CN111218528A - 基于双基因检测非洲猪瘟病毒的pcr引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及基于双基因检测非洲猪瘟病毒的PCR引物组、试剂盒及应用。本发明中的引物组及方法的检测特异性高、重复性好、灵敏度高，同时具有操作简便，检测时间短等优势，可有效地降低假阳性结果的出现，降低阳性对照对检测环境的影响，在非洲猪瘟病毒的快速检测中具有较高的应用价值。

Description

基于双基因检测非洲猪瘟病毒的PCR引物组、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及基于双基因检测非洲猪瘟病毒的PCR引物组、试剂盒及应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的一种烈性传染病，世界动物卫生组织将其列为A类疫，我国将其列为一类动物疫病。ASF不传染人，感染猪后病死率可达100％。ASFV感染猪后，其临床症状和病理。

变化与经典猪瘟非常相似，极易将两种病混淆。主要表现为高热(猪体温一般高达40.5～42℃)，皮肤发绀有出血点，甚至出现大量无症状死亡的猪只，其中脾脏异常肿大为其典型症状。猪是ASFV自然感染的唯一家畜，野猪也易感，野猪感染后的临床症状和病理变化与家猪类似。钝缘蜱是ASFV的自然宿主。被ASFV污染的猪肉制品(如火腿、腌肉、风干肉等)、饲料、水源、运输车、餐食剩余垃圾等制成的泔水，发病猪，带毒猪等都是ASFV的传染源。

目前，全世界尚未有有效的药物和疫苗可以防控ASF的感染。对于尚无该疫情的地区，要加强防控，建立ASF监测体系，完善ASF净化措施，将ASF疫情隔离在外。一旦发现ASF疫情，要尽快隔离病猪，扑杀患病猪群，销毁死亡猪只，对运输猪只的来往车辆、接触病猪的相关人员以及圈舍都要进行严格的消毒处理，对废弃物及时采取无害化处理措施；同时，对患病区周围的猪群尽快采用病原学检测等方法进行疫情监测。ASF病原学检测方法主要包括聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、实时荧光定量PCR(real-time PCR)、红细胞吸附试验(hemadsorption，HAD)、荧光抗体试验(flurescent antibody test，FAT)、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等。

ASFV对养猪业的发展有很大不利，为了更好地防控非洲猪瘟的发生与流行，各种非洲猪瘟病原的快速检测技术及产品不断出现，随着检测频率的不断增大，加上检测人员技术水平参差不齐、检测环境的差异，导致一些假阳性检测结果的出现。

B646L(p72)是国内外学者公认的应用于非洲猪瘟病毒检测方法的研究中保守性最好的基因，因此针对p72基因建立了多种抗原检测方法，其中以普通PCR和real-time PCR方法居多，这也是临床上检测ASF病原最常用的两种快速检测方法。比如，CN109593893A中提到了基于ASFV的p72基因设计的引物和检测方法，但就非洲猪瘟病毒防控而言，抗体检测要滞后于抗原检测，不能有效地对非洲猪瘟病毒进行早发现、早处置。

另外，在崔贝贝等发表的文章中报道有通过非洲猪瘟病毒E184L和K196R基因建立的单基因检测方法，在CN110423761A中提到了编码ASFV的p54蛋白的基因以及基于该蛋白基因设计的ASFV非洲猪瘟病毒的抗体检测方法。

单基因检测方法相对于双基因检测，在一定程度上会出现假阴性或者假性的结果，通过双基因的相互验证可有效地降低这种现象发生，避免不必要的经济损失。在CN110373500A中提到了一种基于B646L(p72)和B438L(p49)双基因的双重荧光PCR检测ASFV的试剂盒及其应用，但其缺陷在于，相较于单基因检测，该方案会一定程度上降低检测的敏感性。此外，该技术方案中的阳性对照为B646L(p72)和B438L基因串联质粒载体，如长期使用并不能有效降低检测方法出现假阳性的概率；同时，该发明所涉及的加样体系，操作繁琐，单孔体系加样需要加入0.1μL的体积，模板加样量为1uL，加样6次，对操作人员有一定的要求，检测试剂也会造成不必要的浪费。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了更好地通过检测结果指导非洲猪瘟防控，减少不必要的经济损失，本发明基于实时荧光技术开展了非洲猪瘟病毒双基因检测方法的研究，并设计改造了检测过程中阴阳性对照的设立方式，在保证检测方法敏感性的前提下，最大程度地降低了检测样品的假阳性结果，本发明提供了一种基于双基因检测非洲猪瘟病毒的PCR引物组、试剂盒及应用。

(二)技术方案

本发明在数据库中检索并下载非洲猪瘟病毒B646L(p72)和E183L(p54)基因序列，根据上述靶序列分别设计特异性引物和探针，经大量筛选和人工优化获得序列如SEQ IDNO.1-4所示的特异性引物，可用该引物配合序列如SEQ ID NO.5-6所示的探针或其他可用探针实现特异高效的荧光定量PCR扩增，基于此，本发明开发了非洲猪瘟病毒双基因实时荧光定量PCR检测方法；基于优选出的引物和探针序列，设计合成了对照品基因序列如SEQ IDNO.19。

具体地，第一方面，本发明提供了用于非洲猪瘟病毒双基因检测的PCR引物组，包含2对特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。

上述特异性引物中，针对非洲猪瘟病毒B646L(p72)基因的特异性引物序列如SEQID NO.1-2所示，针对非洲猪瘟病毒E183L(p54)基因的特异性引物序列如SEQ ID NO.3-4所示。

SEQ ID NO.1：p72-F：5’-AAGATCAGCCGTAGTGATAGACC-3’；

SEQ ID NO.2：p72-R：5’-TGCAGCTCTTACATACCCTTCC-3’；

SEQ ID NO.3：p54-F：5’-GAGTAGTGACTGTCGTGTAAGGC-3’；

SEQ ID NO.4：p54-R：5’-ACCAGTTACGGACAACCCAG-3’。

上述特异性引物能够高效特异地结合非洲猪瘟病毒B646L(P72)和E183L(p54)基因的靶序列，在同一个PCR体系中相互之间不会产生干扰，能够保证二重实时荧光定量PCR检测的特异性和灵敏度。

本发明还提供与序列如SEQ ID NO.1-4所示的引物组配套使用的探针组，所述探针组包含2条探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。

上述探针中，针对非洲猪瘟病毒B646L(p72)基因的探针如SEQ ID NO.5所示，针对非洲猪瘟病毒E183L(p54)基因的探针序列如SEQ ID NO.6所示。

SEQ ID NO.5：p72-P：5’-ACTGGGTTGGTATTCCTCCC-3’；

SEQ ID NO.6：p54-P：5’-GCAACAAACAGACCAGCAAC-3’。

上述特异性引物和探针配合使用能够高效特异地结合非洲猪瘟病毒B646L(P72)和E183L(p54)基因的靶序列，在同一个PCR体系中相互之间不会产生干扰，能够更好地促进双基因实时荧光定量PCR检测的特异性和灵敏度的提高。

本发明提供用于非洲猪瘟病毒B646L(P72)和E183L(p54)基因的靶序列双基因实时荧光定量PCR检测的引物探针组合，其包含2对特异性引物和2条探针；所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-4所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.5-6所示。

优选地，所述探针的5’端标记的荧光基团为选自FAM、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记的淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

更优选地，如SEQ ID NO.5所示的探针的5’端标记的荧光基团为HEX，3’端标记的淬灭基团为BHQ1；如SEQ ID NO.6所示的探针的5’端标记的荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为BHQ1。

第二方面，本发明提供所述PCR引物组和/或所述探针组在制备用于非洲猪瘟病毒双基因检测的试剂盒中的应用。

第三方面，本发明提供一种非洲猪瘟病毒双基因检测试剂盒，其包含序列如SEQID NO.1-4所示的引物组。

优选地，所述检测试剂盒还包含序列如SEQ ID NO.5-6所示的探针组。

更优选地，所述检测试剂盒还包含PCR反应液和/或对照品。

作为优选，所述的PCR反应液为2×PCR反应液，包含DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP混合物；所述反应缓冲液中含有80-100mM KCl、pH 8.5的15-20mM Tris-HCl、4-5mM MgCl₂；所述dNTP混合物含有dATP、dGTP、dCTP和dTTP各0.4-0.8mM。

作为优选，所述的对照品为含有特定DNA片段的质粒，所述特定DNA片段核苷酸序列中含有检测一个基因的上游引物、探针的核苷酸序列及检测另一个基因的下游引物；具体的，所述特定DNA片段核苷酸序列含有检测B64L6(P72)基因的上游引物、探针的核苷酸序列及检测E183L(p54)基因的下游引物翻转、互补后的核苷酸序列的质粒，或者，含有检测E183L(p54)基因的上游引物、探针的核苷酸序列及检测B64L6(P72)基因的下游引物翻转、互补后的核苷酸序列。比如，所述质粒中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的DNA片段。

(序列中含有p72-F、p72-P的引物序列及p54-R引物翻转互补序列)。

更优选地，所述检测试剂盒在工作时的反应程序如下：95℃、30s；95℃、5s，60℃、20s，采集荧光信号，35个循环；

所述检测试剂盒在工作时的反应体系如下：

待测样品的20μL反应体系：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液1.5μL，E183L基因引物探针混合液1.5μL，待测样品7μL；

阳性对照的20μL反应体系：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液1.5μL，E183L基因引物探针混合液1.5μL，对照品7μL；

阴性对照的20μL反应体系：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液或者E183L基因引物探针混合液1.5μL，对照品8.5μL；

其中，所述B646L基因引物探针混合液包含10μM SEQ ID NO.1所示的引物、10μMSEQ ID NO.2所示的引物和5μM SEQ ID NO.5所示的探针；所述E183L基因引物探针混合液包含10μM SEQ ID NO.3所示的引物、10μM SEQ ID NO.4所示的引物和5μM SEQ ID NO.6所示的探针；所述PCR反应液包含DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP混合物；所述反应缓冲液中含有80-100mM KCl、pH 8.5的15-20mM Tris-HCl、4-5mM MgCl₂；所述dNTP混合物含有dATP、dGTP、dCTP和dTTP各0.4-0.8mM。

第四方面，本发明提供一种非洲猪瘟病毒双基因实时荧光定量PCR检测方法，包括：以待测样品中的病毒DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.1-4所示的引物组，或者利用如SEQ ID NO.1-4所示的引物组和序列如SEQ ID NO.5-6所示的探针组，或者利用所述检测试剂盒，进行双基因实时荧光定量PCR检测，根据扩增曲线和/或Ct值判断检测结果。

其中，所待测样品可以为细胞培养物、血液样品、唾液样品、组织研磨样品等。

所述待测样品中的病毒DNA可采用本领域常规技术手段经提取制备得到。

进一步的，本发明经优化确定了最佳的双基因实时荧光定量PCR的检测反应体系和反应程序。

优选地，所述双基因实时荧光定量PCR的反应程序如下：95℃、30s；95℃、5s，60℃、20s，采集荧光信号，35个循环。

优选地，所述双基因实时荧光定量PCR的待测样品的20μL反应体系如下：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液1.5μL，E183L基因引物探针混合液1.5μL，待测样品DNA 7μL；

阳性对照的20μL反应体系如下：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液1.5μL，E183L基因引物探针混合液1.5μL，对照品7μL；

阴性对照的20μL反应体系如下：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液或者E183L基因引物探针混合液1.5μL，对照品8.5μL；

其中，所述B646L基因引物探针混合液包含10μM SEQ ID NO.1所示的引物、10μMSEQ ID NO.2所示的引物和5μM SEQ ID NO.5所示的探针；所述E183L基因引物探针混合液包含10μM SEQ ID NO.3所示的引物、10μM SEQ ID NO.4所示的引物和5μM SEQ ID NO.6所示的探针；所述PCR反应液包含DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP混合物；所述反应缓冲液中含有80-100mM KCl、pH 8.5的15-20mM Tris-HCl、4-5mM MgCl₂；所述dNTP混合物含有dATP、dGTP、dCTP和dTTP各0.4-0.8mM。

所述双基因实时荧光定量PCR的反应结果的检测通道根据探针的荧光基团标记确定，例如，非洲猪瘟病毒DNA检测的的探针分别采用FAM和HEX标记时，反应结果在FAM、HEX两个通道进行检测。

作为本发明的优选方案，所述非洲猪瘟病毒双基因二重实时荧光定量PCR检测方法包括如下步骤：

(1)检测样本的制备

取检测样本(细胞培养物、血液样品、唾液样品、组织研磨样品等)，加入人工合成的B64L6(p72)、E183L(p54)基因质粒子，8000r/min离心5min，取上清，用商品化的RNA/DNA快速提取试剂盒进行总核酸物质的提取；

(2)双基因实时荧光定量PCR反应体系的建立和扩增

取荧光定量PCR反应管，加入2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液1.5μL，E183L基因引物探针混合液1.5μL，待测样品DNA 7μL，建立双重实时荧光定量PCR的反应体系；所述引物探针混合液包含10μM引物混合液(SEQ ID NO.1-4)和5μM探针混合液(SEQID NO.5-6)；所述PCR反应液包含DNA聚合酶、反应缓冲液(80-100mM KCl、15-20mM Tris-HCl(pH 8.5)、4-5mM MgCl2)、dNTP混合物(各0.4-0.8mM)。

双基因实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃、30s；95℃、5s，60℃、20s，35个循环，采集FAM、HEX荧光信号，进行35循环；

(3)检测结果判定

反应结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果，结果判断依据如下：阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线；阳性对照Ct值<25，并出现典型扩增曲线；若检测样品扩增反应的Ct值≤33且扩增曲线良好，则直接判定为阳性；若检测样品扩增反应的Ct值大于33且小于35，重复检测一次，若Ct值仍大于33且小于35，则判定为阳性；其它情况则判定为阴性。

与现有技术中的其他双基因检测方法比，本发明仅需要加样4次，单孔最小加样量1.5μL，模板加样量为7μL，具有更好的可操作性、敏感性和抗干扰性。

本领域人员可对优选方案进行组合，得到本发明较佳实施例。

(三)有益效果

(1)特异性高、重复性好、灵敏度高：本发明通过对靶序列的特异选择以及特异性引物和探针的筛选和人工优化，得到的引物探针组合能够实现高效特异的双基因实时荧光定量PCR扩增。在特异性方面，本发明的检测方法仅对非洲猪瘟病毒B64L6(P72)、E183L(p54)基因质粒能够进行扩增，对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、圆环病毒(PCV2)、蓝耳病毒(PRRSV)、乙脑病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)均无法扩增；在重复性方面，对阳性样品检测结果的重复性100％，批内和批间检测的变异系数均小于5％；在灵敏度方面，本发明的检测方法可检测到在反应体系中有单个拷贝以内的基因质粒样品；

(2)操作简便，省时省力：本发明的非洲猪瘟病毒双基因检测方法可结合商品化的核酸快速提取试剂盒，直接对待测样本中提取的病毒DNA进行检测，能够在40min内完成检测，与常规的PCR检测方法相比具有操作简便，省时省力的优势；

(3)可实现双基因检测，且检测过程对环境影响较小：本发明的非洲猪瘟病毒双基因检测试剂盒，实现两个基因检测结果相互验证，进一步增强检测结果的准确性；同时，试剂盒的对照品人工设计合成，仅含有检测非洲猪瘟病毒2条引物序列和1条探针序列，分别位于p72、p54基因上，即使高频率检测使用，也不会对环境及其它检测方法造成影响，明显地降低了检测样品的假阳性结果的出现。

附图说明

图1为本发明实施例3中非洲猪瘟病毒双基因实时荧光定量PCR的扩增曲线图；其中，A为非洲猪瘟病毒B64L6(P72)基因PCR扩增曲线图；B为非洲猪瘟病毒E183L(p54)基因PCR扩增曲线图。

图2为本发明实施例5中非洲猪瘟病毒双基因实时荧光定量PCR检测方法对B64L6(P72)基因的检测敏感性分析结果图；图中，1表示样品进行10^-8稀释；2表示样品进行10^-9稀释；3表示样品进行10^-10稀释；4表示样品进行10^-11稀释；Neg.为阴性反应对照。

图3为本发明实施例5中非洲猪瘟病毒双基因实时荧光定量PCR检测方法对E183L(p54)基因的检测敏感性分析结果图；图中，1表示样品进行10^-8稀释；2表示样品进行10^-9稀释；3表示样品进行10^-10稀释；4表示样品进行10^-11稀释；Neg.为阴性反应对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1用于非洲猪瘟病毒双基因检测的特异性引物和探针的设计

本发明从数据库下载不同ASFV毒株的B64L6(p72)、E183L(p54)基因序列进行比对分析，并依据分析结果在基因的前、中、后段分别设计引物进行筛选。为提高检测的特异性、灵敏度，实现高效的双基因实时荧光定量PCR检测，本发明针对引物、探针与靶序列的亲和力、引物之间的二级结构以及引物与靶序列之间的二级结构、引物的GC含量、Tm值、长度和扩增片段长度等进行了大量人工优化设计和筛选。最终获得了如SEQ ID NO.1-6所示的效果最优的引物和探针组合。

以下为本发明设计的大量候选引物和探针的部分罗列(表1)及效果说明。

表1针对ASFV p72、p54基因序列设计的特异性引物/探针的部分列举

注：上述探针中，Y代表T或C，M代表A或C，R代表A或G；p72基因的探针的5’端标记HEX，3’端标记BHQ1；p54基因的探针的5’端标记FAM，3’端标记BHQ1。

在进行引物的初步筛选中，通过构建分别含有ASFV毒株的B64L6(p72)、E183L(p54)基因的重组质粒子，并计算出相应每微升体积含有的拷贝数，进行引物的敏感性和特异性检测，确定最优引物。实验结果如表2、表3、表4和表5所示，结果表明，表1中列举的引物均具有很好的特异性，但是，针对p72的引物和探针中，p72/F(R/P)、p54/F(R/P)引物(探针)组的敏感性最高；针对p54的引物和探针中，p54/F(R/P)、p72/F(R/P)引物(探针)组的敏感性最高。

表2 p72基因引物/探针的敏感性检验结果

注：“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性；“Unde”表示未检测到荧光信号。

表3 p72基因引物/探针的特异性检验结果

注：“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性；“Unde”表示未检测到荧光信号。

表4 p54基因的引物/探针的敏感性检验结果

注：“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性；“Unde”表示未检测到荧光信号。

表5 p54基因引物/探针的特异性检验结果

注：“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性；“Unde”表示未检测到荧光信号。

实施例2 p72最优引物序列与p54、E184L、K196R、B438L进行双基因组合

本实施例分别进行p72+p54、p72+E184L、p72+K196R、p72+B438L双基因检测组合，荧光检测人工合成的p72、p54、E184L、K196R、B438L基因质粒的混合物，E184L、K196R、B438L的引物和探针序列源于参考文献和申请的专利(见下表6)；取荧光定量PCR反应管，加入2×PCR反应液10μL，B646L(p72)基因引物探针混合液1.5μL，E183L(p54)、E184L、K196R、B438L基因引物探针混合液分别加入1.5μL，待测样品DNA 7μL，进行荧光定量PCR的反应体系；所述引物探针混合液包含10μM引物混合液(SEQ ID NO.1-4)和5μM探针混合液(SEQ ID NO.5-6)；所述PCR反应液包含DNA聚合酶、反应缓冲液(100mM KCl、20mM Tris-HCl(pH 8.5)、4mMMgCl2)、dNTP混合物(各0.5mM)。双基因实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃、30s；95℃、5s，60℃、20s，35个循环，采集荧光信号，进行35个循环。

表6.所用引物的序列及出处

注：上述探针中，Y代表T或C，M代表A或C，R代表A或G。

不同靶基因引物组合检测结果表明，p72与p54的组合最为理想，与单基因检测的结果相一致；p72与E184L、p72与K196R、p72与B438L的组合与单基因检测比较，双基因检测的敏感性较单基因检测的敏感性均有所均降低(见下表7)。

表7.不同引物组合的相互影响

实施例3 ASFV p72、p54双基因的检测试剂盒

本实施例提供用于ASFV双基因实时荧光定量PCR检测的试剂盒，该试剂盒包含以下组分：2×PCR反应液(包含DNA聚合酶、反应缓冲液(100mM KCl、15mM Tris-HCl(pH 8.5)、4mM MgCl2)、dNTP混合物(各0.5mM))、p72引物探针混合液(引物p72-F及p72-R的浓度均为10μM，探针p72-P浓度为5μM)、p54引物探针混合液(引物p54-F及p54-R的浓度均为10μM，探针p54-P浓度为5μM)、对照品。

其中，2×PCR反应液为宝生物工程(大连)有限公司(产品代码RR390)的商品化市购产品。

所述对照品为人工设计合成质粒，含有检测非洲猪瘟病毒B64L6(P72)基因上游引物、探针引物及检测非洲猪瘟病毒的E183L(p54)基因的下游引物所组成的DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

该检测试剂盒的组成(50T/盒)及保存条件如表8所示，该检测试剂盒的有效期为12个月。

表8检测试剂盒的组成及保存条件

实施例4 ASFV双基因实时荧光定量PCR检测方法

本实施例提供一种使用实施例3中的检测试剂盒对ASFV进行双基因实时荧光定量PCR检测的方法，具体如下：

(1)检测样本的制备

取疑似感染样品(细胞培养物、血液样品、唾液样品、组织研磨样品等)，8000r/min离心5min，取上清，用商品化的RNA/DNA快速提取试剂盒进行总核酸物质的提取。

(2)双基因实时荧光定量PCR的反应体系建立和扩增

以步骤(1)提取得到的核酸作为检测模板，采用实施例1筛选得到的序列如SEQ IDNO.1-6所示的引物和探针进行双基因实时荧光定量PCR检测：

取荧光定量PCR反应管：

a.加入2×PCR反应液10μL、p72与p54引物探针混合液各1.5μL(p72-F/R、p54-F/R均为10μM，探针p72-P和p54-P浓度为5μM))、待检测模板DNA 7μL，得到检测样品反应体系；

b.加入2×PCR反应液10μL、p72与p54引物探针混合液各1.5μL(p72-F/R、p54-F/R均为10μM，探针p72-P和p54-P浓度为5μM))、对照品质粒DNA 7μL，得到阳性对照反应体系；

c.加入2×PCR反应液10μL、p72引物探针混合液1.5μL(p72-F/R均为10μM，探针p72-P浓度为5μM))、对照品质粒DNA 8.5μL，得到阴性对照反应体系；

双基因实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃、30s；95℃、5s，60℃、20s，收集FAM、HEX荧光信号)，进行35个循环。

(3)双基因实时荧光定量PCR检测结果的判定

反应结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果，结果判断依据如下：阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线；阳性对照Ct值<25，并出现典型扩增曲线；若检测样品扩增反应的Ct值≤33且扩增曲线良好，则直接判定为阳性；若检测样品扩增反应的Ct值大于33且小于35，重复检测一次，若Ct值仍大于33且小于35，则判定为阳性；其它情况则判定为阴性。

利用上述方法检测ASFV p72、p54双基因检测的阳性结果的扩增曲线如图1所示，其中，A为非洲猪瘟病毒B64L6(P72)基因PCR扩增曲线图；B为非洲猪瘟病毒E183L(p54)基因PCR扩增曲线图。

实施例5检测方法的特异性分析

采用实施例3的检测试剂盒和实施例3提供的ASFV双基因实时荧光定量PCR检测方法，分别以人工合成的ASFV p72基因质粒、非洲猪瘟病毒B646L基因质粒标准物质(标准物质编号GBW(E)091034)、ASFV p54基因质粒、PEDV、RV、PRV、PCV2、PRRSV、JEV、CSFV为模板，对该方法的特异性进行评估。

实验结果显示，在HEX通道，只有p72基因质粒和非洲猪瘟病毒B646L基因质粒标准物质(标准物质编号GBW(E)091034)样品呈阳性扩增反应，而其它病毒对照均无扩增曲线形成，呈阴性反应；在FAM通道，只有p54基因质粒样品呈阳性扩增反应，而其它病毒对照均无扩增曲线形成，呈阴性反应；表明本发明提供的ASFV双基因实时荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法具有较高的特异性，与其它病毒样品无交叉反应。

实施例6检测方法的敏感性分析

将ASFV p72基因质粒(拷贝数为6.5X10¹⁰copies/μL)和p54基因质粒(拷贝数位7.2X10¹⁰copies/μL)作10倍梯度稀释，分别采用双基因实时荧光定量PCR检测方法进行检测，对该方法的敏感性进行评估。

见图2～3，其中，图2为对B64L6(P72)基因的检测敏感性分析结果图，图3为对E183L(p54)基因的检测敏感性分析结果图；图2～3中，1表示样品进行10^-8稀释；2表示样品进行10^-9稀释；3表示样品进行10^-10稀释；4表示样品进行10^-11稀释；Neg.为阴性反应对照。由该结果可知，该检测方法可以检测到进行10^-11稀释的质粒样品，样品中含有0.65个拷贝的p72质粒DAN和0.72个拷贝的p54质粒DNA。

实施例7检测方法的变异性分析

分别采用实施例5制备的等量的4份不同浓度梯度的样品作为模板，利用实施例3的检测试剂盒配合实施例3提供ASFV双基因实时荧光定量PCR检测方法进行扩增，每份模板每个浓度做3个重复，以确定该方法的批内差异；在不同的时间段对4份不同浓度梯度的模板进行3次实时荧光PCR试验，以确定该方法的批间差异。

结果如表9、表10所示，双基因检测试剂盒基于p72基因质粒批内变异试验结果显示，变异系数在0.199％～1.698％，批间变异试验结果显示，变异系数在1.664％～2.283％；基于p54基因质粒批内变异试验结果显示，变异系数在0.150％～1.591％，批间变异试验结果显示，变异系数在1.927％～2.535％，均小于5％，表明本发明提供的双基因实时荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法的重复性良好。

表9双基因检测试剂盒基于p72基因质粒变异性试验分析结果

表10双基因检测试剂盒基于p54基因质粒变异性试验分析结果

实施例7临床样品的检测

采用实施例3的检测试剂盒配合在可进行非洲猪瘟病毒的检测的兽医实验室进行了临床样本检测，并与商品化的检测试剂盒进行了进一步比对验证。对疑似的30临床样品进行检测，检出率为2.5％(1/40)，且双基因检测均为阳性，与商品化检测试剂盒的符合为100％，表明本检测方法可用于临床样本检测。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院

<120> 基于双基因检测非洲猪瘟病毒的PCR引物组、试剂盒及应用

<130> KHP201110523.5

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagatcagcc gtagtgatag acc 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcagctctt acataccctt cc 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actgggttgg tattcctccc 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggattttgat cggagatgtt cc 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtgtccata aaacgcagg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

attgttggtg tgggtcacc 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctgctgttt ggatattgtg ag 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gccctctcct atgcaacatt c 21

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taggtttgct ttrgtgcg 18

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagtagtgac tgtcgtgtaa ggc 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

accagttacg gacaacccag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcaacaaaca gaccagcaac 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gactggcttg cctacacttg 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caagatcagc agtgggtaga ag 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cctggttgtg gagtgacttc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttcctcctca ayagcagcag 20

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgtttgtcac cagtcactac acc 23

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gactaagacc acgmtagcaa tgag 24

<210> 19

<211> 139

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aagatcagcc gtagtgatag accccacgta atccgtgtcc caactaatat aaaattctct 60

tgctctggat acgttaatat gaccactggg ttggtattcc tcccgtaact ggtttgtttc 120

tgggttgtcc gtaactggt 139

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

catttgaaaa ccaaccaaag aat 23

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgaagatact gatggcagat atggt 25

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

agctcagagc ttattagcta cgtgtgcac 29

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acaattagcc ttgtgctggg ac 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgttcgagca tgtwaatgca at 22

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tgtttgccgg caaaactacg tttct 25

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aatattcagc ctgrccg 17

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

acaaagcgta tcaaaccc 18

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

caatactctt aaaccgrggc 20

Claims (10)

1.基于B646L和E183L双基因检测非洲猪瘟病毒的PCR引物组，其特征在于，包含2对特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。

2.与权利要求1所述的PCR引物组配套使用的探针组，其特征在于，包含2条探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。

3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述探针的5’端标记的荧光基团为选自FAM、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记的淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

4.权利要求1所述的PCR引物组或权利要求2或3所述的探针组在制备用于非洲猪瘟病毒检测的试剂盒中的应用。

5.一种用于检测非洲猪瘟病毒的检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的PCR引物组；

优选地，所述检测试剂盒还包含权利要求2或3所述的探针组。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包含PCR反应液和/或对照品；

优选所述对照品为含有特定DNA片段的质粒，所述特定DNA片段的核苷酸序列中含有检测B64L6基因的上游引物、探针的核苷酸序列及检测E183L基因的下游引物翻转、互补后的核苷酸序列；或者，含有检测E183L基因的上游引物、探针的核苷酸序列及检测B64L6基因的下游引物翻转、互补后的核苷酸序列。

7.根据权利要求5或6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒在工作时的反应程序如下：95℃、30s；95℃、5s，60℃、20s，采集荧光信号，35个循环；

所述检测试剂盒在工作时的反应体系如下：

待测样品的20μL反应体系：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液1.5μL，E183L基因引物探针混合液1.5μL，待测样品7μL；

阳性对照的20μL反应体系：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液1.5μL，E183L基因引物探针混合液1.5μL，对照品7μL；

阴性对照的20μL反应体系：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液或者E183L基因引物探针混合液1.5μL，对照品8.5μL；

其中，所述B646L基因引物探针混合液包含10μM SEQ ID NO.1所示的引物、10μM SEQID NO.2所示的引物和5μM SEQ ID NO.5所示的探针；所述E183L基因引物探针混合液包含10μM SEQ ID NO.3所示的引物、10μM SEQ ID NO.4所示的引物和5μM SEQ ID NO.6所示的探针；所述PCR反应液包含DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP混合物；所述反应缓冲液中含有80-100mM KCl、pH 8.5的15-20mM Tris-HCl、4-5mM MgCl₂；所述dNTP混合物含有dATP、dGTP、dCTP和dTTP各0.4-0.8mM。

8.一种非洲猪瘟病毒的双基因实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括：提取待测样品中的病毒DNA，以所述病毒DNA为模板，利用权利要求1所述的PCR引物组，或者利用权利要求1所述的PCR引物组和权利要求2或3所述的探针组，或者利用权利要求5或6所述的检测试剂盒，进行双基因实时荧光定量PCR，根据扩增曲线和/或Ct值判断检测结果。

9.根据权利要求8所述的非洲猪瘟病毒的双基因实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述双基因实时荧光定量PCR的反应程序如下：95℃、30s；95℃、5s，60℃、20s，采集荧光信号，35个循环。

10.根据权利要求8或9所述的非洲猪瘟病毒的双基因实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述双基因实时荧光定量PCR的待测样品的20μL反应体系如下：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液1.5μL，E183L基因引物探针混合液1.5μL，待测样品DNA 7μL；

阳性对照的20μL反应体系如下：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液1.5μL，E183L基因引物探针混合液1.5μL，对照品7μL；

阴性对照的20μL反应体系如下：2×PCR反应液10μL，B646L基因引物探针混合液或者E183L基因引物探针混合液1.5μL，对照品8.5μL；

其中，所述B646L基因引物探针混合液包含10μM SEQ ID NO.1所示的引物、10μM SEQID NO.2所示的引物和5μM SEQ ID NO.5所示的探针；所述E183L基因引物探针混合液包含10μM SEQ ID NO.3所示的引物、10μM SEQ ID NO.4所示的引物和5μM SEQ ID NO.6所示的探针；所述PCR反应液包含DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP混合物；所述反应缓冲液中含有80-100mM KCl、pH 8.5的15-20mM Tris-HCl、4-5mM MgCl₂；所述dNTP混合物含有dATP、dGTP、dCTP和dTTP各0.4-0.8mM。

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