CN103255230B - 一管pcr式鉴别i型鸭肝炎病毒和新i型鸭肝炎病毒的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种一管PCR式鉴别I型鸭肝炎(DHV-1A)和新I型鸭肝炎(DHV-1C)病毒的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明，其中所述引物为SEQ ID NOs：1-3。本发明的试剂盒适合鉴定鸭的肝、脾和肾脏组织样品、泄殖腔棉拭子、鸭或鸡胚尿囊液以及细胞培养物中的DHV-1A和DHV-1C病毒。

Description

一管PCR式鉴别I型鸭肝炎病毒和新I型鸭肝炎病毒的试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一管PCR式鉴别I型鸭肝炎病毒和新I型鸭肝炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明，其中所述引物为SEQ ID NOs：1-3。本发明还提供SEQ ID NOs：1-3所示的引物在制备一管PCR式鉴别I型鸭肝炎病毒DHV-1A和新I型鸭肝炎病毒DHV-1C的试剂盒中的应用。

背景技术

I型鸭病毒性肝炎是由I型鸭病毒性肝炎病毒(duck hepatitis virusserotype I，DHV-I)引起雏鸭的一种急性高度致死性传染病(Levine andFabricant，1950.)。传统的I型鸭肝炎病毒(DHV-1A)属小RNA病毒科(Picornaviridae)，其病毒核衣壳为对称的二十面体，无囊膜，无血凝性，直径大小为20-40nm。1994年Kim等在韩国发现一种新I型鸭肝炎病毒，命名为DHV-1C，并报道了此新I型鸭肝炎病毒基因序列，分析结果表明DHV-1A与DHV-1C属于同一个病毒属的不同血清型，同源性为68.5％-73.2％(Kim et al.，2007)。目前，只有我国和韩国有DHV-1C的报道，其他国家和地区未有报道。DHV-1A与DHV-1C都由5′非编码区(5′UTR)、一个大的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)、3′非编码区(3′UTR)和Poly(A)尾巴组成，ORF编码一个多聚蛋白。该蛋白在病毒包装过程中，裂解为结构蛋白VP0、VP1、VP3和非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D(Kim et al.，2006)。我国I型鸭肝炎病毒主要是DHV-1A和DHV-1C型；I型鸭肝炎病毒能够在10日龄鸡胚和12日龄鸭胚中生长繁殖；病毒还可通过鸡胚和鸭胚成纤维细胞和肝细胞进行培养。

鸭群发生DHV-1A和DHV-1C感染后临床症状表现极其相似，突然倒地死亡，呈脚弓反张；由于临床上无法依据鸭群之死亡率、病程、临床症状、剖检之肉眼病变与显微病变区别DHV-1A与DHV-1C的感染。目前其他检测方法则为多重PCR或定量PCR，成本高，费时，不适合临床应用。并且，临床上经常会遇到DHV-1A与DHV-1C的混合感染，为此急需建立一种简便、快捷的一管PCR病原检测技术，适合基层的实际需要。本研究室团队在DHV-1A与DHV-1C的研究方面拥有先进技术储备，在国内处于领先地位。

本研究在引物设计过程中充分考虑了引物的普适性，包括了GenBank中所有的国家和地区的代表性毒株。例如，DHV-1A型病毒包括了美国、英国、韩国、中国和台湾地区，病毒分离株时间跨度为45年(1955年-2010年)。由于GenBank DHV-1C型病毒只有中国和韩国报道毒株，选取了最早和最新分离毒株，时间跨度为2003年至2010年间的代表性毒株。DHV-1A和DHV-1C的5’非编码区分别为626bp和652bp(Kim et al.，2006；2007)。DHV-1A和DHV-1C的5’非编码区具有I型鸭肝炎病毒普遍存在的高度保守区，和针对不同型病毒特异性保守区；根据GenBank收录的DHV-1A和DHV-1C的5‘UTR保守区(见图1、图2、图3)，设计合成了3个特异性引物。其中上游引物依据DHV-1A和DHV-1C高度保守区设计了DHV-1A和DHV-1C的通用引物DHF：GGAGGTGGTGCTGAAATAT(图1)，该引物对于DHV-1A和DHV-1C毒株高度保守，因此适合DHV-1A和DHV-1C的扩增；并根据DHV-1A和DHV-1C各自毒株序列的特异性分别合成了各自的下游特异性引物：DHV-1A的下游引物为DHV-1AR：CATGTGCCTGGACAGAT(图2)，该引物对于DHV-1A高度保守，对于DHV-1C则高度变异，因此，该引物只适合DHV-1A的扩增，对于DHV-1C毒株则无法扩增；DHV-1C  的下游引物为DHV-1CR：GTGTGGATCAAAGGGGT(图3)，该引物对于DHV-1C毒株完全保守，但是，对于DHV-1A毒株则高度不保守，不能扩增DHV-1A毒株。

发明内容

本发明的目的是通过一管PCR来鉴别I型鸭肝炎病毒(DHV-1A)和新I型鸭肝炎病毒(DHV-1C)。

为实现上述目的，本发明提供一种一管PCR式鉴别I型鸭肝炎病毒(DHV-1A)和新I型鸭肝炎病毒(DHV-1C)的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明。

在本发明的试剂盒中，所用的引物是利用DHV-1A和DHV-1C的5’非编码区进行设计的，其上游引物是通用的，下游引物是针对不同类型的毒株本身的特异性保守区进行设计的。一些DHV-1A毒株和DHV-1C毒株的5’非编码区的序列参见SEQ ID NOs：4-21。具体地，本发明的试剂盒共包含三条引物：上游通用引物SEQ ID NO：1，对I型鸭肝炎病毒DHV-1A特异性的下游引物SEQ ID NO：2和对新I型鸭肝炎病毒DHV-1C特异性的下游引物SEQID NO：3。

在本发明的试剂盒中，所用的处理待检样品的试剂主要是RNA提取试剂和反转录试剂。一般地，待检样品可以为待检鸭的肝脏、脾脏、棉拭子、鸭或鸡尿囊液以及细胞培养物。本领域技术人员可以根据所用的待检样品选择适当的RNA提取试剂和RNA提取方法，以及适合的反转录试剂，这是在本领域技术人员的能力范围之内的。例如，常用的RNA提取方法是通常采用市售小量病毒RNA提取试剂盒进行。RNA的反转录也可以利用市售的反转录反应体系(例如，购自大连Takara Co.)进行，获得cDNA。

将待检样品提取RNA，反转录后获得样品cDNA，将3个引物连同获得的样品cDNA放在同一个PCR管中，加入适量的PCR试剂，通过一次PCR，最后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色显现PCR产物。根据PCR产物的大小即可判断是否为I型鸭肝炎病毒感染，并区分感染的类型是DHV-1A还是DHV-1C。具体地，没有200bp和300bp的特异性扩增结果表示没有I型鸭肝炎病毒的感染，扩增产物为200bp表示是DHV-1A型病毒感染，扩增产物为300bp表示是DHV-1C型病毒感染，扩增产物200bp和300bp都有表示是DHV-1A和DHV-1C型病毒共感染。

表1.引物设计所用GenBank中的毒株信息

表2.一管PCR式鉴别I型鸭肝炎病毒(DHV-1A)和新I型鸭肝炎病毒 (DHV-1C)的引物序列

名称	序列
		DHVF	GGAGGTGGTGCTGAAATAT(SEQ ID NO：1)
DHV-1AR	CATGTGCCTGGACAGAT(SEQ ID NO：2)
		DHV-1CR	GTGTGGATCAAAGGGGT(SEQ ID NO：3)

所述一管PCR的扩增条件为94℃，3min；94℃40s，55℃30s，72℃30s，25个循环；72℃，7min。

相应地，本发明还提供一种一管PCR式鉴别I型鸭肝炎病毒(DHV-1A)和新I型鸭肝炎病毒(DHV-1C)的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)从待检鸭获取待检样品，并对待检样品提取RNA，反转录获得cDNA；

(2)将步骤(1)获得的待检样品的cDNA与三种引物SEQ ID NOs：1-3一起以适量放置在一个PCR管中，进行PCR反应；和

(3)电泳检测PCR产物，并根据PCR产物鉴别I型鸭肝炎病毒(DHV-1A)和新I型鸭肝炎病毒(DHV-1C)。

其中，待检样品可以为待检鸭的肝脏、脾脏、棉拭子、鸭或鸡尿囊液以及细胞培养物。

步骤(2)的一管PCR的扩增条件为：94℃，3min；94℃40s，55℃30s，72℃30s，25个循环；最后72℃，7min。

步骤(3)所述的PCR鉴别方法为：进行一次PCR反应，反应结束后进行PCR样品凝胶电泳，紫外灯下观察电泳胶的特异DNA条带(图4)。DHV-1A阳性对照在约200bp处有一条特异的DNA条带(图4中泳带1，2和8)，DHV-1C阳性对照在约300bp处有一条特异的DNA条带(图1中泳带3，5和6)，阴性对照则无相应的特异条带出现(图4中泳带10)，待检样品在200bp和300bp相应的位置出现特异性条带则判定分别为DHV-1A和DHV-1C感染；如果200bp和300bp相应的位置都出现特异性条带则判定DHV-1A和DHV-1C共感染(图4中泳带4，7和9)。

本发明还提供SEQ ID NOs：1-3所示的引物在制备一管PCR式鉴别I型鸭肝炎病毒DHV-1A和新I型鸭肝炎病毒DHV-1C的试剂盒中的应用。

由此可见，本发明的优点是：提供了一种一管PCR式鉴别I型鸭肝炎病毒(DHV-1A)和新I型鸭肝炎病毒(DHV-1C)的的试剂盒方法，该鉴别诊断方法具有快速、灵敏、特异、经济和适用范围广的特点。具体地，一方面，只需合成3个引物，上游引物为通用引物；另一方面，只需一管一次PCR反应，2小时后，即可判定是否为DHV-1感染，以及感染的类型是DHV-1A还是DHV-1C型，无需多次重复PCR反应，经济。再一方面，可从肝脏、脾脏、肾、棉拭子、鸭/鸡胚尿囊液以及细胞培养物中鉴定DHV-1，范围广。

附图说明

图1显示DHV1A和DHV1C毒株5’UTR共有序列分析，阴影部分为DHV1A和DHV1C毒株通用引物DHVF序列。

图2显示DHV-1A毒株5’UTR共有序列分析，阴影部分为DHV-1A特异性下游引物DHV-1AR序列选择区。

图3显示DHV-1C毒株5’UTR共有序列分析，阴影部分为DHV-1C特异性下游引物DHV-1CR序列选择区。

图4显示DHV-1A与DHV-1C型鸭肝炎病毒PCR扩增结果，M：50bpDNALadder；泳带1、2和8：DHV-1A；泳带3、5和6：DHV-1C；泳带4、7和9：DHV-1A和DHV-1C，泳带10：阴性对照。

具体实施方式

以下通过具体实施例描述本发明，然而，本领域技术人员应该理解，所述实施例仅是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围。

除非另外说明，下述实施例中用到的试剂均为市售试剂。实施例1：一管PCR式鉴别I型鸭肝炎病毒(DHV-1A)和新I型鸭肝炎

病毒(DHV-1C)

1.被检样品的处理

选用鸭肝脏、脾脏、肾、棉拭子、鸭/鸡胚尿囊液以及细胞培养物，被检样品应新鲜(采集样品后立即检测)，或-20℃保存。3g肝脏、脾脏或肾样品加入3倍体积的PBS研磨成悬浮液，冻融3次，1000g离心10分钟，取上清用于RNA的提取；棉拭子反复捻动后去拭子，样品1000g离心10分钟，取上清用于RNA的提取；鸭/鸡胚尿囊液以及细胞培养物直接用于RNA的提取。

阴性样品：选取健康10日龄鸡胚或13日龄鸭胚尿囊液。阳性样品：DHV-1A和DHV-1C病毒接种鸡胚或鸭胚收取的尿囊液。

2.样品RNA的提取：

按小量病毒RNA提取试剂盒(购自上海华舜生物技术有限公司)说明书进行。在经DEPC水处理的1.5mL离心管中加入250μL处理过的被检样品液体和750μL异丙醇，用移液器充分混匀，取600μL至吸附柱中，900g离心1min。加入600μL W3液，离心1min，加入250μL W3液，静置1min后，离心2min。将吸附柱移入干净的1.5ml离心管中，吸附膜中加入25μL纯水，离心2min。置于-80℃保存备用。

3.反转录cDNA样品的制备：

反转录反应体系采用AMV(购自TaKaRa Co，大连)：在1.5ml灭菌PCR管中依次加入模板RNA 5μL，5×buffer 4μL，dNTPs 2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，随机引物0.5μL，AMV 1μL，加DEPC水至20μL。混匀后，室温下静置10min，42℃保温1h，冰浴2min。反转录产物直接用于PCR扩增或置于-20℃下保存。

4.一管PCR反应鉴定DHV-1A和DHV-1C

PCR反应所需引物(均由哈尔滨博士生物技术公司合成)：

上游通用引物DHVF：GGAGGTGGTGCTGAAATAT(SEQ ID NO：1)；

DHV-1A特异性下游引物DHV-1AR：CATGTGCCTGGACAGAT(SEQID NO：2)；

DHV-1C特异性下游引物DHV-1CR：GTGTGGATCAAAGGGGT(SEQID NO：3)。

PCR反应体系：在0.5ml PCR管中一次加入双蒸水15.8μL，上述流程3得到的cDNA 3μL，10×buffer 2μL，dNTPs1μL，引物DHVF、DHV-1AR和DHV-1CR各1μL，Ex-Taq酶0.2μL。

PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性40s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃延伸7min。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，同时加入100bpDNA标准分子量作为参照，取凝胶置于紫外灯下观察。结果判定：DHV-1A和DHV-1C阳性对照分别在约200bp和300bp处各有一条特异的DNA条带，阴性对照则无相应的特异条带出现，待检样品在200bp相应位置出现特异条带则判定分别为DHV-1A感染，待检样品在300bp相应的位置出现特异性条带则判定为DHV-1C感染；如果待检样品在200bp和300bp相应的位置都出现特异性条带则判定DHV-1A和DHV-1C共感染；如果待检样品在200bp和300bp没有相应的条带则证明无DHV-1A和DHV-1C感染。

5.进一步验证：

将获得的样品200bp和300bpPCR产物进行胶回收后进行测序(胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司)，将序列提交GenBank进行BLAST比较分析。BLAST结果显示：200bp和300bpPCR产物序列分别与GenBank中的DHV-1A和DHV-1C序列的同源性最高，进一步验证检测结果的正确性。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

参考文献

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2.Kim，M.C.，Kwon，Y.K.，Joh，S.J.，Kim，S.J.，Tolf，C.，Kim，J.H.，Sung，H.W.，Lindberg，A.M.，Kwon，J.H.，2007b.Recent Korean isolates of duckhepatitis virus revealthe presence of a new geno-and serotype when comparedto duck hepatitisvirus type 1type strains.Arch.Virol.152，2059-2072.

3.Kim，M.C.，Kwon，Y.K.，Joh，S.J.，Lindberg，A.M.，Kwon，J.H.，Kim，J.H.，Kim，S.J.，2006.Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1reveals anovel lineage closeto the genus Parechovirus in the family Picornaviridae.J.Gen.Virol.87，3307-3316.

Claims (10)

1.一管PCR式鉴别I型鸭肝炎病毒DHV-1A和新I型鸭肝炎病毒DHV-1C的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明，其中所述引物为SEQ ID NOs：1-3。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述待检样品为待检鸭的肝脏、脾脏、棉拭子、鸭或鸡胚尿囊液以及细胞培养物。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述处理待检样品的试剂是RNA提取试剂和反转录试剂。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中SEQ ID NO：1为关于I型鸭肝炎病毒DHV-1A和新I型鸭肝炎病毒DHV-1C通用的上游引物，SEQ IDNO：2为对I型鸭肝炎病毒DHV-1A特异性的下游引物，SEQ ID NO：3为对新I型鸭肝炎病毒DHV-1C特异性的下游引物。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中在使用时包括下述步骤：

(1)从待检鸭肝脏、脾脏、棉拭子、鸭或鸡胚尿囊液以及细胞培养物获取待检样品，并对待检样品提取RNA并反转录获得cDNA；

(2)将步骤(1)获得的待检样品的cDNA与三种引物SEQ ID NOs：1-3一起以适量放置在一个PCR管中，进行PCR反应；和

(3)电泳检测PCR产物，并根据PCR产物大小鉴别I型鸭肝炎病毒DHV-1A和新I型鸭肝炎病毒DHV-1C，

其中200bp的特异性DNA条带表示待检样品中存在I型鸭肝炎病毒DHV-1A，300bp的特异性DNA条带表示待检样品中存在新I型鸭肝炎病毒DHV-1C，同时存在200bp和300bp的条带表示待检样品中同时存在I型鸭肝炎病毒DHV-1A和新I型鸭肝炎病毒DHV-1C。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中PCR反应程序为：94℃，3min；94℃40s，55℃30s，72℃30s，25个循环；最后72℃，7min。

7.SEQ ID NOs：1-3所示的引物在制备一管PCR式鉴别I型鸭肝炎病毒DHV-1A和新I型鸭肝炎病毒DHV-1C的试剂盒中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其中所述试剂盒按下述步骤进行鉴别：

(1)从待检鸭获取待检样品，并对待检样品提取RNA并反转录获得cDNA；

(2)将步骤(1)获得的待检样品的cDNA与三种引物SEQ ID NOs：1-3一起以适量放置在一个PCR管中，进行PCR反应；和

(3)电泳检测PCR产物，并根据PCR产物大小鉴别I型鸭肝炎病毒DHV-1A和新I型鸭肝炎病毒DHV-1C，

其中在步骤(3)电泳检测PCR产物的结果中，200bp的特异性DNA条带表示待检样品中存在I型鸭肝炎病毒DHV-1A，300bp的特异性DNA条带表示待检样品中存在新I型鸭肝炎病毒DHV-1C，同时存在200bp和300bp的条带表示待检样品中同时存在I型鸭肝炎病毒DHV-1A和新I型鸭肝炎病毒DHV-1C。

9.根据权利要求8所述的应用，其中步骤(1)的待检样品取自待检鸭的肝脏、脾脏、棉拭子、鸭或鸡胚尿囊液以及细胞培养物。

10.根据权利要求8所述的应用，其中PCR反应程序为：94℃，3min；94℃40s，55℃30s，72℃30s，25个循环；最后72℃，7min。