CN101294226B

CN101294226B - 一种检测汉坦病毒基因组的rt-pcr法

Info

Publication number: CN101294226B
Application number: CN2008100473565A
Authority: CN
Inventors: 杨占秋; 李晴; 陈文�; 刘婧; 肖红; 付萍
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2008-04-17
Filing date: 2008-04-17
Publication date: 2010-09-01
Anticipated expiration: 2028-04-17
Also published as: CN101294226A

Abstract

本发明公开了一种检测汉坦病毒株基因组的方法，其步骤是：设计两对汉坦病毒通用引物：B、汉坦病毒检测的方法：a、用病毒特异性RNA提取试剂盒提取标本血清总RNA；b、核酸分析仪检测RNA含量，取RNA进行RT-PCR反应；c、RT-PCR：RT使用HV属特异性引物P₀，PCR使用HV通用引物P₁/P₂，P₃/P₄；d、琼脂糖凝胶电泳观察病毒核酸扩增结果，出现一特异性核酸带。本发明直观优越，敏感性好，效果良好，近10年血清的检出率为79.2％，20年前血清的检出率仍可高达70.5％，适用于汉坦病毒感染的实验室检测和分子流行病学调查。

Description

一种检测汉坦病毒基因组的RT-PCR法

技术领域

本发明涉及到病毒检测领域，具体涉及一种检测汉坦病毒(HV)基因组的方法，包括设计了两对新型汉坦病毒通用引物，研究了实验条件，建立了病毒基因组的RT-PCR方法，并对不同年代汉坦病毒血清标本进行了检测。

背景技术

病毒性疾病是一类严重威胁人类健康的传染性疾病，85％以上的传染性疾病由病毒引起，重要病毒危害到国家安全和社会发展。汉坦病毒(Hantaviruses，HV)是肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndromes，HFRS)和汉坦病毒肺综合征(hantavirus pulmonary syndrome，HPS)的病原体，人可通过气溶胶吸入、伤口、消化道等途径感染，被世界卫生组织列为可通过气溶胶传播的生物武器。HFRS/HPS的主要特征是发热、出血肾损害和呼吸衰竭。我国是受汉坦病毒危害最为严重的国家，HFRS患者占世界的90％以上。HFRS是经啮齿类动物传播的急性自然疫源性疾病。HFRS疫区已扩大到全国31个省市，同时疫区类型亦发生改变，80年代前为汉滩型(HTN型)疫区，之后又出现汉城型(SEO型)且两型并存，2003年又报道有普马拉型(PUU型)出现。HV是分节段的负单链RNA病毒，由L、M、S三个片段组成，分别编码RNA聚合酶、外膜糖蛋白(G蛋白，GP1&GP2)和衣壳核蛋白。

常规的诊断检测方法包括病毒的分离鉴定、ELISA法检测血清中抗HV IgM、IgG抗体，IFA法检测病毒抗原和抗体，核酸分子杂交检测病毒基因组等。但经典的分离鉴定法费时，IFA法也不适用于快速的现场检测，检测HV抗体仅是一个侧面的间接指标，用PCR法检测组织和细胞中HV RNA已有报道，并认为这一方法直观优越，但阳性率低，检测保存时间久的血清中病毒RNA的研究也未见报道。为了提高血清中HV的检出率和准确性，本发明设计了两对新引物，建立了一种检测血清中病毒RNA的新方法，用于不同时期血清标本的检测，并得到了优势株病毒基因组。国内外尚未见此新型汉坦病毒通用引物的研究报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种检测汉坦病毒基因组的方法，涉及到所提供RT-PCR的方法在检测血清样本中HV基因组的应用。该法直观优越、敏感性好、特异性高，对检测微量、保存时间久的标本中汉坦病毒基因组的效果良好，可用于汉坦病毒感染的实验室检测和HRFS/HPS的分子流行病学调查。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

A、设计两对新型汉坦病毒通用引物

本发明中所设计的两对新型汉坦病毒通用引物，从GenBank中获得HTV76-118、HTV 84Fli、HTV CUMC、HTV HoJo、HTV HV114、HTV Lee、HTV NC167、SEO Biken-1、SEO HR80-39、SEO KI-83-262、SEO KI-85-1、SEO KI-88-15、SEOL99、SEO R22、SEO SR-11共15株汉坦病毒基因编码氨基酸序列和cDNA序列。将所有氨基酸序列和cDNA序列输入DNASTAR MegAlign软件用Clustal W程序排列，寻找氨基酸序列及对应cDNA序列均保守区域作为引物设计区(见表1)。国内外尚未见此新型汉坦病毒通用引物设计的研究报道。

表1汉坦病毒引物设计

B、汉坦病毒基因组检测的方法

a、用病毒特异性RNA提取试剂盒(Promega公司病毒基因组RNA Kit)提取标本血清总RNA；

b、核酸分析仪检测RNA含量，所有标本RNA OD260/280≥1.9，后取50ngRNA进行RT-PCR反应；

c、RT-PCR：RT使用HV属特异性引物P₀(5’-ATGCAATATGATGAAAAG-3’)，其反应条件为37℃反应60min，93℃5min终止反应，迅速置冰上冷却3min；PCR使用技术方案A中设计的新型HV通用引物(P₁/P₂，P₃/P₄)，其反应条件为94℃预变性3min，94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸5min；

d、1.5％琼脂糖凝胶电泳观察病毒核酸扩增结果，在250bp处出现一条特异性核酸带。

为保证各种亚型HV RNA都能有效地逆转录为cDNA，本研究选用了HV属特异性引物P₀为共同引物，P₁、P₂引物的设计参照相应的病毒核酸序列。为了增强引物的属特异性，申请人在引物P₁的5’端添加了2个碱基。同时考虑到目的基因序列越长，其扩增的敏感性越低，故引物设计时选择了扩增200-300bp短片段的引物，以增加HV RNA检测的阳性率。

为了能进一步增加本法检测HV RNA的敏感性，以用于标本年限跨度比较大的血清标本的研究，因而高效完整地提取RNA是进行RT-PCR反应成功的关键。由于HV RNA极易因为长时间保存而发生降解，且因HV感染后呈一过性病毒血症导致血液标本中的HV RNA含量少，因此，申请人在提取RNA试剂的选择上，选用了专门从液体标本中提取RNA的总RNA提取试剂盒(Promega公司病毒基因组RNA Kit)，该试剂盒基于离子吸附原理可有效地提取液体标本中的总RNA，去除DNA和蛋白质污染；同时又因具备无需低温操作、离心时间短等优点可尽量减少RNA降解和破坏，得到高品质的RNA样品。另外，申请人选用了针对陈旧性标本中RNA含量少，进行逆转录的Sensiscript逆转录酶，该酶能将少于50ng的总RNA高效逆转录为cDNA，且具有RNase H活性，能降解RNA:DNA杂合子中的RNA，为PCR反应提供纯品的cDNA模板。

本发明与现有技术相比，具有下列优点：

1、本发明中所设计的两对新型HV引物针对HV保守序列设计，可扩增出各种型别的汉坦病毒，阳性检出率高，适用于临床检测未知型别的HV样本。

2、本发明中所设计的两对新型HV通用引物片段较短，灵敏度高，减少了HV检测假阴性的可能。

3、本发明中所设计的HV通用引物P1在其5’端添加了2个碱基，增加了检测的属特异性，减少了假阳性的可能。

4、本发明中所确立的HV基因组检测方法，选用了专门针对微量RNA的RNA提取试剂盒和Sensiscript逆转录酶，对年代久远、保存条件较差的HV RNA有亦有良好的检测效果，对20多年前收集的血清依然有较高的检出率，可用于临床、实验室检测以及流行病学研究。

附图说明

图1为本发明检测HV基因组的特异性对照图

M-DNA Marker；1-阴性对照；2～4-HV 76-118；5～8-HV 114；9-CBV3；10-HSV-1；11-ddH2O对照。

图2为本发明检测HV基因组的敏感性对照图

M-DNAMarker；1-阴性对照；2-HV 76-118；3～11-HV 76-118 RNA自0.72μg开始10倍稀释后扩增；12-ddH2O对照。

图3为本发明用于HV陈旧性血清和组织标本的扩增图

M-DNA Marker；1-阴性对照；2-HV 76-118阳性对照；3～4-HV阳性鼠组织；5～6HV阳性血清；7-ddH2O对照。

具体实施方式

实施例1：RT-PCR方法检测HV阳性模板的基因组RNA

A、合成两对新型汉坦病毒通用引物，交由上海生工公司进行：

a、HV P1/P2上游引物为GATTGAAGATATTGAGTCACC，

下游引物为GTTGTATCCCCATTGATTGTG；

b、HV P3/P4上游引物为TGAGAAATGTGTATGACATGA，

下游引物为ACTAGACACTGTTTCAAATGA。

B、汉坦病毒基因组检测的方法：

1、阳性模板的制备

Vero E6细胞按常规培养成单层后，分别接种100TCID₅₀的HV 76-118和HV 114株病毒各1ml，吸附2hr将培养液换为含2％胎牛血清的维持液，CO2培养箱内37℃继续培养。14天后刮取少量细胞，进行HV特异性免疫荧光检测。收获感染细胞，用总RNA提取试剂盒(Promega公司产品)提取感染细胞总RNA作为阳性模板。同时设置阴性对照(正常Vero E6细胞)。

2、RNA的纯度和浓度

分别测量RNA标本在260nm和280nm波长下的光密度值OD260和OD280，通过计算OD260/OD280，确定RNA纯度，结果显示所有RNA标本OD260/OD280≥1.9，表明RNA纯度较高，无DNA和蛋白质污染；同时读取并记录各个RNA样本浓度，取50ng进行RT-PCR反应。

3、RT-PCR反应

取50ng模板RNA，加入200U Sensiscript逆转录酶(Qiagen公司产品)、50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、10mM dNTP Mix1μl、40U RNasin和0.4μg P₀引物，无RNase水补足体积至20μl。充分混匀，短暂离心收集反应液。37℃反应1hr，然后93℃5min终止反应，迅速置冰上冷却，-80℃保存待用。取上述反应cDNA产物5μl，加入总体积50μl的反应体系中，其中含1U Taq DNA聚合酶(Fermentas)、10mM Tris-HCl(PH 8.8)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.5mM dNTPs和特异性引物(HV P1/P2和HV P3/P4)各10pmol。充分混匀后，放入PCR扩增仪反应。循环反应参数为94℃预变性3min，94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸5min。整个实验从RNA提取开始设置阴性对照和阳性对照。

4、琼脂糖凝胶电泳

取5μl PCR扩增产物在含5μg/ml溴化乙啶(EB)的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，5V/cm，40min后紫外透射反射仪上观察结果。

6.RT-PCR方法的特异性

结果显示HTNV 76-118株和HV 114株病毒核酸扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在250bp处出现一条特异性核酸带；而阴性对照扩增产物电泳后未见特异性核酸带；将HV特异性引物分别用于扩增柯萨奇病毒B组3型(CBV3)和单纯疱疹病毒I型(HSV-1)，均未见特异性核酸带(见图1所示)。申请人所设计引物经DNA STAR PrimerSelect软件检测其特异性，结果显示上述两对引物(HV P1/P2和HV P3/P4)对15株HV cDNA序列进行扩增时均只产生一个目的片段产物，无非特异性扩增。

7.RT-PCR方法的敏感性

将200μl HV 76-118株病毒培养液中提取的总RNA在核酸分析仪上进行定量为0.72μg，经10倍系列稀释，本法可检出的最高稀释度为10^-4，即相当于72pg核酸中的病毒RNA(见图2所示)。

实施例2：RT-PCR方法检测陈旧血清标本中HV RNA

432份1985-1989年、1996-2007年HV血清标本RT-PCR检测。由于血清中病毒核酸水平较低，而RNA又极易降解，通常陈旧性血清中病毒RNA检出率极低。本研究通过使用HV新型引物(HV P1/P2和HV P3/P4)对每一份提取的核酸标本进行分管平行扩增。

1、RNA提取

取血清200μl，用总RNA提取试剂盒(Promega公司产品)，按试剂盒说明提取血清总RNA。

2、RNA的纯度和浓度测定

3、RT-PCR反应

取50ng模板RNA，加入200U Sensiscript逆转录酶(Qiagen公司产品)、50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、10mM dNTP Mix1μl、40U RNasin和0.4μg P₀引物，无RNase水补足体积至20μl。充分混匀，短暂离心收集反应液。37℃反应1hr，然后93℃5min终止反应，迅速置冰上冷却，-80℃保存待用。取上述反应cDNA产物5μl，加入总体积50μl的反应体系中，其中含1U Taq DNA聚合酶(Fermentas)、10mM Tris-HCl(PH 8.8)、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、0.5mM dNTPs和特异性引物(HV P₁/P₂和HV P₃/P₄)各10pmol。充分混匀后，放入PCR扩增仪反应。循环反应参数为94℃预变性3min，94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸5min。整个实验从RNA提取开始设置阴性对照和阳性对照。

4、琼脂糖凝胶电泳

取5μl PCR扩增产物在含5μg/ml溴化乙啶(EB)的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，5V/cm，40min后紫外透射反射仪上观察结果。经琼脂糖凝胶电泳可见与相应阳性模板一致的扩增条带(见图3所示)。

5、结果：如表2所示，在432份免疫荧光法检测阳性标本中(免疫荧光检测均为标本收集当年完成)，有318份可经本法扩增得到特异性PCR产物，检出率高达73.6％。其中，近10年(1996-2007年)的血清标本的检出率接近80％(79.2％)，20年前(1985-1989年)陈旧性标本的检出率仍可高达70.5％以上，可见本法对陈旧性血清标本仍有较高检出率。

表2本法用于检测各年度HFRS患者血清的阳性数

实施例3：RT-PCR方法用于流行病学检测鼠肺组织中HV RNA

2002年湖北地区江夏、南漳、蕲春、新洲四县野外收集204份鼠组织标本RT-PCR检测。本研究通过使用HV新型引物(HV P1/P2和HV P3/P4)对每一份提取的核酸标本进行分管平行扩增，扩增获得特异性条带者即为HV感染阳性。

1、RNA提取

野鼠乙醚麻醉后颈椎脱臼处死，取鼠肺组织约20-30mg，匀浆后用总RNA提取试剂盒(Promega公司产品)，按试剂盒说明提取肺组织总RNA。

2、RNA的纯度和浓度测定

3、RT-PCR反应

4、琼脂糖凝胶电泳

5、结果：如表3所示，在204份鼠肺组织标本中，33份经本法扩增得到特异性PCR产物(见表3)。可见，湖北各地区野鼠带毒率高。HV通过咬伤或螨、虱等媒介均可感染人，农民和野外工作者户外劳动时需注意安全防护。本法可作为HV流行病学调查的有力工具。

表3本法用于流行病学检测鼠肺组织HV阳性标本数

SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>一种检测汉坦病毒基因组的RT-PCR法

<130>一种检测汉坦病毒基因组的RT-PCR法

<140>200810047356.5

<141>2008-04-17

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

gattgaagat attgagtcac c 21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

gttgtatccc cattgattgt g 21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

tgagaaatgt gtatgacatg a 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

actagacact gtttcaaatg a 21

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

atgcaatatg atgaaaag 18

Claims

1.一种用于RT-PCR检测汉坦病毒株基因组的的引物试剂盒，其包括RT使用HV属特异性引物P₀5’-ATGCAATATGATGAAAAG-3’，其反应条件为37℃反应60min，93℃5min终止反应，置冰上冷却3min，和PCR使用HV通用引物P1/P2和P3/P4，其反应条件为94℃预变性3min，94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸5min；

所述的HV通用引物P1/P2上游引物为GATTGAAGATATTGAGTCACC，

下游引物为GTTGTATCCCCATTGATTGTG；

HV通用引物P3/P4上游引物为TGAGAAATGTGTATGACATGA，

下游引物为ACTAGACACTGTTTCAAATGA。