CN108796124A

CN108796124A - 一种快速区分pcv1、pcv2和pcv3的多重pcr检测引物组及试剂盒

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Publication number: CN108796124A
Application number: CN201810493756.2A
Authority: CN
Inventors: 秦毅斌; 卢冰霞; 赵武; 刘磊; 何颖; 陈忠伟; 段群棚; 周英宁; 李斌; 梁家幸; 苏乾莲; 闭炳芬; 蒋冬福; 卢敬专; 李茂宁; 侯韶毅
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2018-05-22
Publication date: 2018-11-13

Abstract

本发明公开了一种快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组及试剂盒，本发明属于动物病毒学和分子生物学技术领域。该试剂盒包括SEQ ID1~6所示的引物序列，还包括了2×F8 Fastlong PCR MasterMix、cDNA模板和灭菌水。本发明提供的PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒采用多重PCR扩增，三种病变相似且同为DNA病毒的病毒一次检测，检测总时间控制在2小时左右，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。

Description

一种快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于动物病毒学和分子生物学技术领域，具体为针对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型一步法三重PCR的检测引物组、检测试剂盒及应用。

背景技术

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）为一种共价闭合、单股环状DNA病毒，是迄今发现最小动物病毒。2015年前，全球范围内仅发现PCV1和PCV2两个基因型。其中，PCV1被认为是猪肾细胞PK-15污染物，但不产生细胞病变效应，对猪无致病性。PCV2能引起猪圆环病毒相关疾病（PCVAD），主要有断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎和肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、增生性坏死性肺炎（PNP）和肠炎等。临床上PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪肺炎支原体(M. hyo)等病原体混合感染。同时，感染PCV2后还容易继发细菌感染，给养猪业造成巨大经济损失。近年来PCV2流行毒株由PCV2a向PCV2b，继而向PCV2d的转变，病毒的致病力逐渐变强，对养猪业的危害加重。

2015年6月，美国北卡罗来纳州某商品化猪场暴发PDNS疫情。患病母猪厌食、皮肤呈现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，所产胎儿(包括弱胎、死胎、木乃伊胎)具有相似临床症状。Palinski等借助新一代测序(NGS)技术，从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定出一种新病毒，该病毒与圆环病毒科病毒具有类似基因组结构和遗传相似性，但与其他圆环病毒衣壳蛋自氨基酸序列同源性低于70%，根据国际病毒分类委员会(ICTV)圆环病毒分类标准圈，将其归类为一种新型圆环病毒，命名为PCV3。作为新动物病原体，PCV3对猪致病性和在PCVAD中作用以及现有商品化PCV2疫苗对其免疫效果等有待进一步研究。目前已有PCV3在美国、韩国、巴西、意大利、波兰以及中国的华南、华中和华北多省市流行。

自20世纪90年代以来，PCV2便一直威胁着养猪业的发展，且近年来PCV2逐渐呈现出多亚型共同流行的趋势，使PCV2防控更加困难。同时，PCV3的出现使猪圆环病毒病更加复杂化。PCV1虽然不产生病变,但广泛存在于猪体内及猪的传代细胞中，其存在可能会影响PCV2和PCV3的增殖及致病性。因此，研究建立一种特异、快速的PCV1/2/3多重PCR检测方法，了解PCV1/2/3的流行情况，从而有效防控猪圆环病毒病的发生与流行，具有重要现实意义。

发明内容

本发明的目的是解决上述技术问题，提供一种快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组及试剂盒，该试剂盒能够快速区分PCV1、PCV2和PCV3，灵敏感高、特异性强，从而有效防控猪圆环病毒病的发生和流行。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组，所述多重PCR检测引物组包括PCV1检测引物组、PCV2检测引物组和PCV3检测引物组；

所述PCV1检测引物组由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成；

所述PCV2检测引物组由具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO:4 所示核苷酸序列的下游引物组成；

所述PCV3检测引物组由具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO:6 所示核苷酸序列的下游引物组成。

优选的，所述PCV1检测引物组是依据PCV1的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为409 bp；所述PCV2检测引物组是依据PCV2的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为1173 bp；所述PCV3检测引物组是依据PCV3的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为669 bp。

优选的，所述多重PCR检测引物组的退火温度为56.1℃。

优选的，所述多重PCR检测引物组在制备猪圆环病毒分型检测试剂盒的应用。

本发明提供一种如以上所述快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒，包括具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQID NO:2、SEQ ID NO:4 和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的下游引物。

优选的，还包括2×F8 Fastlong PCR MasterMix、cDNA模板和灭菌水。

优选的，所述的多重PCR检测试剂盒中PCR反应条件为：94℃预变性2 min；94℃变性10 s，56.1℃复性10 s，72℃延伸10 s，30个循环；最后72℃延伸3 min。

优选的，所述PCR检测试剂盒的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物使用浓度为25 μmol/L。

本发明的有益效果为：

本发明提供的PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒采用多重PCR扩增，三种病变相似且同为DNA病毒的病毒一次检测，检测总时间控制在2小时左右，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本发明能彻底解决PCV1、PCV2和PCV3引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场快速检测，亦适用于流行病学调查。

本发明提供了三对针对PCV1、PCV2和PCV3的特异性引物组，PCV1-P1/PCV1-P2为猪圆环病毒1型特异性扩增引物组，PCV2-P1/PCV2-P2为猪圆环病毒2型特异性扩增引物组，PCV3-P1/PCV3-P2为猪圆环病毒3型特异性扩增引物组，利用其制成的多重试剂盒能快速、特异的检测出猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型中的单一病毒以及三者的混合病毒，猪圆环病毒1型出现409bp一个条带，猪圆环病毒2型出现1173bp一个条带，猪圆环病毒3型出现669bp一个条带，猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型两种病毒混合样品出现409bp 、1173bp、669bp三个条带。

本发明的PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒对PCV1、PCV2、PCV3的检测极限分别为1.10×10^-5µg/μL、1.37×10^-5µg/μL和3.67×10^-6µg/μL，表明本发明的猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型和3型的多重PCR检测试剂盒在检测猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、3型时具有较高的灵敏度。本发明的PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒既能缩短诊断时间、节约诊断试剂，又能降低使用成本。

本发明提供的PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒在6个月内检测结果一致，表明本发明PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒具有很高的稳定性。田间试验证明本发明所得的PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒实用性和适用性良好。

附图说明

图1是本发明试剂盒目的基因的PCR扩增结果，其中M：DNA分子质量标准；1：PCV1、PCV2、PCV3三阳性组织样本；2：PCV1阳性组织样本；3：PCV2阳性组织样本；4：PCV3阳性组织样本；5：阴性对照。

图2是本发明试剂盒PCR的不同退火温度结果，其中M：DNA分子质量标准；1：50.0℃；2：50.7℃；3：51.9℃；4：53.8℃；5：56.1℃；6：58.0℃；7：59.2℃；8：60.0℃。

图3是本发明试剂盒多重PCR的敏感性试验结果，其中M：DNA分子质量标准；

1：1.10×10⁰µg/µL、1.37×10⁰ µg/µL和3.67×10⁰ µg/µL；

2：1.10×10^-1µg/µL、1.37×10^-1 µg/µL和3.67×10^-1 µg/µL；

3：1.10×10^-2µg/µL、1.37×10^-2µg/µL和3.67×10^-2 µg/µL；

4：1.10×10^-3µg/µL、1.37×10^-3 µg/µL和3.67×10^-3 µg/µL；

5：1.10×10^-4µg/µL、1.37×10^-4 µg/µL和3.67×10^-4 µg/µL；

6：1.10×10^-5µg/µL、1.37×10^-5 µg/µL和3.67×10^-5 µg/µL；

7：1.10×10^-6µg/µL、1.37×10^-6 µg/µL和3.67×10^-6 µg/µL；

8：1.10×10^-7µg/µL、1.37×10^-7µg/µL和3.67×10^-7 µg/µL。

图4是本发明试剂盒多重PCR的特异性试验结果，其中M：DNA分子质量标准；1：PCV1、PCV2、PCV3三阳性组织样本；2：PCV1阳性组织样本；3：PCV2阳性组织样本；4：PCV3阳性组织样本；5：猪细小病毒；6：猪伪狂犬病毒；7：大肠杆菌；8：金黄色葡萄球菌；9：副猪嗜血杆菌；10：胸膜肺炎放线杆菌；11：阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1 材料与方法

1.1 病毒及临床样品

猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒（PRV）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌毒株或菌株均由本实验室保存提供。临床样品采自广西各地养猪场疑似感染圆环病毒的濒死猪、病死猪或剖杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏和肾脏等），剪取组织样品约0.5g～1.0g，置于灭菌研钵中，充分研磨成匀浆，加入灭菌的1mol/LPBS溶液配成1：5乳悬液，反复冻融3次。10 000 r/min离心5min，收集上清液，转入1.5mL离心管中编号供DNA抽提或者-20℃保存备用。

1.2 主要试剂

pMD18-T Vector、BamHⅠ、HindⅢ、DL600 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、DNA凝胶回收试剂盒（DNA Gel Extraction Kit）均为大连宝生物工程有限公司产品；2×F8 FastlongPCR MasterMix为北京艾德莱生物科技公司产品；病毒基因组DNA/RNA快速抽提试剂盒为Axygen生物科技有限公司产品；质粒小量抽提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；E.coli DH5α菌种，由本实验室保存。

1.3 引物的设计与合成

根据GenBank上登录的PCV1、PCV2和PCV3的全基因组序列，利用Meg Align(DNA Star)，Primer Premier 7.0 软件针对PCV1、PCV2和PCV3的保守区域分别设计一对特异性引物PCV1-P1/ PCV1-P2、PCV2-P1/ PCV2-P2和PCV3-P1/PCV3-P2。PCV1上游引物PCV1-P1： 5’-GGAACCGACCAGCAGAATAAA-3’ ，PCV1下游引物PCV1-P2：5’-CCCAAGGTAACCAGCCATAAA -3’，PCR扩增目的片段大小为409bp。PCV2上游引物PCV2-P1：5’-CGCGGATCCAATTTCCGCGGGCTGGCTG-3’，PCV2下游引物PCV2-P2：5’-CCCAAGCTTCCCGCCACCGTTACCGCTG-3’，PCR扩增目的片段大小为1173bp。PCV3上游引物PCV3-P1：5’-CGCGGATCCTTTTCACTTAGAGAACGGACTTG-3’；PCV3下游引物PCV3-P2：5’-CCGGAATTCTGAGACACAGAGCTATATTCAG-3’，PCR扩增目的片段大小为669bp。引物由大连宝生物工程有限公司合成。

1.4病毒/细菌DNA的提取

将PRV、PPV 病毒液、大肠杆菌菌液、金黄色葡萄球菌菌液、副嗜血杆菌菌液、胸膜肺炎放线杆菌菌液及处理好的组织病料，按照AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA MiniprepKit使用说明书进行DNA提取，所获得的DNA 用于下一步的PCR反应。

1.5聚合酶链式反应（PCR）

PCR反应体系25 µL，灭菌水6.5 µL，2×F8 Fastlong PCR MasterMix 12.5 µL，25 µmol/L PCV1、PCV2和PCV3上下游引物各0.5 µL，模板3.0 µL。按照下列条件进行扩增：94℃预变性2 min；94℃变性10 s，56.1℃复性10 s，72℃延伸10 s，30个循环；最后72℃延伸3min，PCR总反应时间约为50分钟。取扩增产物10 µL于10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，并观察结果。

1.6 特异性试验

以提取的猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌DNA以及PCV1、PCV2 、PCV3、PCV1/PCV2/PCV3混合阳性材料DNA为模板，用所建立的方法进行扩增，以验证该方法的特异性。

1.7 敏感性试验

1.7.1 PCV1、PCV2、PCV3阳性模板的制备

将PCV1、PCV2和PCV3 PCR产物进行胶回收纯化后，克隆至pMD18-T vector中，转化DH5a感受态细胞中，取100 µL菌液均匀的涂布于LA平板上，12-18 h后挑阳性菌落进LA液体培养基进行扩大培养，抽提质粒并酶切鉴定正确后，将阳性菌液送往上海生物工程有限公司测序，将测序结果放在NCBI上进行Blast确定为PCV1、PCV2和PCV3特异性片段。最后，测定阳性质粒浓度，按照1：1：1将三种质粒混合。

1.7.2 多重PCR敏感性试验

将经测定并混合后的三种质粒做连续10倍系列稀释后，将各稀释后的不同浓度的混合质粒作为PCR反应模板，在相同条件下进行PCR反应，测定所建立的多重 PCR检测方法的敏感性。

1.8 多重PCR重复性试验

以建立的多重PCR检测方法，对PCV1、PCV2和PCV3三阳性样品重复检测3次，以验证结果的可靠性。

2 结果

2.1 PCR扩增

以PCV1阳性DNA、PCV2阳性DNA、PCV3阳性DNA、PCV1、PCV2及PCV3阳性混合DNA为模板，按照1.5中的反应体系和反应程序进行多重PCR反应。电泳结果显示（见图1），所建立的多重PCR方法能够检测出PCV1阳性、PCV2阳性、PCV3阳性及PCV1/PCV2/PCV3三阳性材料，扩增出PCV1目的基因约409 bp，扩增出PCV2目的基因约1173 bp，扩增出PCV3目的基因约669 bp，均与预期目的片段大小相符。

2.2 最佳退火温度

为获得该反应最佳扩增效果，在50-60℃的温度范围内设8个温度梯度进行多重PCR扩增，发现56.1℃时三个条带均最明显，确定了最佳退火温度为56.1℃（见图2）。

2.3 敏感性试验

经测定pMD18-T-PCV1、pMD18-T-PCV2和pMD18-T-PCV3质粒的浓度分别为3.3×10⁰µg/µL、4.1×10⁰µg/µL和1.1×10 µg/µL，将三种质粒按照1：1：1进行混匀，混匀后三种质粒的浓度分别为1.10×10⁰µg/µL、1.37×10⁰ µg/µL和3.67×10⁰ µg/µL。将混合后的质粒作为起始浓度进行连续10倍稀释，然后按照建立的PCR方法进行检测。结果显示，该多重PCR检测方法对PCV1、PCV2、PCV3的检测极限分别为1.10×10^-5µg/μL、1.37×10^-5µg/μL和3.67×10^-6µg/μL（见图3）。

2.4 特异性试验结果

试验结果显示（见图4），本研究建立的PCR鉴别诊断方法能特异地检测出PCV1、PCV2、PCV3或者同时检测出PCV1、PCV2和PCV3，而对猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的检测结果均无条带，表明所建立的方法具有较好的特异性。

2.5多重PCR重复性试验结果

以建立的多重PCR检测方法，重复3次，结果在409bp，1173 bp和669bp处，均得到了清晰可见的目的条带，说明建立的多重PCR检测方法具有很好的稳定性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 一种快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组及试剂盒

<141> 2018-05-22

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 1

ggaaccgacc agcagaataa a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 2

cccaaggtaa ccagccataa a 21

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 3

cgcggatcca atttccgcgg gctggctg 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 4

cccaagcttc ccgccaccgt taccgctg 28

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 5

cgcggatcct tttcacttag agaacggact tg 32

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 6

ccggaattct gagacacaga gctatattca g 31

Claims

1.一种快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述多重PCR检测引物组包括PCV1检测引物组、PCV2检测引物组和PCV3检测引物组；

2.根据权利要求1所述快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述PCV1检测引物组是依据PCV1的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为409bp；所述PCV2检测引物组是依据PCV2的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为1173 bp；所述PCV3检测引物组是依据PCV3的全基因保守区域进行设计，扩增的目的片段大小为669 bp。

3.根据权利要求1所述快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述多重PCR检测引物组的退火温度为56.1℃。

4.根据权利要求1所述快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述多重PCR检测引物组在制备猪圆环病毒分型检测试剂盒的应用。

5.一种如权利要求1所述快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4 和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的下游引物。

6.根据权利要求5所述快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括2×F8 Fastlong PCR MasterMix、cDNA模板和灭菌水。

7.根据权利要求5或6所述快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR检测试剂盒中PCR反应条件为：94℃预变性2 min；94℃变性10 s，56.1℃复性10 s，72℃延伸10 s，30个循环；最后72℃延伸3 min。

8.根据权利要求5或6所述快速区分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示引物使用浓度为25 μmol/L。