CN113046484A - 用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物探针、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物探针、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物和探针、试剂盒及检测方法。本发明提供的引物组可特异、灵敏扩增非洲猪瘟病毒p72基因24个基因型，该检测方法操作简单、快速准确、特异性好、灵敏度高、基因型覆盖全面，不存在漏检的可能性。

Description

用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物探针、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒 p72基因的引物探针组、试剂盒及方法。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种热性、急性、亚急性的猪传染病，对猪有致病性，特征是烈性出血、高热、病理周期短，发病死亡率极高，一旦爆发必然导致整个养猪业损失巨大。
非洲猪瘟病毒是一种直径为200nm的正20面体双链DNA病毒，病毒基因组包含125kb的保守中心区域和2个可变末端，病毒基因组长度的差异与左右可变区的多基因家族成员片段的插入与缺失有关。非洲猪瘟病毒可以编码34种以上的结构蛋白，主要结构蛋白有在细胞吞噬中起作用的P50蛋白，诱导机体产生中和抗体的VP73蛋白，具有高度保守区的VP72蛋白，膜相关蛋白J5R蛋白，免疫调节蛋白A388L和CD2v蛋白。这些病毒表达的蛋白质能使病毒感染的细胞及细胞外病毒颗粒吸附红细胞。而病毒在家猪中传播也是由于CD2v蛋白的表达，同时该蛋白损坏了淋巴细胞的功能。非洲猪瘟病毒基因组庞大复杂，具有明显的遗传多样性。根据编码主要衣壳蛋白p72 的B646L序列，非洲猪瘟病毒可分为24个基因型。由于非洲猪瘟病毒的感染机制极为复杂，基因型多，目前尚未研制出有效的疫苗进行防控，只能通过捕杀患病猪切断传染源，无害化处理，从而控制疫病传播，所以早期的非洲猪瘟病毒检测是防控重点。因此快速、准确的检测技术对预防和控制其传播具有重要意义。目前，国内外报道的非洲猪瘟病毒检测方法主要有常规 PCR、实时荧光PCR和等温扩增RPA和RAA法等。Luo Yuzi等依据非洲猪瘟病毒的vp72基因建立了一种常规PCR检测方法，对来自不同地理区域的 14株非洲猪瘟病毒进行检测，可以覆盖基因II型菌株，Felicity J Haines等建立了RT-qPCR方法，用于同时鉴别诊断猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒，可以对非洲猪瘟病毒vp72基因24个基因型中的8个基因型进行检测。可见，目前现有的方法检测非洲猪瘟病毒的vp72基因不能全部涵盖非洲猪瘟病毒的24个基因型，这样会导致漏检，出现假阴性，且现有方法有些灵敏度低的问题，这也是造成假阴性的一个原因。非洲猪瘟病毒具有随着猪制品国际贸易而跨境传播的极大风险，如何建立涵盖非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72基因24个基因型、灵敏度高的检测方法具有重要的现实意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物和探针、试剂盒及检测方法。该引物组可特异、灵敏扩增非洲猪瘟病毒p72基因24个基因型，该检测方法操作简单、快速准确、特异性好、灵敏度高、基因型覆盖全面，不会存在漏检的可能性。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物和探针，其包括第一组引物对 p72-F1和p72-R1及探针p72-P1，和第二组引物对p72-F2和p72-R2及探针 p72-P2，其中，所述p72-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述p72-R1 的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述p72-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述p72-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述p72-R2 的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述p72-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
一种用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的实时荧光恒温扩增的试剂盒，该试剂盒包括如上所述的引物对和探针，在探针的5’端和3’端分别标记报告基团和淬灭基团。
如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括dNTP Mixture、PCR缓冲液、MgCl2、Taq DNA聚合酶。
如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和空白对照，所述阳性对照为含有核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示序列的阳性质粒，所述空白对照为去核酸的超纯水。
一种用于检测非洲猪瘟病毒p72基因实时荧光qPCR扩增的的检测方法，其包括如下步骤：
S1、从样品中提取DNA；
S2、对步骤S1提取的所述DNA进行实时荧光qPCR扩增；其中，在反应体系中，采用如上所述的用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物和探针组；
S3、结果判定：
若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，则判断为阳性；
若无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45则判断为阴性；
若Ct值在35-45之间，建议重复实验，若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
如上所述的检测方法，优选地，在步骤S2中，探针的5’端和3’端分别标记FAM和BHQ为报告基团和淬灭基团。
如上所述的检测方法，优选地，在步骤S2中，所述实时荧光qPCR的反应体系包括0.1～2.5mmol/L dNTP Mixture、1～5×PCR缓冲液、1.0～2.5mmol/L MgCl2、0.05～0.2U/μL Taq DNA聚合酶、0.2～0.8μmol/L引物对、 0.16～0.28μmol/L探针和DEPC处理水。
进一步地，所述实时荧光qPCR的反应体系为25μL包括含有终浓度为 0.2mmol/LdNTP Mixture、1×PCR缓冲液、2mmol/LMgCl2、0.1U/μLTaq DNA 聚合酶、0.4μmol/L引物对、0.24μmol/L探针。
具体地，实时荧光qPCR扩增的反应体系总体积为25μL，其中，所述反应体系中包括2.5mmol/L dNTP Mixture 2.0μL、5×PCR缓冲液5.0μL、 25mmol/L MgCl22.0μL、5U/μL TaqDNA聚合酶0.5μL、引物组2μL(包括： 10μmol/L正向引物p72-F1 1.0μL、10μmol/L反向引物p72-R1 1.0μL、10μmol/L 探针p72-P1 0.6μL，10μmol/L正向引物p72-F2 1.0μL、10μmol/L反向引物 p72-R2 1.0μL、10μmol/L探针p72-P2 0.6μL)、DEPC处理水7.9μL、样品 DNA模板5.0μL。
如上所述的检测方法，优选地，在步骤S2中，实时荧光qPCR扩增的程序95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，60℃退火延伸30秒，40个循环，在每一循环的60℃时收集FAM荧光信号。
如上所述的检测方法，优选地，在步骤S2中，同时设置以如SEQ ID NO.7 所示序列的质粒体外转录RNA为阳性对照，以去核酸的超纯水为空白对照进行检测。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种用于检测非洲猪瘟病毒p72基因实时荧光qPCR扩增的引物和探针组，可灵敏、特异性的有效用于快速检测非洲猪瘟病毒p72基因24个基因型，能有效避免假阴性，提高检测的准确性，大大降低了漏检、错检的分险。
本发明提供的试剂盒灵敏度高、特异性强、基因型覆盖全面、可以快速扩增非洲猪瘟病毒p72基因24个基因型，具有广阔的应用前景。
本发明提供的一种检测方法操作简单，快速准确，特异性好，灵敏度高，基因型覆盖全面，不会存在假阳性或假阴性及漏检的可能性，适合规模性推广和应用。
附图说明
图1为非洲猪瘟病毒p72基因24个基因型差异位点碱基比对分析结果；
图2为非洲猪瘟病毒基因Ⅱ型参考毒株Georgia2007毒株p72基因与其它24株非洲猪瘟病毒流行毒株的同源性比对结果；
图3为三组引物和探针设计位点示意图；
图4为采用非洲猪瘟病毒p72基因第一组引物和探针组进行检测获得的实时荧光qPCR扩增曲线；
图5为采用非洲猪瘟病毒p72基因第二组引物和探针组进行检测获得的实时荧光qPCR扩增曲线；
图6为采用非洲猪瘟病毒p72基因第三组引物和探针组进行检测获得的实时荧光qPCR扩增曲线；
图7为采用非洲猪瘟病毒p72基因第一组和第二组混合型引物和探针组进行检测获得的实时荧光qPCR扩增曲线；
图8为采用非洲猪瘟病毒p72基因第一组和第三组混合型引物和探针组进行检测获得的实时荧光qPCR扩增曲线；
图9为采用非洲猪瘟病毒p72基因最佳引物和探针组进行实时荧光 qPCR扩增检测的特异性验证结果图；
图10为实时荧光qPCR方法检测非洲猪瘟病毒p72基因灵敏度结果图；
图11为3份猪脾脏阳性样品中检测非洲猪瘟病毒p72基因阳性的结果图，其中1为阳性对照荧光曲线，2～4为3份猪脾脏阳性样品荧光曲线；
图12为10份猪肝脏阳性样品中检测非洲猪瘟病毒p72基因阳性的结果图，其中1为阳性对照荧光曲线，2～10为10份猪肝脏阳性样品荧光曲线；
图13为9份猪淋巴阳性样品中检测非洲猪瘟病毒p72基因阳性的结果图，其中1为阳性对照荧光曲线，2～9为9份猪淋巴阳性样品荧光曲线；
图14为13份猪血液阳性样品中检测非洲猪瘟病毒p72基因阳性的结果图，其中1为阳性对照荧光曲线，2～13为13份猪血液阳性样品荧光曲线。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1非洲猪瘟病毒p72基因实时荧光qPCR扩增的引物和探针组设计及筛选
1.引物和探针组设计
根据GenBank上公布的非洲猪瘟病毒基因Ⅱ型参考毒株Georgia 2007毒株(登录号：AM999764)p72基因序列，选取24株不同基因型的非洲猪瘟病毒参考毒株(见表1)，筛选高度保守区域，通过Primer Premier6.0和Express 3.0软件分析，理论考核引物的GC含量、TM值、引物二聚体、发卡结构等指标，筛选设计三组特异性引物和探针。本发明设计的非洲猪瘟病毒p72基因三组引物和探针组基因序列如表2所示。第一组有两个引物和一个探针，包括一个正向引物(p72-1F)、一个反向引物(p72-1R)和一个探针(p72-1P)，该组引物和探针涵盖14个基因型(详见表2)；第二组有三个引物和两个探针，包括一个正向引物(p72-2F)、两个反向引物(p72-2R、p72-2R1)和两个探针(p72-2P、p72-2P1)，该组引物和探针涵盖10个基因型(详见表2)；第三组有四个引物和两个探针，包括一个正向引物(p72-3F)、三个反向引物(p72-3R、p72-3R1和p72-3R2)和两个探针(p72-3P和p72-3P1)，该组引物和探针涵盖10个基因型(详见表2)。在探针的5’端和3’端分别标记FAM和BHQ为报告基团和淬灭基团。
表1 24株不同基因型的非洲猪瘟病毒
Figure RE-GDA0003079569610000061
Figure RE-GDA0003079569610000071
表2本发明设计的三组非洲猪瘟病毒p72基因实时荧光qPCR扩增引物和探针
Figure RE-GDA0003079569610000072
Figure RE-GDA0003079569610000081
按照兼并碱基通常的通用字母替代原则，将第二组的反向引物序列 (p72-2R和p72-2R1)、探针序列(p72-2P和p72-2P1)，第三组的反向引物序列(p72-3R、p72-3R1和p72-3R2)、探针序列(p72-3P和p72-3P1)，个别碱基使用兼并碱基进行替代，其中第二组的反向引物序列(p72-2R和p72-2R1) 经兼并碱基替代后的序列为(SEQ ID No.5)CCCARCTAATATAAAAYTCTCTTG；第二组的探针序列(p72-2P和p72-2P1) 经兼并碱基替代后的序列为(SEQ ID No.16) YCACTACGGAGGCAATKCGA；第三组的反向引物序列(p72-3R、p72-3R1和p72-3R2)经兼并碱基替代后的序列(SEQ ID No.5)为 CCCARCTAATATAAAAYTCTCTTG；第三组的探针序列(p72-3P和p72-3P1) 经兼并碱基替代后的序列(SEQ ID No.6)为ARCCACGGGAGGAATACCAAC。其中，简并碱基的代码为R表示A/G，Y表示C/T，K表示G/T，按照兼并碱基替代后的序列合成引物和探针进行引物和探针筛选，以及特异性、灵敏度和试剂盒组装，在探针的5’端和3’端分别标记FAM和BHQ为报告基团和淬灭基团。
2.特异性扩增基因片段的序列比对
根据GenBank下载非洲猪瘟病毒p72基因24株不同基因型序列，经限制在非洲猪瘟病毒p72基因24株不同基因型种内保守性BLAST比对分析，结果见图1。以非洲猪瘟病毒基因Ⅱ型参考毒株Georgia2007毒株(登录号： AM999764)的p72基因为靶基因，该毒株与其它24株非洲猪瘟病毒流行毒株的同源性比对结果如下图2。该毒株与其它24株非洲猪瘟病毒流行毒株的同源性在93.9％-100％之间，其中与Georgia2007株的同源性最高为100％，与MWHOG/1株同源性最低为93.9％。经限制在非洲猪瘟病毒基因Ⅱ型Georgia 2007毒株(登录号：AM999764)p72基因种外特异性BLAST比对分析，特异性良好，406bp特异序列设计引物和探针能够鉴定出非洲猪瘟病毒p72基因，三组引物和探针设计位点示意图见图3。
3.引物和探针筛选
对本发明设计的非洲猪瘟病毒p72基因三组引物和探针进行筛选优化，筛选试验结果表明，第一组引物探针2个阳性对照Ct值为21.56，阴性对照无扩增，扩增结果如图4所示；第二组引物探针组2个阳性对照Ct值为23.15，阴性对照无扩增，扩增结果如图5所示；第三组引物探针组2个阳性对照Ct值为 24.35，阴性对照无扩增，扩增结果如图6所示；第一组和第二组引物探针混合组2个阳性对照Ct值为21.47，一个阴性对照因为引物组发生自连而有小幅度翘尾(Ct值为33.75)，扩增结果如图7所示；第一组和第三组引物探针混合组2个阳性对照Ct值为20.76，阴性对照无扩增，扩增结果如图8所示。由此可见，第一组和第三组引物探针混合组扩增测试时，阳性模板有正常扩增曲线，阴性对照均无扩增，表明本发明所设计的非洲猪瘟病毒p72基因实时荧光 qPCR扩增第一组和第三组引物探针混合组具有很好的特异性。因此，确定选用第一组和第三组的引物探针混合组为最佳的可供特异性检测非洲猪瘟病毒 p72基因实时荧光qPCR扩增引物探针组序列。本实施例最终确定的非洲猪瘟病毒p72基因引物探针组基因序列如表3所示，其中阳性对照为实施例2中制备的阳性对照品，阴性对照为去核酸的超纯水。
表3本发明设计的非洲猪瘟病毒p72基因实时荧光qPCR扩增引物和探针组
名称 引物和探针序列(5′-3′)
p72-F1(SEQ ID No.1) ATCCGATCACATTACCTA
p72-R1(SEQ ID No.2) AGTGGAAGGGTATGTAAG
p72-P1(SEQ ID No.3) CCGTAACTGCTCATGGTATCAATCT
p72-F2(SEQ ID No.4) GCGATGATGATTACCTTTG
p72-R2(SEQ ID No.5) CCCARCTAATATAAAAYTCTCTTG
p72-P2(SEQ ID No.6) ARCCACGGGAGGAATACCAAC
实施例2引物组的特异性扩增验证
1.阳性对照品的制备
根据实施例1获得的非洲猪瘟病毒p72基因最佳第一组和第三组引物探针混合组特异性实时荧光qPCR扩增基因序列，选取含非洲猪瘟病毒p72基因组序列如SEQ ID NO.7。非洲猪瘟病毒p72基因阳性对照品如SEQ ID NO.7所示，经人工合成基因制备质粒，作为阳性对照(委托宝生物工程(大连)有限公司完成制备)，分装并于-20℃保存备用。
非洲猪瘟病毒p72基因阳性对照品的基因组序列如下SEQ ID NO.7所示： ATCCGATCACATTACCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGG TATCAATCTTATCGATAAGTTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATA CCCTTCCACT
2.特异性验证病毒
本发明为验证所设计的非洲猪瘟病毒p72基因引物探针组实时荧光qPCR 扩增特异性，选取猪瘟病毒核酸、猪细小病毒核酸、猪圆环病毒2型核酸、伪狂犬病毒核酸进行检测进行特异性验证。
3.实时荧光qPCR检测
实时荧光qPCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，在每轮循环时都能检测一次荧光信号的强度，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。
3.1实时荧光qPCR反应体系
实时荧光qPCR反应体系总体积为25μL，其中含有：2.5mmol/L dNTP Mixture 2.0μL、5×PCR缓冲液5.0μL、25mmol/L MgCl22.0μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、引物组2μL(包括：10μmol/L正向引物p72-F1 1.0μL、 10μmol/L反向引物p72-R1 1.0μL、10μmol/L探针p72-P1 0.6μL，10μmol/L正向引物p72-F2 1.0μL、10μmol/L反向引物p72-R2 1.0μL、10μmol/L探针p72-P2 0.6μL)、DEPC处理水5.3μL、样品DNA模板5.0μL。
具体如表4所示，其中，dNTP Mixture购自TaKaRa公司、Taq DNA聚合酶购自Promega公司。
表4实时荧光qPCR反应体系各组分
Figure RE-GDA0003079569610000101
Figure RE-GDA0003079569610000111
3.2进行实时荧光qPCR反应。程序为(可根据不同的仪器设置相应的反应条件)：
95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，60℃退火延伸30秒，40个循环，在每一循环的60℃时收集FAM荧光信号。
3.3对照扩增反应
3.3.1在试样实时荧光qPCR反应的同时，设置阳性对照、空白对照。
各对照反应体系中，除模板外其余组分及反应条件与3.1相同，且阳性对照、空白对照体积也应达到试样DNA模板体积要求。
3.3.2以如SEQ ID NO.7所示序列的阳性质粒作为实时荧光qPCR扩增反应体系的阳性对照模板。
3.3.3以去核酸的超纯水作为实时荧光qPCR扩增反应体系的空白对照模板。
4.结果判定
根据有无“S”型荧光信号扩增曲线判定结果。
阴性：无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45。
阳性：Ct值<35，可报告为阳性。
可疑：Ct值在35-45之间，建议重复实验，若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
5.引物探针组的特异性扩增验证结果
利用本发明方法对非洲猪瘟病毒核酸、猪瘟病毒核酸、猪细小病毒核酸、猪圆环病毒2型核酸、伪狂犬病毒核酸进行检测。结果如图9所示，图中只有非洲猪瘟病毒核酸出现特异性扩增曲线，而其他病毒未检测到扩增曲线，说明所设计的引物探针特异性强。
实施例3实时荧光qPCR扩增检测灵敏度试验
1.灵敏度试验方法
1.1引物和探针、Mg2+浓度的优化
将筛选好的引物的浓度从0.2μmol/L至0.8μmol/L以0.2μmol/L为间距递增；探针浓度从0.16μmol/L至0.28μmol/L以0.04μmol/L递增；Mg2+浓度从 1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L为间距递增，利用Taguchi法探究摸索最佳的引物、探针和Mg2+浓度。
1.2Taq DNA聚合酶的筛选及优化
为确定Taq DNA聚合酶的最佳用量和比列，分别对不同用量的Taq酶 (0.05U/μL、0.1U/μL、0.2U/μL)，摸索最佳用量。
1.3梯度稀释灵敏度试验
将非洲猪瘟病毒体外转录DNA质粒阳性对照样本以10倍差进行稀释，梯度浓度分别为1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102 copies/μL、10copies/μL、5copies/μL、1copies/μL，经实施例1的实时荧光qPCR 扩增反应体系进行检测，验证本发明实施例所设计的非洲猪瘟病毒qPCR扩增引物组所建立的实时荧光qPCR扩增检测方法的灵敏度。
2.灵敏度试验结果
2.1反应体系各物质浓度的优化的结果
通过Taguchi方法进行试验设计，根据所获得的最佳浓度范围进一步进行优化，从多次重复试验中发现：引物浓度为0.4μmol/L、探针浓度为0.24μmol/ L、Mg2+的浓度为2.0mmol/L时，荧光增幅相对较高且引物探针用量较少，所以选择引物浓度为0.4μmol/L、探针浓度为0.24μmol/L、Mg2+的浓度为 2.0mmol/L作为检测的最佳引物、探针和Mg2+浓度。
2.2Taq DNA聚合酶的优化结果
分别对不同用量的Taq酶检测结果进行比较，确定Taq酶的量为0.1U/μL，即25μL反应体系用量为0.5μL。
2.3反应体积优化试验结果和最终反应体系的确定
为确定实时荧光qPCR反应体积的差异，采用25μL体系与50μL体系进行实时荧光qPCR检测比较，显示两种体系检测结果一致，因此选定25μL实时荧光qPCR反应体系作为实际应用的反应体系。结合上面的优化结果，确定非洲猪瘟病毒p72基因实时荧光qPCR检测方法的反应体系，见表4。
2.4梯度稀释灵敏度试验结果
按照1.3的方法进行梯度稀释灵敏度试验，结果如图10所示，浓度分别为 1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、10copies/μL、5copies/μL、1copies/μL的不同浓度质粒阳性对照样本。经多次试验显示，非洲猪瘟病毒p72基因的5copies/μL浓度阳性质粒三个平行样本均检出，均存在明显荧光扩增曲线，且曲线形态良好。采用5copies/μL阳性质粒样本作为模板进一步进行20个重复测试，确定本发明所设计的非洲猪瘟病毒p72基因实时荧光qPCR扩增检测的引物探针组和反应体系的检测灵敏度为5copies/μL。
实施例4一种非洲猪瘟病毒p72基因实时荧光qPCR扩增检测试剂盒及使用方法
1.该试剂盒的组成包括：
(1)实时荧光qPCR反应液
表5实时荧光qPCR反应液配方
Figure RE-GDA0003079569610000141
(2)阳性对照，为含有核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示序列的阳性质粒。
(3)阴性对照
本试剂盒-20℃储存12个月不影响使用效果。
2.检测时所需要的器材
设备：实时荧光定量PCR仪；移液器(量程0.1-200μL)；乳胶或一次性手套若干。
3.试剂盒的应用方法
3.1样本要求
适用样本类型：全血、血清、淋巴结、脾脏、肝脏、猪肉、猪肉制品、环境样品(粪便、饲料、污水等)等样品中非洲猪瘟病毒核酸的检测。样本 DNA提取可以按照提取试剂盒操作进行，把样本DNA用于检测实验或保存于-80℃。
3.2操作步骤
3.2.1 qPCR扩增体系配制
将试剂盒置室温使实时荧光qPCR反应液、阴性对照和阳性对照完全溶化，并混匀。取20μL实时荧光qPCR反应液至每个反应管内，然后加5μL 所提取的样品核酸，每个反应总体积为25μL。每次检测应设立阳性对照和阴性对照。在实时荧光PCR仪上进行扩增检测。
3.2.2反应程序
95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，60℃退火延伸30秒，40个循环，在每一循环的60℃时收集FAM荧光信号。
3.3依据实施例2的结果判定规则进行结果的判定。
每个反应需设置空白对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。
4.注意事项
上述试剂以及阳性对照品在-20℃条件下保存。
试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
实施例6检测猪制品中非洲猪瘟病毒试剂盒的应用
1.病毒的收集
1.1样品采集及处理
1.1.1活猪样品，无菌采集抗凝血或血清5mL。
1.1.2病死猪剖检样品或屠宰场剖检样品，无菌采集死猪的脾、肝、淋巴结、扁桃体等组织样品。2～8℃低温运至实验室用于检测。
1.1.3采集与病猪相关场所的粪便、饲料、污水样品。2～8℃低温运至实验室用于检测。
1.2样品处理
1.2.1血液样品直接用；脾、肝、猪肉、猪肉制品等样品处理方法，取适当大小的组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000r/min震荡研磨45 秒，制成约10％的组织匀浆液，5000r/min离心5分钟，取200μL上清液进行核酸提取。
1.2.2粪便、饲料样品处理方法，取适量的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000r/min震荡研磨45秒，制成约10％的匀浆液，5000r/min 离心5分钟，取200μL上清液进行核酸提取。
1.2.3污水样品处理方法，直接取200μL污水进行核酸提取。
注：上述病毒收集方法都是报道的常用方法。
2.DNA提取
采用DNA提取试剂盒或自动核酸提取仪提取各类样本中的核酸。低温保存备用。
注：或采用其他商品化的提取试剂盒提取样品DNA。这些方法都是报道的常用方法。
将该检测方法应用于猪全血、淋巴结、肝脏、脾脏等96份临床样本的检测，按照上述方法进行样品处理和提取DNA，进行实时荧光qPCR扩增反应，检测其中是否含有非洲猪瘟病毒。96份临床样本均由北京动物疾病预防控制中心采集或收集，并由该单位已采用OIE推荐使用的普通PCR检测方法进行了阳性和阴性结果的验证，详见表6。
表6采集或收集的96份临床样本信息
样本 样本数 来源
猪脾脏阴性样本 17份 北京大兴区某养殖场
猪脾脏阳性样本 3份 北京琉璃河镇某养殖场
猪肝脏阴性样本 8份 北京大兴区某养殖场
猪肝脏阳性样本 10份 北京琉璃河镇某养殖场
猪淋巴阴性样本 4份 北京大兴区某养殖场
猪淋巴阳性样本 9份 北京青龙湖镇某养殖场
猪血液样品阴性样本 32份 北京大兴区某养殖场
猪血液阳性样本 13份 北京青龙湖镇某养殖场
用本发明的试剂盒对于获取的96份临床样本进行了检测。检测结果如图11所示，是3份猪脾脏阳性样本中检测非洲猪瘟病毒p72基因阳性的结果；如图12所示，是10份猪肝脏阳性样本中检测非洲猪瘟病毒p72基因阳性的结果；如图13所示，是9份猪淋巴阳性样本中检测非洲猪瘟病毒p72基因阳性的结果；如图14所示，是13份猪血液阳性样本中检测非洲猪瘟病毒p72 基因阳性的结果，检测结果见表7。
表7采集或收集的96份临床样本检验结果
样本 样本数 qPCR检测结果(阳性数/样本数)
猪脾脏阴性样本 17份 0/17
猪脾脏阳性样本 3份 3/3
猪肝脏阴性样本 8份 0/8
猪肝脏阳性样本 10份 10/10
猪淋巴阴性样本 4份 0/4
猪淋巴阳性样本 9份 9/9
猪血液样品阴性样本 32份 0/32
猪血液阳性样本 13份 13/13
结果显示，从3份猪脾脏阳性样本、10份猪肝脏阳性样本、9份猪淋巴阳性样本、13份猪血液阳性样本中检出非洲猪瘟病毒阳性，从17份猪脾脏阴性样本、8份猪肝脏阴性样本、4份猪淋巴阴性样本、32份猪血液样品阴性样本中检测结果均为阴性。本发明的试剂盒对96份已知临床样本的检测中未发现假阳性和假阴性结果，一步证实了方法的实用性。
本发明的方法应用于猪制品中非洲猪瘟病毒检测将具有广阔的前景，广泛适用于对猪全血、淋巴结、肝脏、脾脏等等领域。
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。
序列表
<110> 大连民族大学
<120> 用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物探针、试剂盒及方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccgatcac attaccta 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtggaaggg tatgtaag 18
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgtaactgc tcatggtatc aatct 25
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgatgatga ttacctttg 19
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccarctaat ataaaaytct cttg 24
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
arccacggga ggaataccaa c 21
<210> 7
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atccgatcac attacctatt attaaaaaca tttccgtaac tgctcatggt atcaatctta 60
tcgataagtt tccatcaaag ttctgcagct cttacatacc cttccact 108
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tctgcagctc ttacatac 18
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccaactaat ataaaattct cttg 24
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccactacgga ggcaatgcga 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccagctaat ataaaactct cttg 24
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcactacgga ggcaattcga 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agccacggga ggaataccaa c 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccagctaat ataaaattct cttg 24
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaccacggga ggaataccaa c 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ycactacgga ggcaatkcga 20

Claims (10)

1.用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物和探针，其特征在于，其包括第一组引物对p72-F1和p72-R1及探针p72-P1，和第二组引物对p72-F2和p72-R2及探针p72-P2，其中，所述p72-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述p72-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述p72-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述p72-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述p72-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述p72-P2的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
2.一种用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的实时荧光恒温扩增的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的引物对和探针，在探针的5’端和3’端分别标记报告基团和淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTP Mixture、PCR缓冲液、MgCl2、Taq DNA聚合酶。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和空白对照，所述阳性对照为含有核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示序列的阳性质粒，所述空白对照为去核酸的超纯水。
5.一种用于检测非洲猪瘟病毒p72基因实时荧光qPCR扩增的的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1、从样品中提取DNA；
S2、对步骤S1提取的所述DNA进行实时荧光qPCR扩增；其中，在反应体系中，采用如权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物和探针；
S3、结果判定：
若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，则判断为阳性；
若无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45则判断为阴性；
若Ct值在35-45之间，建议重复实验，若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，探针的5’端和3’端分别标记FAM和BHQ为报告基团和淬灭基团。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述实时荧光qPCR的反应体系包括0.1～2.5mmol/L dNTP Mixture、1～5×PCR缓冲液、1.0～2.5mmol/L MgCl2、0.05～0.2U/μL Taq DNA聚合酶、0.2～0.8μmol/L引物对、0.16～0.28μmol/L探针和DEPC处理水。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光qPCR的反应体系为25μL包括含有终浓度为0.2mmol/L dNTP Mixture、1×PCR缓冲液、2mmol/LMgCl2、0.1U/μLTaqDNA聚合酶、0.4μmol/L引物对、0.24μmol/L探针。
9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，实时荧光qPCR扩增的程序95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，60℃退火延伸30秒，40个循环，在每一循环的60℃时收集FAM荧光信号。
10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，同时设置以如SEQ IDNO.7所示序列的质粒体外转录RNA为阳性对照，以去核酸的超纯水为空白对照进行检测。
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