CN111334610B - 一种登革病毒通用型rt-raa-lfd扩增引物及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种登革病毒通用型RT‑RAA‑LFD扩增引物及检测方法。本发明针对1～4型登革病毒的3'端非翻译区共同保守区域，设计了一对使用于RAA技术的特异性引物，正、反向引物的5'端分别用6‑羧基荧光素和生物素进行标记，这使得阳性的双链扩增产物的两端分别被标记上FAM和生物素。再利用包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸，通过免疫层析法对扩增结果进行肉眼可视的判读，摆脱了对荧光定量仪器的依赖，最低检测浓度为10个拷贝/μL，与黄病毒科的其他病毒无交叉反应。将该扩增引物和方法用于临床样本，可成功检测出登革病毒RNA，与荧光定量PCR检测结果的一致性达到96％。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物及检测方法。
背景技术
登革热是当今全球范围内传播速度最快的虫媒传染病，它由1~4型登革病毒（Dengue virus, DENV）经伊蚊叮咬传播引起。在广东省地处亚热带，气候适宜蚊虫孳生，人口密度大，是我国登革热发病和传播的高发地区。疾病不仅给患者造成生理上的疼痛和心理上的压力，同时也给政府和个人带来了较高的经济负担。
目前临床使用的荧光定量PCR方法灵敏度高，但必须依赖精密控制温度的仪器，同时对实验环境、操作者的专业知识和技能都有较高的要求，在基层医院和社区门诊等处难以开展，使患者错过早发现早治疗的最佳时期，也不利于及时切断和隔离传染源。
重组酶辅助扩增（RAA）是一种利用UvsX、UvsY、SSB和聚合酶四种酶的新等温核酸扩增技术。寡核苷酸引物与UvsY，UvsX酶形成复合体，识别双链DNA中的同源序列，使双链DNA解链成单链。然后SSB与游离的单链结合，DNA聚合酶与UvsY，UvsX酶引物复合体结合后启动核酸扩增。RAA反应在35-45℃的条件下即可进行快速且特异的扩增。到目前为止，RAA可检测不同种类的细菌和病毒，已广泛应用于传染病诊断和食品污染测试。本发明旨在设计一种登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物及相应的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于设计一种登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物及相应的检测方法。
本发明通过RT-RAA核酸扩增技术实现核酸分子在常温下的快速扩增，利用FAM-抗FAM特异性抗体、链霉亲和素-生物素系统对扩增片段标记和特异识别，应用免疫层析法LFD对扩增产物进行可视化检测，建立一种易操作、耗时短的DENV核酸POCT (point-of-caretesting)检测技术，及时监测新发感染和预警重症病例，使传染源及早被切断，患者得到及时的治疗，最终降低感染的传播率与疾病死亡率。
本发明通过以下技术方案来实现：
一组基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的登革病毒通用型扩增引物，为如下所示：
RAA-F：5'-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTG-3'；
RAA-R：5'-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'。
所述的正、反向引物的5'端分别用6-羧基荧光素（FAM）和生物素进行标记。即引物对为如下：
RAA-F：5'- FAM-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTG-3'；
RAA-R：5'- biotin-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'。
一种基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的登革病毒检测试剂盒，其包含上述的登革病毒通用型扩增引物对RAA-F/ RAA-R和包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸(Lateral flow dipstick, LFD)。
优选，所述的登革病毒检测试剂盒，还含有RAA反应缓冲液、去核酸酶水、冻干酶粉、醋酸镁。
一种基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的登革病毒检测方法，包括以下步骤：
（1）以上述的引物对RAA-F/RAA-R作为扩增的上下游引物，将25 μL RAA反应缓冲液、1.25 μM RAA-F和1.25 μM RAA-R各2 μL、1 μL模板、17.5 μL去核酸酶水，加至含有冻干酶粉的200 μL EP管中，最后加入2.5 μL 280mM醋酸镁，在37℃恒温条件下反应20分钟，获得扩增产物；
（2）取5 μL扩增产物加入100 μL的样品缓冲液中，充分混匀后取60 μL加至包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸条加样区，3分钟即可读取结果，质控线与检测线同时呈红色为阳性结果，只有质控线呈红色为阴性结果，质控线不显色提示实验失败。
本发明上述的登革病毒通用型扩增引物RAA-F/RAA-R或包含该扩增引物RAA-F/RAA-R的登革病毒检测试剂盒可用于制备检测登革病毒的相关产品，用于测定登革病毒。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
（1）本发明公开了一组基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的通用型DENV核酸扩增引物和扩增方法，在不需要特殊仪器的情况下，30分钟内即可实现DENV核酸的POCT
(point-of-care testing)扩增与检测。本发明根据NCBI数据库中登革病毒全基因组的多重比对结果，选择高度保守的3'端非翻译区作为检测靶区，设计了特异性扩增引物。正、反向引物的5'端分别用6-羧基荧光素（FAM）和生物素进行标记，这使得阳性的双链扩增产物的两端分别被标记上FAM和生物素。再利用包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸（Lateral flow dipstick, LFD），通过免疫层析法对扩增结果进行肉眼可视的判读，摆脱了对荧光定量仪器的依赖。该方法可检测的最低浓度为10 copies/μL，对乙脑病毒、寨卡病毒、基孔肯雅热病毒均无非特异性扩增。将该扩增方法应用于临床样本，在37℃恒温条件下扩增20分钟即可成功检测出血清中的登革病毒RNA，与荧光定量PCR检测结果的一致性达到96%。
（2）与现有的荧光定量PCR，及其他使用到荧光探针的检测方法比较，本方法易操作、耗时短，不需要装备精良的实验室和精密仪器，特别是不需要荧光检测仪的特殊仪器，可在基层医院、社区、甚至家庭进行第一时间筛查，助于疫情的监测和早期发现，以避免患者错过治疗的最佳期，最终降低感染的传播率与疾病死亡率，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物的反应温度的优化。
图2为登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物的反应时间的优化。
图3为适用于登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增的引物浓度优化
图4为适用于登革病毒通用型RT-RAA-LFD侧向流检测的反应时间优化。
图5为适用于登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增用引物的灵敏度分析。
图6为适用于登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增用引物的特异度分析。
实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中的RAA反应缓冲液、去核酸酶水、含有冻干酶粉的EP管、醋酸镁均取自RAA检测试剂盒，该试剂盒购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号B00000。
实施例1 ：登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增策略及引物设计
登革病毒是单正链RNA病毒，全基因组大小约11kb，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其5'端为I型帽子结构，3'端缺乏poly(A)尾，基因组的5'端和3'端均有一段非编码区。RAA技术要求上下游引物长度大于30bp。在以上限制条件下，用primer premier 5.0软件设计相应引物，具体引物信息见表1。
表1：登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物信息
将上述的登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物的正、反向引物的5'端分别用6-羧基荧光素（FAM）和生物素进行标记，使得阳性的双链扩增产物的两端分别被标记上FAM和生物素，具体为：
RAA-F：5'- FAM-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTG-3'；
RAA-R：5'- biotin-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'。
首先体外合成登革热病毒的检测靶序列，如SEQ ID NO.3所示，并利用分子克隆技术将其插入pCDNA3.1载体中构建带有靶序列的重组质粒。
采用50 μL反应体系：以RAA-F：5'- FAM-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGAC
TAGTG-3'和RAA-R：5'- biotin-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'作为扩增的上下游引物，将25 μL RAA反应缓冲液、1.25 μM RAA-F和1.25 μM RAA-R各2 μL、1 μL 重组质粒作为模板、17.5 μL去核酸酶水，加至含有冻干酶粉的200 μL EP管中，最后加入2.5 μL 280 mM醋酸镁，得到50 μL反应体系。
准备7份50 μL反应体系，分别置于20℃，25℃，30℃，37℃，39℃，45℃和48℃的恒定温度中反应40分钟。取10 μL扩增产物，2%的琼脂糖凝胶进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果，目的片段大小为178 bp，序列如SEQ ID NO.3所示。每个反应温度重复3次试验。电泳结果如图1，结果表明最佳的扩增温度范围为37℃。
在最佳扩增温度确定后，再准备7份50 μL反应体系，分别在37℃条件下扩增0、5、10、15、20、25、30分钟，取扩增产物10 μL，2%的琼脂糖凝胶进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果，目的片段大小为178 bp。每个反应时间重复3次试验。电泳结果如图2，结果表明最佳反应时间为20分钟。
采用50 μL反应体系：以RAA-F：5'- FAM-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGAC
TAGTG-3'和RAA-R：5'- biotin-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'作为扩增的上下游引物，将25 μL RAA反应缓冲液、RAA-F和RAA-R各2 μL、1 μL重组质粒作为模板、17.5 μL去核酸酶水，加至含有冻干酶粉的200 μL EP管中，最后加入2.5 μL 280mM醋酸镁，得到50 μL反应体系。引物的浓度梯度设置为10 μM，5μM，2.5μM，1.25 μM和0.625 μM。在37℃恒温条件下反应20分钟。取5μL扩增产物加入至100 μL的样本缓冲液中，充分混匀后取60 μL加至包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸条加样区进行检测，每个引物浓度重复3次试验。结果如图3，表明最佳引物浓度为1.25 μM。
采用50 μL反应体系：以RAA-F：5'- FAM-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGAC
TAGTG-3'和RAA-R：5'- biotin-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'作为扩增的上下游引物，将25 μL RAA反应缓冲液、1.25μM RAA-F和1.25μM RAA-R各2 μL、1 μL重组质粒作为模板、17.5 μL去核酸酶水，加至含有冻干酶粉的200 μL EP管中，最后加入2.5 μL 280mM醋酸镁，得到50 μL反应体系。
准备10份50 μL反应体系，在37℃恒温条件下反应20分钟。取5 μL扩增产物加入至100 μL的样本缓冲液中，充分混匀后取60 μL加至包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸条加样区进行检测，从加样后0分钟开始，每隔30 s记录试纸条的层析情况。如此重复3次试验。结果如图4，表明最佳检测反应时间为3分钟。
将带有扩增目的片段的重组质粒（质粒的构建参见实施例2）稀释成100 到 106 copies/μL 7个梯度，分别用上述优化好的扩增和检测方案进行反应，具体为：以RAA-F：5'-FAM-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTG-3'和RAA-R：5'- biotin-GATCT
CTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'作为扩增的上下游引物，将25 μL RAA反应缓冲液、1.25μM RAA-F和1.25μM RAA-R各2 μL、1 μL重组质粒作为模板、17.5 μL去核酸酶水，加至含有冻干酶粉的200 μL EP管中，最后加入2.5 μL 280mM醋酸镁，得到50 μL反应体系。在37℃恒温条件下反应20分钟。取5 μL扩增产物加入至100 μL的样本缓冲液中，充分混匀后取60 μL加至包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸条加样区进行检测，3分钟后读取结果。如此重复3次试验。结果如图5，表明本方法的检测灵敏度为10copies/μL。
准备黄热病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒、诺如病毒、轮状病毒核酸，以登革病毒核酸做阳性对照，以去RNA酶水做阴性对照，分别用上述优化好的扩增和检测方案进行反应。具体为：以RAA-F：5'- FAM-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTG-3'和RAA-R：5'- biotin-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'作为扩增的上下游引物，将25 μL RAA反应缓冲液、1.25μM RAA-F和1.25μM RAA-R各2 μL、1 μL病毒核酸、17.5 μL去核酸酶水，加至含有冻干酶粉的200 μL EP管中，最后加入2.5 μL 280mM醋酸镁，得到50 μL反应体系。在37℃恒温条件下反应20分钟。取5 μL扩增产物加入至100 μL的样本缓冲液中，充分混匀后取60 μL加至包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸条加样区进行检测，3分钟后读取结果。如此重复3次试验。结果如图6，表明本方法的对登革病毒以外的病毒核酸无扩增。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省妇幼保健院
<120> 一种登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物及检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaagctgta cgcatggggt agcagactag tg 32
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatctctggt ctctcccagc gtcaatatgc tgtt 34
<210> 3
<211> 178
<212> DNA
<213> 登革病毒(Dengue virus)
<400> 3
ggaagctgta cgcatggggt agcagactag tggttagagg agacccctcc caagacacaa 60
cgcagcagcg gggcccaaca ccaggggaag ctgtaccctg gtggtaagga ctagaggtta 120
gaggagaccc cccgcacaac aacaaacagc atattgacgc tgggagagac cagagatc 178
Claims (3)
1.一种基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的登革病毒检测试剂盒，其特征在于，包含基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的登革病毒通用型扩增引物和包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸；
所述的通用型扩增引物如下所示：
RAA-F：5'-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTG-3'；
RAA-R：5'-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'；
所述的RAA-F、RAA-R的5'端分别用6-羧基荧光素和生物素进行标记；
所述试剂盒中RAA-F、RAA-R引物的工作浓度均为1.25μM，扩增温度为37℃，反应时间为20分钟。
2.根据权利要求1所述的登革病毒检测试剂盒，其特征在于，还含有RAA反应缓冲液、去核酸酶水、冻干酶粉、醋酸镁。
3.一种非疾病诊断和治疗目的的基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的登革病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以权利要求1所述的引物对RAA-F/RAA-R作为扩增的上下游引物，将25μL RAA反应缓冲液、1.25μM RAA-F和1.25μM RAA-R各2μL、1μL模板、17.5μL去核酸酶水，加至含有冻干酶粉的200μL EP管中，最后加入2.5μL 280mM醋酸镁，在37℃恒温条件下反应20分钟，获得扩增产物；
(2)取5μL扩增产物加入100μL的样品缓冲液中，充分混匀后取60μL加至包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸条加样区，3分钟读取结果，质控线与检测线同时呈红色为阳性结果，只有质控线呈红色为阴性结果，质控线不显色提示实验失败。
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