CN114774590B - 检测非洲猪瘟病毒的双靶标组合、引物组合、试剂、试剂盒及方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于生物技术领域，公开了检测非洲猪瘟病毒的双靶标组合、引物组合、试剂、试剂盒及方法和应用，所述双靶标组合为非洲猪瘟病毒的B646L基因和P1192R基因，所述引物组合如SEQ ID NO.1~12所示。采用本申请引物组合基于RT‑LAMP检测体系可快速检测样本中的非洲猪瘟病毒，具有检出限低，特异性好的优点，且降低了核酸检测的技术门槛，普通人经过简单培训便能进行操作满足对病毒的核酸检测。

Description

检测非洲猪瘟病毒的双靶标组合、引物组合、试剂、试剂盒及 方法和应用

技术领域

本申请属于生物技术领域，具体设计一种检测非洲猪瘟病毒的双靶标组合、引物组合、试剂、试剂盒及方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefevervirus，ASFV)引起的烈性传染病，主要感染家猪和各种野猪，感染后会出现发热、心跳加快、呼吸困难等症状，发病时间短，急性致死率高达100％，是重点防范的一类动物疫情。且非洲猪瘟的传播方式复杂，可通过病猪之间接触迅速传播，也可能因为接触携带病毒的人或设备而感染猪群。同时非洲猪瘟病毒的存活能力极强，在生肉熏肉中也可存活3-6个月，猪肉产品、食物残渣等都可能是重要的污染源。因此一旦出现非洲猪瘟的感染，需要立即进行大量样本的检测，但非洲猪瘟的临床症状与猪瘟症状相似，一般的临床检测无法进行区分，只能依靠实验室进行分析检测确诊。

现有的实验室检测方法主要有血清学方法和病原学方法。血清学检测方法主要有间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验和间接荧光抗体试验等。病原学方法主要以样本内脏血液、口腔粘液等进行的普通PCR和荧光PCR核酸检测方法，但是传统PCR检测要求较高，需要价格高昂的设备和专业的操作技术人员，且检测时间长，不利于大规模的检测，目前仅是作为实验研究使用。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本学者Notomi T于2000年发明的一种新的DNA扩增技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60分钟左右即可实现10⁹～10¹⁰倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。同时为了提高反应速度，还可以通过引入两条环引物加快反应，环引物与合成过程中形成的环状区域互补，增加了在LAMP反应中DNA合成的起点数量，可大大缩短检测时间，提高检测效率。该技术除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，环介导等温扩增反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。

但是目前针对非洲猪瘟病毒引起的非洲猪瘟均是以单个病毒基因作为检测靶标，经常出现漏检导致的假阴性结果，因此针对非洲猪瘟病毒单个病毒基因的检出限在日常使用中还存在不准确的缺陷。

发明内容

针对现有单个病毒基因LAMP反应检测非洲猪瘟病毒经常出现漏检导致的假阴性缺陷，本申请构建了一种针对非洲猪瘟病毒的双靶点RT-LAMP检测体系。

为了实现本申请的技术目的，本申请主要包括以下技术内容：

作为本申请的一个实施方案，提供了一种检测非洲猪瘟病毒的双靶标组合，所述双靶标组合为非洲猪瘟病毒的B646L基因和P1192R基因。

所述B646L基因在NCBI中非洲猪瘟病毒序列(MK128995.1,21-JUL-2021)的起止位点为：103607-105547，所述P1192R基因在NCBI中非洲猪瘟病毒序列(MK128995.1,21-JUL-2021)的起止位点为：147556-151134。

现有常规针对非洲猪瘟病毒的检测大多以B646L基因作为靶标基因，本申请在B646L基因的基础上，将非洲猪瘟病毒的B646L基因和P1192R基因进行多重分子检测，有效避免因单个基因突变而造成的假阴性结果，而且采用本申请双靶标组合对非洲猪瘟病毒检测的检出限远低于B646L基因单靶标检测，能够提高待测样本的阳性检出率。

作为本申请的第二个实施方案，提供一种检测非洲猪瘟病毒的引物组合，所述引物组合特异性的基于RT-LAMP法检测非洲猪瘟病毒的B646L基因和P1192R基因。

所述引物组合为用于扩增B646L基因的第一引物组和用于扩增P1192R基因的第二引物组。

所述第一引物组由第一外引物对、第一内引物对和第一环引物对组成。

所述第一外引物对如下(a1)或(a2)：

(a1)如SEQ ID NO.1～2所示的单链DNA分子；

(a2)将(a1)中所述单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；

所述第一内引物对为如下(b1)或(b2)：

(b1)如SEQ ID NO.3～4所示的单链DNA分子；

(b2)将(b1)中所述单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；

所述第一环引物对为如下(c1)或(c2)：

(c1)如SEQ ID NO.5～6所示的单链DNA分子；

(c2)将(c1)中所述单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；

所述第二引物组由第二外引物对、第二内引物对和第二环引物对组成。

所述第二外引物对为如下(d1)或(d2)：

(d1)如SEQ ID NO.7～8所示的单链DNA分子；

(d2)将(d1)中所述单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；

所述第二内引物对为如下(e1)或(e2)：

(e1)如SEQ ID NO.9～10所示的单链DNA分子；

(e2)将(e1)中所述单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；

所述第二环引物对为如下(f1)或(f2)：

(f1)如SEQ ID NO.11～12所示的单链DNA分子；

(f2)将(f1)中所述单链DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子。

本申请分别针对B646L基因和P1192R基因设计了特异的引物组，该引物组合中的引物之间不存在互补配对的缺陷，有效避免了引物二聚体条带对扩增产物的影响，减少了引物之间的消耗，提高了扩增效率，增加成功率，且极大的降低了对目标基因的检出限，具有强敏感性。

作为本申请的第三个实施方案，提供了一种检测非洲猪瘟病毒的试剂，所述试剂包含第一外引物对、第一内引物对、第二外引物对和第二内引物对。

优选的，所述试剂还包含第一环引物对和第二环引物对。

优选的，所述第一外引物对、第一内引物对和第一环引物对的摩尔比为8:1:4，所述第二外引物对、第二内引物对和第二环引物对的摩尔比为8:1:4，每对引物对中上下游引物的摩尔比为1:1。

优选的，所述试剂包含所述引物组合、DNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阴性对照和孔雀石绿。

所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

所述LAMP反应液含有dNTP、DEPC H₂O缓冲液和MgSO₄。

作为本申请的第四个实施方案，提供了一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒包含所述试剂。

作为本申请的第五个实施方案，提供了一种非疾病诊断检测非洲猪瘟病毒的方法，包括：

对待测样本进行预处理的步骤；

对预处理得到的样本采用所述引物组合进行RT-LAMP扩增反应的步骤；以及

对扩增产物进行分析的步骤。

在本实施方案中，可在所述RT-LAMP扩增反应中增加显色剂或荧光物质，通过颜色变化或荧光检测进行结果的判定。

优选的，所述的显色剂选自钙黄绿素或孔雀石绿中之一种，所述荧光物质选自异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明中之一种。

在本实施方案中，所述RT-LAMP扩增反应条件为：65℃条件下加热40分钟。

作为本申请的第六个实施方案，所述引物组合或所述试剂或所述试剂盒在如下(g1)或(g2)或(g3)中的应用：

(g1)检测或辅助检测非洲猪瘟病毒；

(g2)检测或辅助检测待测样本是否含非洲猪瘟病毒；

(g3)检测或辅助检测待测样本中非洲猪瘟病毒的含量。

本申请的有益效果为：

本申请以P1192R基因和B646L基因作为非洲猪瘟病毒的双靶标，利用双重环介导等温扩增技术检测，极大的提高了针对非洲猪瘟病毒的检出限，克服了以单靶标检测的假阴性缺陷。同时分别针对P1192R基因和B646L基因设计了各自特异的引物组，且各引物之间不存在互补配对的情况，具有良好的扩增效率。

另外，本申请降低了核酸检测的技术门槛，普通人经过简单培训便能进行操作满足对病毒的核酸检测。实现了裸眼检测的需求，整个过程在1h内完成，从而满足快速检测的需求。

附图说明

图1是本申请RT-LAMP扩增产物的显色变化；

图2是本申请引物组合的灵敏度结果；其中，A为B646L基因，B为P1192R基因，C为B646L基因和P1192R基因；

图3是本申请引物组合的特异性结果；其中，A为实时荧光，B为琼脂糖凝胶电泳结果。

具体实施方式

下面将对本申请技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方案仅仅是本申请技术体系的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本申请中的实施方案，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方案，都属于本申请保护的范围。

由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的非洲猪瘟(AfricanSwine Fever，ASF)作为一种烈性传染病，对养猪产业造成了严重影响，是重点防范的一类动物疫情。因此如何简便、准确的检测非洲猪瘟病毒一直是本领域的研究重点。

本申请针对非洲猪瘟病毒提出一种双靶标的检测体系，该双靶标分别为非洲猪瘟病毒的P1192R基因和B646L基因，其中，B646L基因作为现有常规的非洲猪瘟病毒的检测靶点，现有技术均是以该靶点作为检测非洲猪瘟病毒的目标基因，但是针对B646L基因的检测，由于检出限的原因经常出现漏检导致的假阴性缺陷。为此，申请人在B646L基因的基础上，进一步开发了非洲猪瘟病毒的P1192R基因，发现利用P1192R基因和B646L基因的多重检测，可以极大的降低非洲猪瘟病毒的检出限，从而实现对非洲猪瘟病毒的强敏感性。

其中，P1192R基因在NCBI中非洲猪瘟病毒序列(MK128995.1,21-JUL-2021)的起止位点为：147556-151134。

针对P1192R基因和B646L基因的检测，可以采用本领域技术人员常用的检测手段，比如间接酶联免疫吸附法、阻断酶联免疫吸附法和间接荧光抗体法，还可以是酶联免疫吸附反应(ELISA)、定性PCR技术、实时荧光定量PCR技术和环介导等温扩增技术(LAMP)等的分子检测方法。本申请中选用多重环介导等温扩增技术对P1192R基因和B646L基因进行检测，具有检测快、操作简单、设备要求低的特点，特别适用一线场景中针对非洲猪瘟病毒的检测。

基于RT-LAMP检测体系，申请人分别以B646L基因和P1192R基因中六个不同的区域设计了4对引物，针对B646L基因的外引物对SEQ ID NO.1～2和内引物对SEQ ID NO.3～4，针对P1192R基因的外引物对SEQ ID NO.7～8和内引物对SEQ ID NO.9～10。为了进一步加快检测时间，申请人还提供了靶基因的环引物，B646L基因的环引物如SEQ ID NO.5～6所示，P1192R基因的环引物如SEQ ID NO.11～12所示。

如SEQ ID NO.1～6所示核苷酸序列组成了针对B646L基因的基于LAMP的检测体系，如SEQ ID NO.7～12所示核苷酸序列组成了针对P1192R基因的基于LAMP的检测体系。如SEQ ID NO.1～6和SEQ ID NO.7～12所示核苷酸序列共同组成了基于RT-LAMP法的针对B646L基因和P1192R基因的检测体系。

同时，将如SEQ ID NO.1～12所示序列单链DNA分子分别经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子，也在本申请的保护范围之内，可以组成基于RT-LAMP法的针对B646L基因和P1192R基因的检测体系，也可以与SEQ ID NO.1～12所示序列单链DNA分子组成基于RT-LAMP法的针对B646L基因和P1192R基因的检测体系。

申请人进一步构建了基于B646L基因和P1192R基因的检测试剂，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1～12所示的引物体系，DNA聚合酶，LAMP反应液，增强剂，以及染料。

其中，DNA聚合酶采用市场上常用的聚合酶，例如taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶，本申请实施方案中优选为Bst DNA聚合酶。

LAMP反应液选用市售反应液，优选含染料的可视反应液，本申请实施方案中LAMP反应液含有dNTP、DEPC H₂O缓冲液和MgSO₄。

增强剂可以为甜菜碱(betaine)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺(formamide)、甘油、硫酸铵或BSA中之一种。甜菜碱可以通过减小二级结构的形成来提高DNA的扩增，消除DNA融化/变性时对碱基对的依赖，提高特异性。二甲基亚砜可以降低DNA的二级结构，通常在扩增GC含量很高的基因样本的时候都会添加；二甲基亚砜也会大大降低Taq聚合酶(Taqpolymerase)的活性(activity)，使用时需要权衡好模板的接近率(templateaccessibility)和聚合酶的活性。甲酰胺可以和DNA中的大沟(major groove)和小沟(minor groove)相结合，从而降低母版DNA双螺旋的稳定性并且减低DNA的解链温度(melting temperature)。甘油可以提高产量，增加酶的稳定性。硫酸铵可增加反应体系的离子强度，改变DNA的变性及退火温度，调节酶活。BSA在PCR反应中对于减少污染物，例如酚类化合物(phenolic compounds)有一定帮助，而且可减少反应物附着在试管壁的情况。本申请方案中增强剂优选为甜菜碱。

染料可以为Calcein(钙黄绿素)、SYBR Green I、Eva Green、Malachite Green和HNB中之一种。具体的Calcein对反应速度的影响小，是适合反应前加人环介导等温扩增反应以观察颜色变化的颜色指示剂。HNB的抑制作用最大且容易导致反应稳定性差，不建议用作LAMP反应的颜色指示剂。而SYBR Green I和Eva Green能特异的掺入DNA双链，发出荧光信号，但由于存在二聚体的干扰，对于单链DNA的染色效果在扩增前后变化并不明显。Malachite Green作为一种新型染料，可以避免引物二聚体的干扰，且具有高灵敏度。因此，本申请方案中染料优选为Malachite Green。

以所述试剂在反应体系中的终浓度为基准，所述试剂中MgSO₄的浓度为0.6-0.8mM；Betaine的浓度为0.8-1.6M；BSA的浓度为0.4-0.5U/μL；Malachite Green的浓度为0.008％-0.032％；Bst的浓度为0.32-1U/μL，dNTP的浓度为1.4mM。

分别配制所述试剂、所述引物组合以及阳性对照和阴性对照装管，加贴标贴即可组成用于检测非洲猪瘟的试剂盒。阳性对照可以是含有B646L基因序列和P1192R基因序列的质粒，也可以是ASFV的重组质粒，阴性对照为缓冲液，可以是PBS或DEPC水溶液。

进而申请人构建了一种基于RT-LAMP法检测非洲猪瘟病毒的方法，将处理好的样本置于所述试剂体系中，在恒温容器中65℃反应40min，然后对扩增产物进行分析。

其中，预处理可以是采用DNA试剂盒对样本进行提取，得到的DNA基因，从而以该DNA为模板进行扩增。对样本的预处理也可以是采用免提取缓冲液对样本进行处理后，直接置于所述试剂体系中进行反应，从而得到扩增产物。

对扩增产物的分析可以是裸眼观察，比如染料钙黄绿素或孔雀石绿引起的扩增前后颜色变化，反应结束后观察LAMP反应液是否发生颜色变化。也可以是将产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，在紫外灯下照射下观察是否有强烈的荧光产生，或者采用荧光仪检测荧光信号，比如染料异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明，反应过程中，采用荧光仪检测荧光信号，观察实时荧光曲线的出峰时间，以阴性对照作为参照，根据Ct值进行结果的分析判断。

上述构建的检测方法可以作为检测或辅助检测待测样本中的非洲猪瘟病毒的用途，所述待测样本可以是具有生命的猪本身，也可以是宰杀的猪肉产品，还可以是利用猪肉加工的食品等。

下面结合具体的实施例对本申请技术方案进行说明。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1RT-LAMP检测引物设计

在NCBI中查找非洲猪瘟病毒序列(MK128995.1,21-JUL-2021)中B646L基因(起止位点：103607-105547)和P1192R基因(起止位点：147556-151134)的基因序列，根据P1192R基因和B646L基因序列设计如下引物：

表1非洲猪瘟病毒的B646L基因引物

表2非洲猪瘟病毒的P1192R基因引物

实施例2RT-LAMP检测试剂及试剂盒

1)检测试剂

用于检测非洲猪瘟病毒的RT-LAMP反应试剂包括DEPC H₂O缓冲液、MgSO₄、dNTP、20×Primer Mix-B646L、20×Primer Mix-P1192R、Betaine、Malachite Green、Bst酶。

上述RT-LAMP试剂中，MgSO₄的浓度为0.7mM；Betaine的浓度为1.2M；MalachiteGreen的浓度为0.02％；Bst的浓度为0.6U/μL；dNTP的浓度为1.4mM。

20×PrimerMix由下表中各引物按比例混合制备：

表3 20×PrimerMix配制

表4 20×Primer Mix配制

2)试剂盒组装

引物配制：将合成的人工引物F3-B646L、B3-B646L、FIP-B646L、BIP-B646L、LF-B646L、LB-B646L分别用DEPC处理水稀释至100μM，将合成的人工引物F3-P1192R、B3-P1192R、FIP-P1192R、BIP-P1192R、LF-P1192R、LB-P1192R分别用DEPC处理水稀释至100μM，按照F3-B646L、B3-B646L、FIP-B646L、BIP-B646L、LF-B646L、LB-B646L摩尔比为8:8:1:1:4:4将稀释后的引物混匀，按照F3-P1192R、B3-P1192R、FIP-P1192R、BIP-P1192R、LF-P1192R、LB-P1192R摩尔比为8:8:1:1:4:4将稀释后的引物混匀。

免提取缓冲液的配制：2.5mM TCEP，1mM EDTA，pH＝7～9，装成小管，加贴标签。

RT-LAMP反应液的配制：取DEPC-H₂O 2.25μl，ISO 3μl，0.7mM MgSO₄1.8μl，dNTP4.2μl，20×Primer Mix-B646L 1.5μl，20×Primer Mix-P1192R 1.5μl，1.2M Betaine 6μl，0.32％Malachite Gre en 2.25μl，0.6U/μL Bst 1.5μl，混匀后(全程无菌低温)加贴标签。

阴性对照：1％DEPC水溶液，无菌分装，加贴标签。

实施例3RT-LAMP检测方法的构建

采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒提取样本DNA，以提取的样本DNA为模板置于30μl的RT-LAMP反应体系中，将其置于恒温容器中进行扩增反应。其中30μl的RT-LAMP反应体系如表5。

表5含有孔雀石绿的显色反应体系

在65℃恒温容器中反应40min，观察扩增产物颜色变化。

当反应产物颜色为蓝色时表示进行了阳性扩增，待测样本中含有非洲猪瘟病毒，反应产物颜色为无色时表示未进行阳性扩增，待测样本中不含有非洲猪瘟病毒。

以pUC57质粒(购于生工生物工程(上海)股份有限公司)为骨架，构建含有非洲猪瘟病毒B646L基因序列和P1192R基因序列的质粒作为阳性组，将得到质粒利用实施例2中免提取液处理混合，和对照组(不含质粒只有水)分别加入RT-LAMP反应体系中反应，质粒浓度为10¹copies/μL，40分钟后观察。

如图1所示，对照组扩增产物颜色无变化，含有非洲猪瘟病毒B646L基因序列和P1192R基因序列的质粒扩增产物颜色变为蓝色。

实施例4检测实验

1.灵敏度验证

1.1样本准备：以pUC57质粒(购于生工生物工程(上海)股份有限公司)为骨架，构建含有非洲猪瘟病毒B646L基因序列和P1192R基因序列的质粒，作为后续灵敏度实验的样本。将含有pUC57-B646L和pUC57-P1192R的水溶液以10倍差进行样本稀释，得到浓度分别为2×10⁰copies/μL、2×10¹copies/μL、2×10²copies/μL、2×10³copies/μL、2×10⁴copies/μL样本溶液，冻存于-20℃备用。

1.2灵敏度测试方法：

将上述不同浓度的pUC57-B646L质粒样本和对照组(不含质粒只有水)分别加入实施例3构建的RT-LAMP反应体系中进行qPCR实验，在65℃条件下进行反应。

结果如图2中A所示，浓度为2×10¹copies/μL、2×10²copies/μL、2×10³copies/μL、2×10⁴copies/μL的pUC57-B646L质粒样本的荧光强度在10min以后均可以明显的观察到，而浓度为2×10¹copies/μL、2×10²copies/μL的pUC57-B646L质粒样本，以及对照组则没有任何的变化，说明本申请RT-LAMP反应体系对pUC57-B646L质粒样本的检出限为2×10¹copies/μL。

将上述不同浓度的pUC57-P1192R质粒样本和对照组(不含质粒只有水)分别加入实施例3构建的RT-LAMP反应体系中进行qPCR实验，在65℃条件下进行反应。

结果如图2中B所示，浓度为2×10¹copies/μL、2×10²copies/μL、2×10³copies/μL、2×10⁴copies/μL的pUC57-P1192R质粒样本的荧光强度在10min以后均可以明显的观察到，而浓度为2×10¹copies/μL、2×10²copies/μL的pUC57-P1192R质粒样本，以及对照组则没有任何的变化，说明本申请RT-LAMP反应体系对pUC57-B646L质粒样本的检出限为2×10¹copies/μL。

将上述不同浓度的pUC57-P1192R和pUC57-B646L质粒样本混合作为实验组，和对照组(不含质粒只有水)分别加入实施例3构建的RT-LAMP反应体系中进行qPCR实验，在65℃条件下进行反应。

结果如图2中C所示，浓度为2×10⁰copies/μL、2×10¹copies/μL、2×10²copies/μL、2×10³copies/μL的实验组的荧光强度在10min以后均可以明显的观察到，而对照组则没有任何的变化，说明本申请RT-LAMP反应体系对pUC57-P1192R和pUC57-B646L的混合质粒的检出限为2×10⁰copies/μL。

从图2中可以看出，本申请针对B646L基因和P1192R基因在本申请RT-LAMP反应体系中的检出限为2copies/μL。

2.特异性验证

2.1样本准备：实验组猪圆环病毒(PCV-1)、猪繁殖与呼吸障碍(PRRSV)、猪瘟病毒(SFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PrV)的样本由青岛海关山东国际旅行卫生保健中心提供，非洲猪瘟病毒(ASFV)质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.1测试方法：将上述各组样本和对照组(不含任何核酸样本)分别加入LAMP反应体系中，在65℃下进行qPCR实验。同时在65℃条件下加热反应40分钟后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，在紫外光下观察电泳结果。

由图3中A中可以看出，在65℃条件下加热反应40分钟后，ASFV组的荧光强度达到了28A.U.左右，图3中B的电泳图显示仅有ASFV组出现电泳条带，表明本发明设计的引物组特异性扩增ASFV病毒，对其他病毒无扩增反应，避免因其他病毒造成的假阳性结果。

尽管已经示出和描述了本申请的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本申请的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本申请的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 检测非洲猪瘟病毒的双靶标组合、引物组合、试剂、试剂盒及方法和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtgatagac cccacgtaat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atttccgtaa ctgctcatgg 20

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgcgatgat gattaccttt gctttctgga tacgttaata tgaccact 48

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatcatcggg ggttttaatc gcattcgata aatttccatc aaagttctgc 50

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagccacgg gaggaatacc aac 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtagtggaa gggtatgtaa gagc 24

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacccagac gcagtcca 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacatgtcgc catggtgat 19

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctcgatggc atccagcttg tgacgaattc cttgcagcct 40

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgcaaaattt tagccggggg gcccccgaac tgaaaaacct t 41

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccttggtat ctacttgcag atg 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtgaaatgct tcgcctccaa c 21

Claims (5)

1.一种检测非洲猪瘟病毒的试剂，其特征在于，所述试剂体系为：DEPC-H₂O 2.25μl，ISO3μl，0.7mM MgSO₄ 1.8μl，dNTP 4.2μl，20×Primer Mix-B646L 1.5μl，20×Primer Mix-P1192R 1.5μl，1.2M Betaine 6μl，0.32% Malachite Green 2.25μl，0.6 U/μL Bst 1.5μl，样本6μl；

其中，引物体系为用于扩增B646L基因的第一引物组和用于扩增P1192R基因的第二引物组；所述第一引物组由第一外引物对、第一内引物对和第一环引物对组成；所述第二引物组由第二外引物对、第二内引物对和第二环引物对组成；20×Primer Mix-B646L为：以各引物浓度为100μM计，第一外引物对各引物2μl，第一内引物对各引物16μl，第一环引物对各引物4μl，H₂O 6μl；20×Primer Mix-P1192R为：以各引物浓度为100μM计，第二外引物对各引物2μl，第二内引物对各引物16μl，第二环引物对各引物4μl，H₂O 6μl；

所述第一外引物对为如SEQ ID NO.1~2所示的单链DNA分子；

所述第一内引物对为如SEQ ID NO.3~4所示的单链DNA分子；

所述第一环引物对为如SEQ ID NO.5~6所示的单链DNA分子；

所述第二外引物对为如SEQ ID NO.7~8所示的单链DNA分子；

所述第二内引物对为如SEQ ID NO.9~10所示的单链DNA分子；

所述第二环引物对为如SEQ ID NO.11~12所示的单链DNA分子。

2.一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述试剂。

3.一种非疾病诊断检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，包括：

对待测样本进行预处理的步骤；

对预处理得到的样本采用权利要求1所述试剂进行RT-LAMP扩增反应的步骤；以及

对扩增产物进行分析的步骤。

4.根据权利要求3所述的一种非疾病诊断检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，所述RT-LAMP扩增反应条件为：65℃条件下加热40分钟。

5.权利要求1所述试剂或权利要求2所述试剂盒非疾病诊断目的的在检测非洲猪瘟病毒中的应用。