CN112063757A - 一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用，属于微生物检测技术领域。本发明提供的用于检测非洲猪瘟病毒的引物能够特异性扩增非洲猪瘟病毒的K205R基因序列或其部分序列，具有特异性好、灵敏度高的特点，可以应用于普通PCR平台或者ddPCR平台对非洲猪瘟病毒进行（绝对）定量检测。其中，基于染料法ddPCR技术的检测灵敏度明显高于普通PCR和实时荧光定量PCR（10倍），不仅简化了操作步骤，还能在临床上更加快速、准确地检测出ASFV潜伏期感染的个体，同时对ASFV病毒拷贝数进行绝对定量，为进一步合理制定猪场的防控治疗措施提供了保障。

Description

一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用。
背景技术
非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus，ASFV)是一种大型、包膜的双链DNA病毒，主要在巨噬细胞的细胞质中复制。ASFV感染可引起非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)，表现为急性、严重的出血热，在家猪和野猪中死亡率较高。
ASFV基因组为双链DNA分子，长度为170-193kb。不同的病毒株因基因组可变区长度不同，基因组大小存在差异。目前已知基因组有151-167个开放阅读框，编码170多种蛋白质，成熟的病毒粒子包含54种结构蛋白。
ASFV颗粒具有由几个同心结构域组成的二十面体形态，由中心基因组形成的内核包含核仁，其被称为核壳的厚蛋白质层包覆，然后是围绕内核的内部脂质包膜，最后是衣壳，也是病毒粒子的最外层。根据编码衣壳蛋白p72的B646L基因序列的不同，AFSV至少可分为24个基因型。根据病毒粒子不同的抗原性，ASFV可分为8个血清型。
研究表明，ASFV可通过猪之间直接接触传播，如口鼻、皮肤伤口等。感染猪的血液中含量大量的病毒，病毒同时也存在于排泄物和分泌物中(如尿液、唾液、粪便等)。ASFV可在肉制品中存活数周至数月，饲喂带毒的餐厨剩余物是导致家猪感染ASFV的重要途径。
目前，ASFV的核酸检测方法主要有普通PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增(LAMP)等。普通PCR是最常用的实验室检测方法，具有简单快速、对样品纯度要求低等特点，广泛应用于ASFV的现场检测。由于PCR反应完成后，产物需要进行琼脂糖核酸电泳，观察有无特异性条带，此过程需要开盖，容易造成交叉污染，导致假阳性结果的出现。qPCR与传统的定量技术(如半定量PCR、竞争定量PCR)相比具有重复性好、自动化程度高等优点，但是，在检测过程中需要注意规范操作，否则易出现污染，干扰检测结果。LAMP是在恒温条件下完成的核酸扩增方法，不需要特殊的仪器设备，可以在短时间内肉眼判读结果。但是该方法因缺乏热循环过程中的变性、退火等程序，检测结果易出现假阳性。
数字PCR(ddPCR)是一种基于PCR反应的单分子绝对定量技术，可以精确检测目标基因的拷贝数。在ddPCR方法中，PCR体系被分割成上万个均匀的液滴，目标基因在微滴中分别扩增，成为阳性微滴，然后根据泊松分布计算确定目标基因的确切数量。由于可以绝对定量和具有较高的检测灵敏度，ddPCR经常用于各种研究应用，如病原体检测、突变检测、转基因研究等。将ddPCR技术用于ASFV的检测，在临床上可以更加准确地检测出ASFV潜伏期感染的个体，同时还能对ASFV病毒拷贝数进行绝对定量，有利于病毒感染的早期检测，从而为进一步合理制定猪场的防控治疗措施提供保障。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物，该引物能够特异性扩增非洲猪瘟病毒的K205R基因序列或其部分序列。
其次，本发明提供一种包含上述用于检测非洲猪瘟病毒的引物的试剂盒，该试剂盒能够快速、准确地检测非洲猪瘟病毒，具有特异性好、灵敏度高的特点。
再次，本申请提供一种上述引物或试剂盒在检测非洲猪瘟病毒方面的应用。
最后，本发明提供一种上述引物或试剂盒在疫苗生产质量控制方面的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物，所述引物根据非洲猪瘟病毒的K205R基因序列(例如，Sequence:NC_044959.1(63193..63810)，Gene ID:41902818)设计合成。所述引物的设计遵循本领域的通用准则，采用常规的引物设计软件完成。
进一步优选的，所述引物根据SEQ ID NO.1所示的特异序列或其同源序列设计合成。
更进一步优选的，所述引物根据SEQ ID NO.2所示的特异序列设计合成。
具体的，用于检测非洲猪瘟病毒的引物，序列如下所示：
正向引物：5’-GAGCCATTATCGCCCAACT-3’(SEQ ID NO.3所示)；
反向引物：5’-CGGGAGGACTCGTTTGTT-3’(SEQ ID NO.4所示)。
所述引物可以结合普通PCR技术或者数字PCR技术对非洲猪瘟病毒进行检测。尤其是用于绝对定量检测非洲猪瘟病毒，具有特异性好、灵敏度高的特点。
一种用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括：一对或多对引物；所述引物根据非洲猪瘟病毒的K205R基因序列(Sequence:NC_044959.1(63193..63810)，GeneID:41902818)设计合成。
进一步优选的，所述引物根据SEQ ID NO.1所示的特异序列或其同源序列设计合成。
更进一步优选的，所述引物根据SEQ ID NO.2所示的特异序列设计合成。
具体的，所述引物的序列如下所示：
正向引物：5’-GAGCCATTATCGCCCAACT-3’(SEQ ID NO.3所示)；
反向引物：5’-CGGGAGGACTCGTTTGTT-3’(SEQ ID NO.4所示)。
进一步优选的，所述试剂盒中还包括：一种或多种促进聚合酶链式反应的试剂；所述试剂包括：反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶，ddH2O等中的一种或多种。
更进一步优选的，所述试剂基于染料法数字PCR技术添加，用于非洲猪瘟病毒的绝对定量检测，具体包括：ddPCR Supermix(含ddPCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、荧光染料)、ddH2O、非洲猪瘟病毒DNA阳性标准品(含非洲猪瘟病毒DNA的质粒，质粒上插入的片段序列如SEQ ID NO.5所示)、微滴生成油中的一种或多种。
所述试剂盒可以用于普通PCR平台进行非洲猪瘟病毒的相关检测，也可以用于ddPCR平台进行绝对定量检测，均具有特异性好、灵敏度高的特点。
一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物或试剂盒在检测非洲猪瘟病毒方面的应用。
进一步优选的，所述引物或试剂盒在绝对定量检测非洲猪瘟病毒方面的应用。
所述绝对定量检测非洲猪瘟病毒的方法，具体为ddPCR方法，其包括：
将包含引物的PCR预混液形成微滴，并进行ddPCR反应；
所述PCR预混液中包含的引物，序列如下所示：
正向引物：5’-GAGCCATTATCGCCCAACT-3’(SEQ ID NO.3所示)；
反向引物：5’-CGGGAGGACTCGTTTGTT-3’(SEQ ID NO.4所示)；
然后进行分析检测，即可。
上述基于染料法数字PCR的检测技术可以对非洲猪瘟病毒进行绝对定量检测，检测灵敏度高于普通PCR和实时荧光定量PCR。
一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物或试剂盒在疫苗生产质量控制方面的应用。
进一步优选的，所述引物或试剂盒在疫苗生产质量控制中绝对定量检测非洲猪瘟病毒的K205R基因方面的应用。
所述绝对定量检测非洲猪瘟病毒的K205R基因的方法，具体为ddPCR方法，其包括：
将包含引物的PCR预混液形成微滴，并进行ddPCR反应；
所述PCR预混液中包含的引物，序列如下所示：
正向引物：5’-GAGCCATTATCGCCCAACT-3’(SEQ ID NO.3所示)；
反向引物：5’-CGGGAGGACTCGTTTGTT-3’(SEQ ID NO.4所示)；
然后进行分析检测，即可。
本发明的有益效果：
本发明提供的用于检测非洲猪瘟病毒的引物，能够特异性扩增非洲猪瘟病毒的K205R基因序列或其部分序列，具有特异性好、灵敏度高的特点，可应用于普通PCR平台或者ddPCR平台对非洲猪瘟病毒进行(绝对)定量检测。K205R基因是在ASFV感染的早期进行表达，在病毒感染4小时后产生一种大约33kDa的蛋白质。以K205R基因进行扩增检测会较扩增其他基因更早得出检测结果，从而加强反应的灵敏性，并且能够在病毒感染的早期及时发现以及应对。此外，将该引物用于疫苗生产质量控制中也属于本发明的保护范围。
本发明提供的用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒可以结合普通PCR技术或者ddPCR技术对非洲猪瘟病毒进行(绝对)定量检测，具有特异性好、灵敏度高的特点。
本发明提供的用于绝对定量检测非洲猪瘟病毒的ddPCR方法，采用SEQ ID NO.3所示的正向引物和SEQ ID NO.4所示的反向引物，并基于染料法ddPCR技术对ASFV进行绝对定量检测，其检测的灵敏度高于普通PCR技术和实时荧光定量PCR技术(10倍)。并且，本发明提供的ddPCR方法可直接定量，不用设置标准曲线，根据检测结果可以直接确定待测样本中ASFV病毒的拷贝数，极大的简化了操作步骤，而且特异性好、灵敏度高。在临床上可以更加准确地检测出ASFV潜伏期感染的个体，同时还能对ASFV病毒拷贝数进行绝对定量，从而为进一步合理制定猪场的防控治疗措施提供保障。
附图说明
图1为本发明实验例中ddPCR最佳退火温度的优化结果；
图2为本发明实验例中不同退火温度下每微升(μL)反应体系中目的基因的拷贝数；
图3为本发明实验例中ddPCR最适引物浓度的优化结果；
图4为本发明实验例中ddPCR特异性检测的分析结果；
图5为本发明实验例中采用qRT-PCR检测的标准曲线；
图6为本发明实验例中qRT-PCR和ddPCR检测结果的相关性分析。
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，以上仅对实验例中使用的附图作简单地介绍。应当理解，上述附图仅示出了本发明的某些实验例，因此不应被看作是对权利保护范围的限定。对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
具体实施方式
为使本发明实施例中的技术方案、解决的技术问题(目的)和技术效果(优点)更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者产品制造商建议的条件进行。所用试剂或者仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售途径购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例中用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用进行具体的说明。
微滴式数字化PCR(droplet digital PCR，ddPCR)的原理是通过无限稀释形成油包水的微滴，从而将PCR反应分配至20000纳升级别的的微滴中进行。PCR反应结束后，通过微滴分析仪检测每个微滴的荧光信号，含有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算得出靶分子的起始拷贝数。与传统的定量相比，ddPCR不需要建立标准曲线就能实现靶分子的绝对定量检测，而且具有特异性强、灵敏度高(最低可检测单拷贝的靶分子)、定量准确等优点。ddPCR已逐渐成为分子生物学研究中的重要工。将ddPCR技术用于ASFV的检测，可以在临床上更加准确地检测出ASFV潜伏期感染的个体，同时还能对ASFV病毒拷贝数进行绝对定量，从而为进一步合理制定猪场的防控治疗措施提供保障。
一种用于绝对定量检测非洲猪瘟病毒的ddPCR方法，其包括以下步骤：
1、待测样本病毒DNA的提取
上述待测样本可以为组织病料或临床血液样本，也可以为病毒的细胞培养物。采用商品化的DNA提取试剂盒提取DNA。
2、ddPCR扩增
配制包含引物的PCR预混液，将PCR预混液形成微滴，并进行ddPCR反应；
所述PCR预混液中包含的引物，序列如下所示：
正向引物：5’-GAGCCATTATCGCCCAACT-3’(SEQ ID NO.3所示)；
反向引物：5’-CGGGAGGACTCGTTTGTT-3’(SEQ ID NO.4所示)。
ASFV数字PCR采用20μL体积反应液，在C1000 Touch Thermal Cycler中进行扩增。
例如，在本发明中，将微滴生成油和PCR预混液加入到微滴生成卡上，生成油包裹水的微滴，再将微滴转入到96孔板中，用热封仪进行封膜。
3、分析检测
将扩增后的微滴放入QX200微滴分析仪中，用软件(例如QuantaSoft软件)进行检测分析。
待测样本检测结果的判定方法为：
(1)阳性：样本检测结果≥1个拷贝；
(2)阴性：样本检测结果＜1个拷贝。
综上，本发明中用于绝对定量检测非洲猪瘟病毒的ddPCR方法，采用SEQ ID NO.3所示的正向引物和SEQ ID NO.4所示的反向引物，并基于染料法数字PCR技术对ASFV进行绝对定量检测，其检测灵敏度高于普通PCR技术和实时荧光定量PCR技术。并且，ddPCR方法不需要标准曲线，可以直接定量检测并确定待测样本中的ASFV病毒拷贝数，相较现有方法简化了操作步骤，并且特异性好、灵敏度高。在临床上可以更加快速、准确地检测ASFV感染，准确定量ASFV，有利于进一步合理制定对非洲猪瘟病毒的防控治疗措施。
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例中所用仪器、材料和试剂如下：
(1)主要仪器
CFX96荧光定量PCR仪、C1000梯度PCR扩增仪、QX200微滴式数字PCR仪、DG8cartridge、微滴生成仪、PX1热封仪均为Bio-Rad公司；NanoDrop 2000超微量分光光度计为ThermoFisher Scientfic公司；高速冷冻离心机、常温离心机为Ependorf公司。
(2)材料和试剂
反转录试剂盒、TB Green FAST qPCR Mix试剂盒均购于大连TaKaRa公司。TIANampGenomic DNA Kit购于TIANGEN公司。EvaGreen ddPCR Supermix、Droplet generation oilfor EvaGreen购于Bio-Rad公司。
实施例1
本实施例中用于检测非洲猪瘟病毒的引物，所述引物根据非洲猪瘟病毒的K205R基因序列设计合成。所述引物的设计遵循本领域的通用准则，采用常规的引物设计软件完成。
具体的，本实施例中用于检测非洲猪瘟病毒的引物根据SEQ ID NO.1所示的特异序列或其同源序列设计合成。
在本发明的其他实施例中，用于检测非洲猪瘟病毒的引物根据SEQ ID NO.2所示的特异序列设计合成。
实施例2
本实施例中用于绝对定量检测非洲猪瘟病毒的引物，序列如下所示：
正向引物：5’-GAGCCATTATCGCCCAACT-3’(SEQ ID NO.3所示)；
反向引物：5’-CGGGAGGACTCGTTTGTT-3’(SEQ ID NO.4所示)。
本实施例的引物针对非洲猪瘟病毒的K205R基因设计合成，适用于在ddPCR平台上定量检测非洲猪瘟病毒，具有特异性好、灵敏度高的特点。
实施例3
本实施例中用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括：实施例1或实施例2中的一对或多对引物；还包括：一种或多种能够促进聚合酶链式反应的试剂，例如，反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶，ddH2O等。
实施例4
本实施例中用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括：引物和试剂；所述引物用于绝对定量检测非洲猪瘟病毒，引物序列如下所示：
正向引物：5’-GAGCCATTATCGCCCAACT-3’(SEQ ID NO.3所示)；
反向引物：5’-CGGGAGGACTCGTTTGTT-3’(SEQ ID NO.4所示)；
所述试剂包括：ddPCR Supermix(含ddPCR反应缓冲液、dNTPs、Taq酶、荧光染料)、ddH2O、非洲猪瘟病毒DNA阳性标准品(含非洲猪瘟病毒DNA的质粒，质粒上插入的片段序列如SEQ ID NO.5所示)和微滴生成油。
本实施例的试剂盒可以用于ddPCR平台对非洲猪瘟病毒进行绝对定量检测，也可以结合普通PCR技术对非洲猪瘟病毒进行定量检测，均具有特异性好、灵敏度高的特点。
实施例5
本实施例中用于检测非洲猪瘟病毒的引物(由实施例2提供)或试剂盒(由实施例4提供)在检测非洲猪瘟病毒方面的应用。
具体的，所述应用为：绝对定量检测非洲猪瘟病毒的方法，包括以下步骤：
1.1待测样本病毒DNA的提取
当待测样品为组织病料或细胞培养物时，将待测样本打碎为细胞悬液(细胞培养物不需要此过程)，10000rpm离心1min，倒尽上清，用DNA提取试剂盒提取病毒DNA。
当待测样本为血液或组织液等液体样本时，加入3倍样本体积的红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5min后，10000rpm离心1min，吸取上清，用DNA提取试剂盒提取病毒DNA。
1.2 ddPCR扩增
配制包含引物的PCR预混液，将PCR预混液形成微滴，并进行ddPCR反应。
1.2.1配制20μL的PCR预混液：2×EvaGreen ddPCR Supermix 10μL，正向引物(碱基序列如SEQ ID NO.3所示)和反向引物(碱基序列如SEQ ID NO.4所示)各250nM，待测样品的DNA模板2μL，补充灭菌水至20μL。
在本发明的其他实施例中，各引物的浓度也可以在240-260nM范围。
1.2.2将微滴生成油和PCR预混液加入到微滴生成卡上，生成油包裹水的微滴，再将微滴转入到96孔板中，用热封仪进行封膜。
1.2.3完成ddPCR扩增，ddPCR反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火延伸1分钟，共40个循环；98℃反应10分钟后结束反应。
在本发明的其他实施例中，退火温度也可以为54-60℃。
1.3分析检测
将扩增后的微滴放入微滴分析仪中，进行检测分析。
利用QuantaSoft软件进行数据分析，计算样本中的DNA拷贝数。
待测样本检测结果的判定方法为：
(1)阳性：样本检测结果≥1个拷贝；
(2)阴性：样本检测结果＜1个拷贝。
实施例6
本实施例中用于绝对定量检测非洲猪瘟病毒的ddPCR方法，包括以下步骤：
1.1待测样本病毒DNA的提取
向血浆样本中加入3倍样本体积的红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5min后，10000rpm离心1min，吸取上清，用DNA提取试剂盒提取病毒DNA。
1.2 ddPCR扩增
配制包含引物的PCR预混液，将PCR预混液形成微滴，并进行ddPCR反应。
1.2.1配制20μL的PCR预混液：2×EvaGreen ddPCR Supermix 10μL，正向引物(碱基序列如SEQ ID NO.3所示)和反向引物(碱基序列如SEQ ID NO.4所示)各250nM，待测样品的DNA模板2μL，补充灭菌水至20μL。
1.2.2将微滴生成油和PCR预混液加入到微滴生成卡上，生成油包裹水的微滴，再将微滴转入到96孔板中，用热封仪进行封膜。
1.2.3完成ddPCR扩增，ddPCR反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火延伸1分钟，共40个循环；98℃反应10分钟后结束反应。
1.3分析检测
将扩增后的微滴放入微滴分析仪中，进行检测分析。
待测样本检测结果的判定方法为：
(1)阳性：样本检测结果≥1个拷贝；
(2)阴性：样本检测结果＜1个拷贝。
利用QuantaSoft软件进行数据分析，计算样本中的DNA拷贝数。结果表明，待测样本判定为阳性。
实施例7
本实施例中用于检测非洲猪瘟病毒的引物(由实施例2提供)或试剂盒(由实施例4提供)在疫苗生产质量控制方面的应用。
实验例
1、最佳退火温度的优化
在ddPCR平台上优化ASFV PCR反应的最佳退火温度，实验步骤如下：
(1)在ddPCR平台上配制如下体系的ddPCR预混液：2×EvaGreen ddPCR Supermix 10μL，正向引物(SEQ ID NO.3所示)和反向引物(SEQ ID NO.4所示)各500nM，阳性质粒(104/μL，质粒上插入的片段序列如SEQ ID NO.5所示)2μL，补充灭菌水至总体积20μL。
(2)将微滴生成油和PCR预混液加入到微滴生成卡上，生成油包裹水的微滴，再将微滴转入到96孔板中，用热封仪进行封膜。
(3)ddPCR反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，52-64℃(仪器自动生成的8个温度梯度，64℃、63.3℃、62℃、59.6℃、56.7℃、54.4℃、52.8℃、52℃)退火延伸1分钟，共40个循环；98℃反应10分钟后结束反应。
(4)将扩增后的微滴放入微滴分析仪中，进行检测分析。
根据每管中检测分析的PCR反应后的浓度和阳性微滴与阴性微滴荧光值之间的差异确定最佳的退火温度。结果如图1和图2所示。
图1和图2的结果显示，在各个退火温度(64℃、63.3℃、62℃、59.6℃、56.7℃、54.4℃、52.8℃、52℃)下均能产生大于10000的总微滴数，符合分析要求。在52℃到62℃之间，PCR反应后的浓度相差不大，但在59.6℃和56.7℃温度下，阳性微滴与阴性微滴之间的差异最大(如图1所示)，由此确定采用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物进行ddPCR反应的最佳退火温度为58℃。
2、最适引物浓度的优化
在ddPCR平台上优化ASFV PCR反应的最适引物浓度，实验步骤如下：
在ddPCR平台上配制如下反应混合液；2×EvaGreen ddPCR Supermix 10μL，正向引物(SEQ ID NO.3所示)和反向引物(SEQ ID NO.4所示)各(125nM、250nM、500nM、1000nM)，阳性质粒(104/μL，质粒上插入的片段序列如SEQ ID NO.5所示)2μL，补充灭菌水至总体积20μL。同一反应体系中，正反向引物浓度相同。
同时做相应的无模板空白对照(NTC)，检验阴性微滴基础荧光值及反应体系的污染情况。根据每管反应体系阳性微滴与阴性微滴之间的差异及无模板阴性微滴的基础荧光值确定最适引物浓度。结果如图3所示。
图3的结果显示，在四种引物浓度条件下阳性微滴数基本一致，而在引物浓度为250nM时，阳性微滴与阴性微滴之间的差异最大，且阴性微滴的基础荧光值较低。因此将最适引物浓度定为250nM，此时阴性微滴和阳性微滴荧光值差异最大，有利于提高检测结果的准确性。
3、特异性检测
为了验证实施例5提供的ddPCR方法在检测ASFV中的特异性，利用ASFV质粒作为阳性模板(同上)，其他几种猪场常见的病毒(PRRSV、CSFV、PCV2、PRV)的DNA或者反转录的cDNA作为模板进行检测，同时用ASFV阴性模板和无模板对照来检测ddPCR方法的特异性。结果如图4所示(图4中：ASFV+代表非洲猪瘟病毒阳性模板，ASFV-代表非洲猪瘟病毒阴性临床样本；PRRSV+为猪繁殖与呼吸综合征病毒，CSFV+为猪瘟病毒，PCV2+为猪圆环病毒Ⅱ型，PRV+为猪伪狂犬病毒；NTC为无模板对照)。
图4的结果显示，只有在ASFV阳性组(ASFV+)产生阳性微滴，在其他病毒阳性组(PRRSV+、CSFV+、PCV2+、PRV+)，ASFV阴性组(ASFV-)和无模板对照组(NTC)均无阳性微滴产生，表明本发明实施例5提供的ddPCR方法具有较好的特异性，可以对ASFV进行特异性检测。
4、灵敏度检测
利用qRT-PCR和ddPCR方法分析比较不同浓度的ASFV拷贝数。
为了验证实施例5提供的ddPCR方法在检测ASFV中的灵敏度，利用实时荧光定量PCR技术，采用标准曲线方法对不同拷贝数的ASFV进行相对定量。同时利用实施例5提供的ddPCR方法检测相同的ASFV模板，分别计算样本中ASFV拷贝数。结果如图5和表1所示。
表1 不同检测方法的结果比较
Figure BDA0002696184520000101
Figure BDA0002696184520000111
图5的结果显示，采用qRT-PCR方法在103-106copies/μL拷贝数范围内能够达到较高的扩增效率，并呈现出较好的线性(R2＝0.9982)，但是在拷贝数低于102copies/μL时，Ct值大于35(如表1)，检测结果的准确度降低。而实施例5提供的ddPCR方法在低拷贝数时仍能较好的检测出ASFV，且空白对照无阳性微滴出现(如表1所示)，说明实施例5提供的ddPCR方法具有较高的检测灵敏度，比实时荧光定量PCR方法高10倍。
对ASFV的qRT-PCR和ddPCR结果进行相关性分析，发现两者呈线性相关，如图6所示，qRT-PCR和ddPCR的相关系数为0.9929。
以上结果证明，本发明实施例5提供的用于绝对定量检测非洲猪瘟病毒的ddPCR方法和实施例2提供的用于绝对定量检测非洲猪瘟病毒的引物(包括SEQ ID NO.3所示的正向引物和SEQ ID NO.4所示的反向引物)的特异性好、灵敏度高，可以直接定量检测ASFV病毒，检测结果准确可靠。
综上所述，本发明实施例5提供的用于绝对定量检测非洲猪瘟病毒的ddPCR方法，其采用SEQ ID NO.3所示的正向引物和SEQ ID NO.4所示的反向引物，并基于染料法ddPCR技术对ASFV进行绝对定量检测，其检测的灵敏度高于普通PCR和实时荧光定量PCR技术(10倍)。并且，本发明提供的ddPCR方法可直接定量，不用设置标准曲线，根据检测结果可以直接确定待测样本中ASFV病毒的拷贝数，极大的简化了操作步骤，而且特异性好、灵敏度高。在临床上可以更加快速、准确地实现对ASFV感染的检测，同时还能对ASFV病毒含量进行绝对定量，有利于进一步合理制定对非洲猪瘟病毒的防控治疗措施。
以上所述仅为本发明优选的实施例，并不用于限制本发明的保护范围。对于本领域的技术人员说，本发明可以有各种更改和变化。凡是在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河南格悦检测技术有限公司
<120> 一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 618
<212> DNA
<213> ASFV
<400> 1
atggttgagc cacgcgaaca gttttttcaa gatctgcttt cagcagtgga tcaacaaatg 60
gacactgtaa aaaatgacat aaaagacatt atgaaagaaa aaacgtcttt tatggtatca 120
ttcgaaaact ttatagaacg ttacgatacc atggaaaaaa atattcaaga ccttcagaat 180
aagtacgaag aaatggcggc caaccttatg accgtcatga cggatacaaa aattcagctt 240
ggagccatta tcgcccaact tgagattcta atgataaatg gcactccact tccggcaaaa 300
aagacaacaa ttaaggaggc tatgccctta ccttcatcaa acacgaataa tgaacaaacg 360
agtcctcccg cctcaggcaa aacaagtgaa acacctaaaa aaaatcccac gaatgcgatg 420
ttcttcacgc gtagcgaatg ggcatcctcg aatacttttc gagaaaagtt tttaacacca 480
gaaattcaag ccatattgga tgagcagttt gcaaacaaga ccgggatcga aagattgcat 540
gccgagggtc tttacatgtg gagaacccaa ttctctgacg aacagaagaa aatggtcaaa 600
gagatgatga agaagtaa 618
<210> 2
<211> 129
<212> DNA
<213> ASFV
<400> 2
gagccattat cgcccaactt gagattctaa tgataaatgg cactccactt ccggcaaaaa 60
agacaacaat taaggaggct atgcccttac cttcatcaaa cacgaataat gaacaaacga 120
gtcctcccg 129
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(正向引物)
<400> 3
gagccattat cgcccaact 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(反向引物)
<400> 4
cgggaggact cgtttgtt 18
<210> 5
<211> 300
<212> DNA
<213> ASFV
<400> 5
tacaaaaatt cagcttggag ccattatcgc ccaacttgag attctaatga taaatggcac 60
tccacttccg gcaaaaaaga caacaattaa ggaggctatg cccttacctt catcaaacac 120
gaataatgaa caaacgagtc ctcccgcctc aggcaaaaca agtgaaacac ctaaaaaaaa 180
tcccacgaat gcgatgttct tcacgcgtag cgaatgggca tcctcgaata cttttcgaga 240
aaagttttta acaccagaaa ttcaagccat attggatgag cagtttgcaa acaagaccgg 300

Claims (10)

1.一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物，其特征在于：所述引物根据非洲猪瘟病毒的K205R基因序列设计合成。
2.根据权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒的引物，其特征在于：所述引物根据SEQ ID NO. 1所示的特异序列或其同源序列设计合成。
3.根据权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒的引物，其特征在于：所述引物根据SEQ ID NO. 2所示的特异序列设计合成。
4.根据权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒的引物，其特征在于：所述引物的序列如下所示：
正向引物：5’-GAGCCATTATCGCCCAACT-3’；
反向引物：5’-CGGGAGGACTCGTTTGTT-3’。
5.一种包含如权利要求1-4中任一项所述的用于检测非洲猪瘟病毒的引物的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括：一种或多种促进聚合酶链式反应的试剂。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中的试剂包括：ddPCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、荧光染料、ddH2O、非洲猪瘟病毒DNA阳性标准品、微滴生成油中的一种或多种。
8.一种如权利要求1-4中任一项所述的用于检测非洲猪瘟病毒的引物、或者如权利要求5-7中任一项所述的试剂盒在检测非洲猪瘟病毒方面的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述引物或试剂盒用于绝对定量检测非洲猪瘟病毒，其中ddPCR方法包括：将包含引物的PCR预混液形成微滴，并进行ddPCR反应，然后进行分析检测，即可。
10.一种如权利要求1-4中任一项所述的用于检测非洲猪瘟病毒的引物、或者如权利要求5-7中任一项所述的试剂盒在疫苗生产质量控制方面的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113502352A (zh) * 2021-07-01 2021-10-15 华中农业大学 检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160094674A (ko) * 2015-02-02 2016-08-10 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 k205r에 대한 단클론항체 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물
CN110269932A (zh) * 2019-06-24 2019-09-24 北京生科基因科技有限公司 非洲猪瘟病毒疫苗及其用途
CN110453010A (zh) * 2019-07-08 2019-11-15 许昌学院 一种用于检测非洲猪瘟病毒asfv的lamp引物组、试剂和试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160094674A (ko) * 2015-02-02 2016-08-10 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) 아프리카 돼지열병 바이러스 단백질 k205r에 대한 단클론항체 및 이를 포함하는 아프리카 돼지열병 바이러스 진단용 조성물
CN110269932A (zh) * 2019-06-24 2019-09-24 北京生科基因科技有限公司 非洲猪瘟病毒疫苗及其用途
CN110453010A (zh) * 2019-07-08 2019-11-15 许昌学院 一种用于检测非洲猪瘟病毒asfv的lamp引物组、试剂和试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VLAD PETROVAN: "Antigenic characterization of African swine fever virus (ASFV) p30 and p54 proteins", 《DOCTOR OF PHILOSOPHY DEPARTMENT OF DIAGNOSTIC MEDICINE AND PATHOBIOLOGY COLLEGE OF VETERINARY MEDICINE KANSAS STATE UNIVERSITY MANHATTAN, KANSAS》, pages 35 - 36 *
严礼等: "非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立与应用", 《激光生物学报》, vol. 29, no. 4, pages 345 *
邬旭龙等: "非洲猪瘟病毒微滴数字PCR(ddPCR)方法的建立及应用", 《微生物学通报》, vol. 44, no. 12, pages 1 *
郭少平;刘建;吴绍强;: "非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测技术的研究与评价", 中国畜牧兽医, no. 04, pages 1 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113502352A (zh) * 2021-07-01 2021-10-15 华中农业大学 检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用
CN113502352B (zh) * 2021-07-01 2022-02-01 华中农业大学 检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用

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