CN107916303A - 快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的hrm检测引物、试剂盒及方法 - Google Patents

快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的hrm检测引物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测引物、试剂盒及方法；旨在提供一种灵敏度高，特异性强的猪圆环病毒1型、2型和3型检测引物和方法，其技术方案包括，其HRM检测引物核苷酸序列如下所示：上游引物P1：5’‑GTTGCVGAGMAGHTCCCTG‑3’；下游引物P2：5’‑CCATTGTAACCATCCCACCA‑3’；属于生物检测技术领域。

Description

快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测引物、试剂盒及 方法
技术领域
本发明公开了一种HRM检测引物、试剂盒及方法，具体地说，是一种鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测引物、试剂盒及方法；属于生物检测技术领域。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)为一种共价闭合、单股环状DNA病毒，是迄今发现最小动物病毒。2016年前，全球范围内仅发现PCV1和PCV2两个基因型。其中，PCV1被认为是猪肾细胞PK-15污染物，但不产生细胞病变效应，对猪无致病性[5]。PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)主要病原，与猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、增生性坏死性肺炎(PNP)和肠炎等疾病密切相关，均为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。
临床上，PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪肺炎支原体(M.hyo)等病原体混合/继发感染，造成养猪业巨大经济损失。
2003年全球范围内PCV2发生由PCV2a向PCV2b基因型转变，病毒致病力增强，对养猪业危害加重。2012年PCV2在世界范围内再次发生基因型转变，由PCV2b向致病力更强PCV2d转变，现有疫苗免疫效果降低。2015年6月，美国北卡罗来纳州某商品化猪场暴发PDNS疫情，与历史平均值相比，该猪场母猪死亡率升高10.2％、受孕率下降0.6％。患病母猪厌食、皮肤呈现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，所产胎儿(包括弱胎、死胎、木乃伊胎)具有相似临床症状。Palinski等借助新一代测序(NGS)技术，从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定出一种新病毒，该病毒与圆环病毒科病毒具有类似基因组结构和遗传相似性，但与其他圆环病毒衣壳蛋白氨基酸序列同源性低于70％，根据国际病毒分类委员会(ICTV)圆环病毒分类标准，将其归类为一种新型圆环病毒，命名为PCV3。
目前，市场上并没有专门针对猪圆环病毒不同型的检测试剂盒。
我国已出现PCV3感染病例，主要集中于中东部地区。全国范围内急需开展PCV3流行病学调查，“早发现、早报告、早隔离、早诊断、早扑灭”，及时控制和扑灭疫情
鉴于PCV3具有传播途径多、传播速度快、流行范围广等特点，应尽快研发适用于出入境口岸PCV3快速筛查与准确鉴定需求的检疫技术和产品迫在眉睫。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测引物。
本发明的第二个目的在于提供一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测试剂盒。
本发明的第三的在于提供一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型HRM检测方法。
为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：
一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测引物，其核苷酸序列如下所示：
上游引物P1：5’-GTTGCVGAGMAGHTCCCTG-3’(SEQ ID NO：1)；
下游引物P2：5’-CCATTGTAACCATCCCACCA-3’(SEQ ID NO：2)。
本发明提供的第二个技术方案是一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测试剂盒，该试剂盒含有的引物为：
上游引物P1：5’-GTTGCVGAGMAGHTCCCTG-3’(SEQ ID NO：1)；
下游引物P2：5’-CCATTGTAACCATCCCACCA-3’(SEQ ID NO：2)。
本发明提供的第三个技术方案是一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测方法，该方法包括以下步骤：
1)从样品中提取病毒核酸；
2)以核酸为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的以及荧光饱和染料，进行PCR扩增反应获得扩增产物；
3)对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型；上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
优选的，上述的方法步骤2)中PCR扩增的反应体系为：
优选的，上述的方法步骤2)中PCR扩增反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸10min。
优选的，上述的方法步骤3)HRM分析过程中，80℃到95℃以每0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
优选的，上述的方法步骤3)中HRM分析的具体分析过程为：在80～95℃熔解温度范围内，若待检测样品熔解曲线有两个熔解峰，则判定待检测样品为猪圆环病毒3型；如果若待检测样品熔解曲线在85～86℃出现一个熔解峰时，则判定待检测样品为猪圆环病毒2型；如果若待检测样品熔解曲线在87～88℃出现一个熔解峰时，则判定待检测样品为猪圆环病毒1型。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：
1)本发明首次建立了一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测方法及引物，只需PCR体系中加入荧光饱和染料进行常规PCR反应；检测速度快，全部操作过程只需2小时；费用低，可以简单、快速的实现高通量分析。
2)本发明的PCR-HRM引物，对猪圆环病毒1型、2型和3型均有很好的扩增性，PCR扩增效率高，检测灵敏度高。
3)本发明的PCR-HRM引物特异性好，能够特异性扩增猪圆环病毒1型、2型和3型RNA，而不扩增猪常见的其他病毒性和细菌病原，保证了本方法的可靠性。
附图说明
图1为圆环病毒1型、2型、3型标准样品HRM标准化熔解曲线；
图2为圆环病毒1型、2型、3型标准样品HRM峰型化熔解曲线；
图3为特异性试验凝胶电泳图；
图4为圆环病毒1型、2型、3型标准样品临床样品HRM标准化熔解曲线；
图5为圆环病毒1型、2型、3型标准样品临床样品HRM峰型化熔解曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，对于本申请为详细披露的信息，均按照本领域常规技术手段进行。
实施例1
本发明一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测引物，其上游引物P1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其下游引物P1核苷酸序列SEQ ID NO：2所示：
上述的引物根据这三个病毒的rep基因的保守序列设计的，具体如下表
其中：PK-15细胞(ATCCCCL-33)购自美国ATCC，PCV-2，CSFV，PRRSV，PRV，PPV够自商品化疫苗，PCV3合成的全基因序列。
实施例2
本发明提供的一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测方法，具体包括如下步骤：
1)病毒核酸提取
从鸡场采集的淋巴结、脾脏等组织样本装入离心管中加入适量灭菌的PBS，匀浆；疫苗、细胞毒、组织匀浆液的PBS溶液等样品用天根核酸自动抽取仪提取DNA，操作说明书进行。
2)3种病原质粒标准品的制备
用天根的核酸自动抽取仪分别提取PCV-1、PCV-2病原的DNA、PCV-3合成基因为模板，使用上游引物P1核苷酸序列如SEQ ID NO：1，下游引物P1核苷酸序列SEQ ID NO：2所示引物进行PCR扩增，将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化。用TaKaRa公司的试剂盒将纯化后的cDNA连接至pMD-19T载体中，将连接产物转化至DH5a感受态细胞，挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，并对阳性重组质粒测序验证。用质粒提取试剂盒(OMEGA公司)提取质粒，微量紫外分光光度计测定浓度与纯度，根据下面的公式计算拷贝数。拷贝数(copies/μL)＝6.022×1023
(copies/mol)×DNA浓度(g/μL)/质量MW(g/mol)。其中，MW＝DNA碱基数(bp)×660daltons/bp，DNA碱基数＝载体序列碱基数+插入序列碱基数。
3)3种病原PCR-HRM检测方法的建立
PCR扩增反应体系如下：
扩增反应程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸10min。
80℃到95℃以0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
4)特异性试验
使用以核苷酸序列如SEQ ID NO：1，下核苷酸序列SEQ ID NO：2所示引物，分别用PCV1、PCV2、PCV3、CSFV、PRRSV、PRV、PPV作为模板进行PCR-HRM特异性分析检测。
对圆环病毒1型、2型、3型标准样品HRM标准化熔解曲线，结果参阅图1，从图1中可以看出猪圆环病毒1型、2型、3型的3种标准样品熔解曲线相互分开，表明所设计引物适合用于HRM分析。
对圆环病毒1型、2型、3型标准样品HRM峰型化熔解曲线；参阅图2，从图2可以看出猪圆环病毒1型和2型均只有1个熔解峰，猪圆环病毒3型有2个熔解峰，猪圆环病毒2型的熔解温度较低为85.5℃，猪圆环病毒1型的熔解温度较低为87.7℃。
实验例
临床样本的检测
1、从鸡场采集的淋巴结、脾脏等23份样品，用天根核酸自动抽取仪提取DNA，使用takara的Premix Extaq进行扩增，以DNA作为模板，采用实施例2建立的PCR-HRM检测方法进行检测，M:DL2000Mark；1:PCV1；2:PCV2；3:PCV3；4:CSFV；5:PRRSV；6:PRV；7:PPV；8:阴性对照l；结果如图3所示，说明PCV1、PCV2、PCV3、而其它样品均未出现电泳条带，表明所设计的引物特异性高适合用于HRM分析。
2、对23份临床样品进行检测，圆环病毒1型、2型、3型标准样品临床样品HRM标准化熔解曲线参阅图4，对圆环病毒1型、2型、3型标准样品临床样品HRM峰型化熔解曲线参阅图5，结果表面18份为PCV2,3份为PCV3,2份为PCV2和PCV3的混合感染，没有检测出PCV1。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州维佰生物科技有限公司
<120> 快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测引物、试剂盒及方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Porcine circovirus
<400> 1
gttgcvgagm aghtccctg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Porcine circovirus
<400> 2
ccattgtaac catcccacca 20

Claims (7)

1.一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：
上游引物P1：5’-GTTGCVGAGMAGHTCCCTG-3’(SEQ ID NO：1)；
下游引物P2：5’-CCATTGTAACCATCCCACCA-3’(SEQ ID NO：2)。
2.一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的HRM检测引物。
3.一种快速鉴别猪圆环病毒1型、2型和3型的HRM检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从样品中提取病毒核酸；
2)以核酸为模板，利用权利要求1所述的引物对P1和P2以及荧光饱和染料，进行PCR扩增反应获得扩增产物；
3)对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型；上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR扩增的反应体系为：
加ddH2O补至20ul。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR扩增反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸10min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3)HRM分析过程中，80℃到95℃以每0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3)中HRM分析的具体分析过程为：在80～95℃熔解温度范围内，若待检测样品熔解曲线有两个熔解峰，则判定待检测样品为猪圆环病毒3型；如果若待检测样品熔解曲线在85～86℃出现一个熔解峰时，则判定待检测样品为猪圆环病毒2型；如果若待检测样品熔解曲线在87～88℃出现一个熔解峰时，则判定待检测样品为猪圆环病毒1型。
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