、便捷性、特异性强的优点。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的技术方案之一是提供一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物，其包括如下引物：
(1)外套引物，包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物；
(2)内套引物，包括SEQ ID No.3所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.4所示核苷酸序列的下游引物。
其中，该外套引物扩增的DNA片段大小为650bp，其核苷酸序列序列如SEQ ID:No.5所示。该内套引物扩增的DNA片段大小为291bp，其核苷酸序列如SEQ ID:No.6所示。
本发明的技术方案之二是提供一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的试剂盒，其包括如前所述的套式PCR引物。
在本发明中，所述试剂盒还包括反转录试剂。
优选地，所述的试剂盒，其包括：
(1)反转录试剂：MgCl2、缓冲液、dNTP mix、RNA酶抑制剂、反转录酶、随机引物和灭菌双蒸水；
(2)套式PCR试剂：
外套PCR预混液：DNA聚合酶、缓冲液、权利要求1所述的外套引物和灭菌双蒸水；
内套PCR预混液：DNA聚合酶、缓冲液、权利要求1所述的内套引物和灭菌双蒸水。
在本发明提供的较佳实施例中，所述反转录试剂包括：25mM/μL MgCl2 2μL、5×Buffer 4μL、10mM/μL dNTP mix 2μL、40UI/μL RNA酶抑制剂0.5μL、200UI/μL反转录酶M-MLV 1μL、20mM/μL随机引物2μL和灭菌双蒸水6μL。
本发明中，所述反转录配套的反应程序为：42℃50min；95℃5min。
本发明提供的较佳实施例中，所述外套PCR预混液包括：2U/μL聚合酶TaKaRa ExTaq 0.3μL、10×Ex Taq Buffer 2.5μL、2.5mM/μL dNTP mix 1μL、10mM/μL所述外套引物各1μL和灭菌双蒸水16.7μL。
本发明中，所述外套PCR配套的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行20个循环；72℃再延伸7min。
本发明提供的较佳实施例中，所述内套PCR预混液包括：2U/μL聚合酶TaKaRa ExTaq 0.3μL、10×Ex Taq Buffer 2.5μL、2.5mM/μL dNTP mix 1μL、10mM/μL权利要求1所述内套引物各1μL和灭菌双蒸水16.7μL。
本发明中，所述外套PCR配套的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，进行20个循环；72℃再延伸7min。
本申请还提供利用上述引物检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR方法，所述的套式PCR方法分三步进行，提取病毒RNA后，首先按照大连宝生物公司(TaKaRa)的反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，然后以第一步得到的cDNA为模板，用外套引物进行扩增；最后以第二步扩增的产物为模板用内套引物进行扩增。
反转录反应体系，在20μL体系中加入以下成份：
反转录的反应条件为：42℃50min，95℃5min。反转录完成后，cDNA直接用于PCR扩增或者置于-20℃保存。
在本发明实施例中，所述猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测的反应体系为25μL，反应体系包括：
外套PCR反应体系条件：
反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行20个循环；72℃再延伸7min。
内套PCR反应体系条件：
反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，进行20个循环；72℃再延伸7min。
本发明的检测猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测引物可用于非诊断目的的检测试剂盒。
所述的在试剂盒中的应用，是将所述的引物作为核心检测试剂，配合其他常用试剂(按常规方法)可以用于上述猪急性腹泻冠状病毒的试剂盒，所述的试剂盒的组装参照常规方法组装和配制。
与现有技术相比，本发明较佳实施例具有如下有益效果：本发明提供的套式PCR引物用于检测猪急性腹泻冠状病毒，兼顾灵敏度、便捷性、特异性，其最低检测浓度达到1.0×102拷贝/μL。本发明提供的试剂盒具有成本低，检测速度快和结果易于判断等优点，能够快速、准确地鉴定猪急性腹泻冠状病毒感染情况，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR外套引物扩增产物电泳图；附图标记说明：1、2、3、4为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR外套引物扩增的大小约为650bp的片段，Maker：DNAMarker DL 2000；
图2为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR内套引物扩增产物电泳图；附图标记说明：1、2、3、4为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR内引物扩增的大小约为291bp的片段，Maker：DNAMarker DL 2000；
图3为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR特异性试验结果电泳图。附图标记说明：1：SADS-CoV外套PCR扩增产物；2：SADS-CoV内套PCR扩增产物；3：SADS-CoV套式PCR扩增产物；4-6自左向右依次为：PEDV、TGEV、PDCoV的扩增产物；Maker：DNA Marker DL 2000；
图4为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR敏感性试验结果电泳图；附图标记说明：1-8自左向右依次为：1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/μL检测浓度的PCR扩增产物；9：阴性对照；Maker：DNA Marker DL 2000；
图5为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR重复性试验结果电泳图；附图标记说明：A、B和C分别代表第一周、第二周和第三周的PCR扩增结果电泳图；图A-C中，1为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR第一轮PCR扩增产物；2为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR第二轮PCR扩增产物；3为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR扩增产物；Maker：DNA Marker DL 2000。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sam brook等分子克隆实验手册(Sam brook J&R ussell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1：用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物设计和检测方法的建立
1试验材料
1.1菌株和质粒
大肠杆菌Top10感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司。
SADS-CoV从江西猪场临床样品中分离获得并由本实验室保存。
1.2试剂
酵母提取物、胰蛋白胨、氨苄青霉素均购自北京索莱宝科技有限公司；病毒RNA/DNA提取试剂盒(离心柱型)、TaKaRa Ex Taq、10×Ex Taq Buffer、dNTP Mixture、DL2000DNA marker、pMD18-T载体均购置Takara(大连)公司；质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司。
1.3设备
SorvallST16R高速冷冻离心机、Legend Micro 21R高速冷冻离心机和NanoDrop2000均购自美国Thermo公司；Applied Biosystems7500PCR仪购自美国应用生物系统公司；琼脂糖水平电泳槽购自北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统购自上海培清科技有限公司。
1.4引物设计与合成
根据GenBank中登陆的猪急性腹泻冠状病毒GDS04毒株的N基因保守区域，应用Primer Premier 5.0软件设计两对特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务公司合成，所得的引物组的序列如表1所示(其中，“F”代表正向引物，“R”代表反向引物)：
表1引物信息
2实验方法
2.1病毒RNA提取
根据TaKaRa公司的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0病毒提取试剂盒的操作说明书提取SADS-CoV的RNA，操作步骤如下：
(1)研磨器研磨样品后，离心取上清；
(2)取200μL离心后上清、200μL Buffer VGB、20μL蛋白酶K和1μL Carrier RNA混匀，于56℃水浴10min；
(3)裂解后的液体加入200μL无水乙醇混匀，转移至Spin Columns，离心后分步加入Buffer RWA/RWB，离心。
(4)离心后加入30μL无RNAase ddH2O溶解RNA，-80℃保存备用。
2.2病毒RNA反转录
以上一步提取的SADS-CoV的基因组RNA为模板，按下述的反应体系和反应程序进行反转录。
反转录反应体系为：
反应程序为：42℃50min；95℃5min
2.3猪alpha病毒套式PCR检测方法的优化与PCR扩增
使用50℃，52℃，54℃，56℃的温度梯度对反应进行优化，通过优化反应条件，确认以下的反应体系和扩增程序为最佳条件：
外套PCR反应体系条件：
反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行20个循环；72℃再延伸7min。
内套PCR反应体系条件：
反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，进行20个循环；72℃再延伸7min。
PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳观察电泳结果，图1为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR外引物扩增产物电泳图；图2为猪急性腹泻冠状病毒套式PCR内引物扩增产物电泳图；
结果说明：从图1-2可以看出，以SADS-CoVcDNA为模板的套式PCR扩增产物的目的基因片段大小分别为650bp和291bp，与猪急性腹泻冠状病毒目的片段的长度一致。
2.4猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测方法特异性试验
利用本发明建立的猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测方法分别以PEDV、TGEV、PDCoV的基因组DNA以及SADS-CoV的DNA为模板进行PCR扩增，结果见图3；图中，1：SADS-CoV外套PCR扩增产物；2：SADS-CoV内套PCR扩增产物；3：SADS-CoV套式PCR扩增产物；4-6自左向右依次为：PEDV、TGEV、PDCoV的扩增产物；Maker：DNA Marker DL 2000。
结果说明：应用本申请提供的猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测方法对PEDV、TGEV、PDCoV病毒的检测结果均为阴性，只有猪急性腹泻冠状病毒的PCR检测结果呈阳性，表明该套式PCR检测方法的特异性良好。
2.5猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR检测方法敏感性试验
首先利用引物组(具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的反向引物)对提取的SADS-CoV基因组DNA为模板进行PCR扩增；然后采用omega Gel Extraction Kit回收PCR产物作为目的片段；采用大连宝生物的pMD18-TCloning Vector试剂盒，将上述目的片段插入pMD18-T载体中，构建重组质粒，通过转化及筛选，得到含插入有上述目的片段的重组质粒的阳性克隆菌；该阳性克隆菌经过扩大培养后，用天根质粒提取试剂盒提取培养菌液中的质粒，提取方法为：将200μL PCR鉴定为阳性且测序结果正确的菌液接种于20mL加有氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养8h后，12000rpm离心2min，弃上清；加入2mL PBS重悬，12000rpm离心2min，弃上清后参照质粒小提试剂盒说明书(北京天根)提取质粒，提取后通过超微量分光光度计NanoDrop2000测定提取的重组质粒的浓度，再根据重组质粒分子质量和阿伏伽德罗常数将质粒浓度换算成单位体积分子拷贝数，并将重组质粒以1.0×108拷贝/μL为原始浓度后进行10倍梯度稀释，分别以1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/μL为模板进行多重PCR扩增以检验本发明提供的猪alpha套式PCR检测方法的灵敏度，检测结果见图4，图中，1-8自左向右依次为：1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/μL检测浓度的PCR扩增产物；9：阴性对照；M：DNA Marker DL2000。
结果表明：本发明提供的猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测方法的最低检测量为1.0×102拷贝/μL，表明所建立的PCR方法敏感性良好。
2.6猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测方法重复性试验
利用本发明所述的猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测方法，以提取的SADS-CoV的基因组DNA为模板，进行三次扩增(间隔一周)，以确定检测结果的重复性，结果见图5，其中A、B和C分别代表第一周、第二周和第三周的PCR扩增结果电泳图；图A-C中，1为SADS-CoV外套扩增产物；2为SADS-CoV内套PCR扩增产物；3为SADS-CoV套式PCR扩增产物；Maker为DNAMarker DL 2000。
结果说明：利用本发明所述的猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测方法在不同时间点进行测定，测定结果一致，表明本发明所述的方法重复性良好。
2.7猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测方法对临床样品的检测
利用本发明所述的猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测方法对采自江西32个猪场256份样品(肺、淋巴结、脾脏)进行检测，以验证该方法的实用性。结果SADS-CoV有2份检测样品呈阳性。
结果表明：本发明所述的猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测方法在临床实践上具有可行性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 江西农业大学
<120> 一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
cgttctcgca atcaaagtca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
tccaccatct caacctcctc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
tgagttgctt ccgacacaag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
tccaccatct caacctcctc 20
<210> 5
<211> 650
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
cgttctcgca atcaaagtca aagccgcagt ggtgctcaga cacctcgtgc tcaacagccg 60
tcacagtctg ttgacattgt tgctgcagtt aaacaagctt tggcagactt gggcatagct 120
tctagccagt ccaggcctca aagtggtaaa aatacaccca aaccaagaag cagagctgtc 180
tcacctgcac ctgcccctaa accggctcgt aagcagatgg acaaacctga atggaagcgt 240
gttcctaatt ctgaggagga cgtgcgtaaa tgctttggtc ctcgctcagt ttctagaaat 300
tttggtgaca gtgacctcgt tcagcacggt gttgaagcta agcactttcc aacaattgct 360
gagttgcttc cgacacaagc tgcactagcc tttggtagtg aaatcacaac caaagagtct 420
ggtgaatttg tagaagtcac ctatcactat gtaatgaagg tccccaagac tgataaaaat 480
ctacccagat ttcttgagca agtctcggct tactctaaac ccagtcaaat taggagatct 540
caatctcaac aagacctaaa tgctgatgcc ccagtgttca ctccggcacc tccagctact 600
ccagtttccc aaaatcctgc ttttcttgag gaggaggttg agatggtgga 650
<210> 6
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
tgagttgctt ccgacacaag ctgcactagc ctttggtagt gaaatcacaa ccaaagagtc 60
tggtgaattt gtagaagtca cctatcacta tgtaatgaag gtccccaaga ctgataaaaa 120
tctacccaga tttcttgagc aagtctcggc ttactctaaa cccagtcaaa ttaggagatc 180
tcaatctcaa caagacctaa atgctgatgc cccagtgttc actccggcac ctccagctac 240
tccagtttcc caaaatcctg cttttcttga ggaggaggtt gagatggtgg a 291

Claims (10)

1.一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物，其特征在于，其包括如下引物：
(1)外套引物，包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物；
(2)内套引物，包括SEQ ID No.3所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.4所示核苷酸序列的下游引物。
2.一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的套式PCR引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录试剂。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其包括：
(1)反转录试剂：MgCl2、缓冲液、dNTP mix、RNA酶抑制剂、反转录酶、随机引物和灭菌双蒸水；
(2)套式PCR试剂：
外套PCR预混液：DNA聚合酶、缓冲液、权利要求1所述的外套引物和灭菌双蒸水；
内套PCR预混液：DNA聚合酶、缓冲液、权利要求1所述的内套引物和灭菌双蒸水。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录试剂包括：25mM/μL MgCl22μL、5×Buffer 4μL、10mM/μL dNTP mix 2μL、40UI/μL RNA酶抑制剂0.5μL、200UI/μL反转录酶M-MLV 1μL、20mM/μL随机引物2μL和灭菌双蒸水6μL。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录配套的反应程序为：42℃50min；95℃5min。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述外套PCR预混液包括：2U/μL聚合酶TaKaRa Ex Taq 0.3μL、10×Ex Taq Buffer 2.5μL、2.5mM/μL dNTP mix 1μL、10mM/μL权利要求1所述外套引物各1μL和灭菌双蒸水16.7μL。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述外套PCR配套的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，进行20个循环；72℃再延伸7min。
9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内套PCR预混液包括：2U/μL聚合酶TaKaRa Ex Taq 0.3μL、10×Ex Taq Buffer 2.5μL、2.5mM/μL dNTP mix 1μL、10mM/μL权利要求1所述内套引物各1μL和灭菌双蒸水16.7μL。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述外套PCR配套的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，进行20个循环；72℃再延伸7min。
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