CN113430302A

CN113430302A - 番茄花叶病毒的rt-raa-lfs快速可视化检测引物、探针和试剂盒及应用

Info

Publication number: CN113430302A
Application number: CN202110726324.3A
Authority: CN
Inventors: 郑红英; 来宇超; 宋雪梅; 曹宇浩; 彭杰军; 鲁宇文; 陈剑平; 燕飞
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2021-09-24

Abstract

本发明公开了番茄花叶病毒的RT‑RAA‑LFS快速可视化检测引物、探针和试剂盒及应用，特点是包括根据番茄花叶病毒的运动蛋白和外壳蛋白区段设计特异性引物及荧光探针，引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，其试剂盒包括反应体系如下：29.4μL A缓冲液，2.1μL 10μM的上游引物，3μL10μM的下游引物，0.6μL10μM的探针，1μL RNA植物汁液粗提液模板，11.4μL ddH₂O，2.5μL B缓冲液，总体积为50μL，优点是灵敏度高、特异性强以及检测快速准确。

Description

番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测引物、探针和试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及一种番茄花叶病毒的检测，尤其是涉及一种番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测引物、探针和试剂盒及应用。

背景技术

番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）是Virgaviridae科Tobamovirus属的正链RNA病毒。由于该病毒核酸序列与烟草花叶病毒（TMV）高度同源，因此很长一段时间以来，研究人员都将ToMV作为TMV的一个分支来报道。直到1971年，ToMV才与TMV区别开来，并被分离为独立的病毒种类。ToMV可以感染茄科、十字花科、禾本科、藜科和豆科等植物，其中辣椒是ToMV的天然宿主之一。受ToMV侵染辣椒通常会产生局部病变，引起植物的系统性坏死，进而严重影响辣椒的质量和产量。此外近年来，ToMV还引起了木槿、香瓜茄、苣荬菜、大果茄和龙葵引起的病毒病害的报道。

常用的番茄花叶病毒的检测方法主要有生物学检测法，主要通过指示植物作为鉴别寄主进行检测，然而该方法不仅工作量大，需要较大的温室种植寄主植物，且比较费时，有时因气候或栽培等原因，症状反应不十分稳定，个别症状反应难以重复，因此准确率也不高。酶联免疫吸附测定（ELISA）也用于检测ToMV，该方法主要通过研制ToMV的病毒蛋白抗体进行检测。但ELISA方法对实验室设备依赖性较强，灵敏度较低。此外，TMV与ToMV之间具有较高的同源性，研究表明，当样品中两者的浓度大于等于10-25ng/mL时，ELISA分析则会引起交叉反应，无法清楚地区分TMV和ToMV。RT-PCR法作为植物病毒的传统检测方法，在ToMV的检测方面也已有了较为普遍的应用。通过设计ToMV基因序列的特异性引物，建立ToMV的PCR检测技术，其检测灵敏度高，但缺点是依赖PCR法的检测依然离不开实验室的变温仪器，且扩增产物需要凝胶检测分析结果，从采集病叶至检测完成，整个过程仍需至少1天的时间，不利于实现田间快速检测。也有利用多重免疫捕获RT-PCR法等方法检测ToMV，此方法需要浓缩并预纯化病毒颗粒，然后对捕获的病毒粒子进行RT-PCR检测，无需核酸提取。与ELISA比较，该方法将检测灵敏度提高了4个数量级，但该法同时也具有RT-PCR的缺点。德国Loewe Biochemica公司研制的针对ToMV快速检测的胶体金抗体试剂盒（Tomato MosaicTobamovirus LOEWE^®FAST Kit），通过研制胶体金颗粒结合抗ToMV的抗体复合物，以该复合物直接结合病汁液中游离的ToMV病毒颗粒，从而在检测线上呈现肉眼可见的阳性条带。试剂盒的优点在于：操作简单，无需较强的专业背景，无需依赖实验室设备，检测迅速；缺点在于制备ToMV相应胶体金抗体复合物的试纸条需耗费较高的成本，无法形成规模的田间样品检测，其次该方法的灵敏度也有待验证。此外，还有基于血清学的原理建立的流式细胞仪法，采用检测荧光的方式读取结果。制备ToMV的一抗以及标记FITC的二抗，将一抗通过共价键的形式与乳胶颗粒结合，取植物病叶提取物在低温下与乳胶颗粒温育过夜，PBS洗涤后，与二抗孵育，再次洗涤，用流式细胞仪进行荧光检测。单独的ToMV流式细胞仪检测，其灵敏度达4pg/mL。但该方法缺点是对实验室设备的依赖性较强，需要一定的专业背景，且该检测法的前期准备工作繁重，成本较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强以及检测快速准确的番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测引物、探针和试剂盒及应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测引物、探针，包括根据番茄花叶病毒的运动蛋白和外壳蛋白区段设计特异性引物及荧光探针，引物序列具体如下：上游引物ToMV-RAA-F5：AGTGCGGGCTACTGCCCTTTGTCATTAGAA；下游引物ToMV-RAA-R5：Biotin-TATTTTTCGGACCTCTTTTTGAGGATTTGGT；探针ToMV-probe-5：FAM-TAATATAAAATTGGGTTTGAGGGAGAAAGTA(THF)CGAGTGTGAACGATGGA-C3-pacer。

2、一种番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测试剂盒，该试剂盒包括反应体系如下：29.4 μL A 缓冲液，2.1 μL 10 μM的上游引物，3 μL10 μM的下游引物，0.6 μL10 μM的探针，1 μL RNA模板，11.4 μL ddH₂O，2.5 μL B 缓冲液，总体积为50 μL，其中引物序列具体如下：上游引物ToMV-RAA-F5：AGTGCGGGCTACTGCCCTTTGTCATTAGAA；下游引物ToMV-RAA-R5：Biotin-TATTTTTCGGACCTCTTTTTGAGGATTTGGT；探针ToMV-probe-5：FAM-TAATATAAAATTGGGTTTGAGGGAGAAAGTA(THF)CGAGTGTGAACGATGGA-C3-pacer。

3、上述番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测引物、探针的应用，其用于检测番茄花叶病毒包括以下步骤：

（1）配制混合液：将29.4 μL A缓冲液，2.1 μL 10 μM的上游引物，3 μL10 μM的下游引物，0.6 μL10 μM的探针，1 μL RNA模板，11.4 μL ddH₂O，2.5 μL B缓冲液加入离心管混合后瞬时离心，用移液器将混合液全部转移至RNA恒温快速扩增试剂盒的MIRA反应单元，枪头轻轻吹打，待管内干粉充分溶解后，瞬时离心；

（2）立即将反应管放入恒温金属浴中，39 ℃孵育30 min；

（3）反应结束后，从每个反应管中取出5 μL反应液转至新的离心管中，用ddH₂O稀释至50 μL，吹打混匀；

（4）将侧流层析试纸条结合垫部分浸入液面，待液体向上层析过质控线，取出试纸条平置，5 min内读取检测结果并拍照记录。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测引物、探针和试剂盒及应用，其建立的ToMV检测体系具有灵敏度高，特异性好，反应迅速，普适性强等优点。此外，该检测体系不过于依赖实验室仪器设备，仅需一台小型恒温仪即可实现田间ToMV感染病毒植株的快速可视化检测。经各项指标评估，该体系可快速、准确、灵敏地检测田间辣椒、番茄的粗提液样本，且操作简单，设备要求低，具有一定的应用前景。

附图说明

图1为根据ToMV基因组序列设计的8对引物RAA扩增的凝胶电泳图；

图2为根据ToMV基因组序列设计的8对引物RAA扩增产物的灰度值柱状图；

图3为以pEASY-ToMV-MP&CP重组质粒检测引物探针组合3、4、5、6的结果示意图，每组试纸条质粒浓度从左到右依次为10²，10¹，10⁰ copy/μL，H₂O；

图4为引物探针组合5设计区段示意图，参与比对的病毒序列在NCBI上的登录号（从上至下）：NC_001367，AF395129，AF395128，AF395127，MK087763，MG516107，KR537870，AF155507，NC_002692，KX711903，X02144，AF332868；

图5为 pEASY-ToMV-MP&CP重组质粒灵敏度测试（初始浓度：8.8×10⁶ copy/μL），（a）PCR法；（b）ddH₂O稀释模板，RAA-LFS法；（c）粗提液稀释模板，RAA-LFS法；

图6为 ToMV侵染的感病样品总RNA灵敏度测试（初始浓度：1,000 ng/μL），（a）RT-PCR法；（b）RT-RAA-LFS法；

图7为ToMV-MP&CP-T7-RNA灵敏度测试（初始浓度：5.6×10⁶ copy），（a）RT-PCR法；（b）RT-RAA-LFS法；

图8为ToMV-RT-RAA-LFS检测体系特异性测试；

图9为ToMV-RT-RAA-LFS检测体系反应时间测试；

图10为田间番茄疑似ToMV感染样品检出率比对分析，（a）RT-PCR法；（b）RT-RAA-LFS法；

图11为田间辣椒疑似ToMV感染样品检出率比对分析，（a）RT-PCR法；（b）RT-RAA-LFS法。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

1、材料

供试植株：辣椒（杭椒1号抗性品种），石盾197大番茄种子种植于实验室恒温温室，培养条件为16 h光照，8 h黑暗，22 ℃恒温；辣椒田间疑似病毒病样16株采自云南、宁夏和浙江省；番茄田间疑似病毒病样8株采自山东和浙江省；PMMoV、TSWV侵染的辣椒植株病样为本实验室保存。以上植物样品均在液氮中冷冻并于-70 ℃保存。

供试菌株及载体：携带ToMV侵染性克隆（Pokl4 2-ToMV）农杆菌菌株为实验室保存。

试剂耗材：RNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）购自潍坊安普未来生物公司；T7体外转录试剂盒购自美国Promega公司；Pst I限制性内切酶购自日本Takara公司；酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、异丙醇、氯仿等其他生化试剂均为上海生工产品。

2、pEASY-ToMV-MP&CP质粒构建方法

（1）本氏烟ToMV病叶的采集

用挑菌棒蘸取保存于保菌管中的携带Pokl4 2-ToMV侵染性克隆的农杆菌菌株（农杆菌遗传转化），在含卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（50 μg/mL）的LB固体培养基上划线，于28 ℃恒温培养箱中放置48 h进行活化；挑取活化的农杆菌蘸至含卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（50 μg/mL）的液体培养基，28 ℃摇床200 rpm，10 h；用2 mL的EP管，4,500 rpm离心3 min，收集菌液，ddH₂O洗涤两遍后，用本氏烟瞬时转染液稀释菌液浓度至OD=0.01，室温静置3 h；用1 mL注射器将OD=0.01的Pokl4 2-ToMV侵染性克隆注射于6叶期的本氏烟植株叶片上；注射7 d后可看到本氏烟系统叶呈明显的花叶、卷曲症状，取病叶样液氮冷冻，-70 ℃保存。

（2）供试植物总RNA的提取及cDNA的制备

用植物RNA快速提取试剂盒对ToMV侵染的本氏烟叶片，辣椒疑似病毒病样16株，番茄疑似病毒病样8株，TSWV、PMMoV侵染的辣椒叶片以及相应健康对照（杭椒1号抗性辣椒和石盾197大番茄）进行总RNA的提取；参照TOYOBO公司的反转录试剂说明书对以上RNA样品反转录合成cDNA；

（3）pEASY-ToMV-MP&CP重组质粒的构建

根据Pokl4 2-ToMV侵染性克隆序列，设计MP&CP区段的上下游特异性引物，将ToMV侵染的本氏烟叶片cDNA进行PCR扩增，引物信息如表1所示：

表1 ToMV-MP&CP克隆引物

扩增体系如下：25 μL 2× Taq MasterMix、1 μL cDNA模板、2 μL上游引物（10 μM）和2 μL下游引物（10 μM），用ddH₂O补充体积至50 μL。依次加入上述试剂，充分混匀，短暂离心后上PCR仪，扩增程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，72 ℃10min，循环34次；4 ℃保存。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，连接载体pEASY-T5 Zero，热激转化，经阳性克隆的菌液PCR鉴定后，送于公司测序。测序比对分析正确的菌液进行扩繁，抽提质粒，pEASY-ToMV-MP&CP质粒测量浓度后保存于-40 ℃冰箱。

具体实施例二

1、ToMV-RAA引物组合的初筛

取ToMV与TMV同属Tobamovirus属，两者基因组序列高度同源（经比对同源性约为89.6 %），且ToMV病毒分离株之间也高度保守。因此，从美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库下载ToMV和TMV的病毒分离株基因组序列各6条，利用DNAMAN 8.0进行多序列比对。通过比对，在ToMV基因组序列与TMV相对低同源的运动蛋白（MP）和外壳蛋白（CP）区段设计了8对引物进行RAA-AGE初筛，设计原则如下：

（1）为提高RAA反应的灵敏性，上下游引物长度应在30~35 bp之间；

（2）下游引物二级结构，原则上要求无严重的茎环和发卡结构，上下游引物之间无长连续的碱基配对；

（3）设计时为保证检测引物的专一性，应尽可能区分ToMV与TMV序列，以免出现交叉反应。

将设计完成的8组检测引物送于有康生物公司合成，引物序列如表2所示：

表2 ToMV-（RT）RAA检测引物

引物干粉管室温4,500 rpm离心2 min使粉末沉于管底，小心开盖加入相应体积ddH₂O使引物终浓度为10 μM，4 ℃保存备用。

参考安普DNA恒温快速扩增试剂盒（基础型）说明书，以ToMV侵染的本氏烟病叶cDNA为模板，分别进行8组引物的RAA扩增，每组引物进行3次独立的重复。

表3 RAA扩增体系如下

RAA扩增体系各组分加入混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应单元放入恒温金属浴中，37 ℃孵育20~30 min；反应结束后，将反应管取出，每个反应管中加入50 μL酚/氯仿（25：24），充分振荡混匀，室温12,000 rpm离心1 min；吸取6 μL上层清液，混合约1 μL 6×Loading Buffer于1.5%（W/V）的琼脂糖凝胶中电泳（200 V，200mA）约12 min。对凝胶成像获取的琼脂糖凝胶检测结果进行预期条带灰度值测定，评估是否有杂带等不利因素，筛选出较优的扩增产物所对应的引物（4号引物）进行后续的体系研究。

根据扩增产物的电泳结果如图1和图2（核酸电泳条带采用Image J灰度分析软件进行灰度评估）所示，由图1和图2可知，因此，扩增效果较好引物为Primer-2、Primer-3、Primer-4、Primer-5、Primer-6五对引物组合（Primer-2扩增子区段内未发现有理想结构的探针）。

2、ToMV-RAA-LFS引物探针组合的筛选

筛选出较优的扩增产物所对应的引物组合后，在其扩增子范围内设计对应的Nfo探针，探针结构及设计原则如下：

（1） Nfo探针长度约为46~50 bp，在5’端往后第30~35 bp处用四氢呋喃残基（THF）替换一个碱基；

（2）在探针5’端添加羧基荧光素（FAM）修饰基团，3’端添加阻断剂（C3-Spacer）修饰；

（3）探针自我环化程度尽可能低，一般不形成连续3个碱基对的茎环，茎环结构小于2个；

（4）探针与上游引物和下游引物之间的碱基配对数应少于13，最长碱基配对数应小于6；

（5）探针设计位置应与下游引物之间尽量保持至少10个碱基的距离，不能与上下游引物重叠，以防形成严重的引物探针聚集体。

同时对组合中的下游引物5’端添加生物素（Biotin）修饰，将添加修饰基团的引物和探针送于公司合成，引物探针组合如表4所示：

表4 ToMV-（RT）RAA修饰引物探针组合

注意：表中每个组合对应的上游引物不加修饰，序列信息见表2。

以上引物和探针干粉管于室温4,500 rpm离心2 min使粉末沉于管底，小心开盖加入相应体积无RNA酶的H₂O使引物和探针的终浓度为10 μM，4 ℃避光保存备用。

将具体实施例一制备得到的pEASY-ToMV-MP&CP重组质粒稀释至10²、10¹、10⁰copy/μL，ddH₂O为阴性对照，以上作为模板放置冰上备用。用引物探针组合3、4、5、6分别进行RAA-LFS灵敏度测试。具体步骤如下：

（1）按照如下体系在200 μL的EP管中配制混合液：29.4 μL A缓冲液，2.1 μL上游引物（10 μM），3 μL下游引物（10 μM），0.6 μL探针（10 μM），1 μL RNA模板，11.4 μL ddH₂O，2.5 μL B缓冲液，总体积为50 μL。混合后将EP管瞬时离心，用移液器将混合液全部转移至MIRA反应单元，枪头轻轻吹打，待管内干粉充分溶解后，瞬时离心；

（2）立即将反应管放入恒温金属浴中，39 ℃孵育30 min；

（3）反应结束后，从每个反应管中取出5 μL反应液转至新的200 μL EP管，用ddH₂O稀释至50 μL，吹打混匀；

以pEASY-ToMV-MP&CP重组质粒检测引物探针组合3、4、5、6，如图3所示，结果显示引物探针组合3，4，6 RAA-LFS检测结果呈现假阳性，引物探针组合5未出现假阳性，测试结果良好。此外，如图4所示，从引物探针组合5的设计区段显示，其上下游引物序列与TMV同区段有一定的差异，且探针THF碱基替换位点前后与TMV序列同源性较低，提高了（RT）RAA反应中Nfo内切酶的切割准确性。总体而言，该组合具备区分TMV和ToMV的理论条件。

具体实施例三

ToMV-（RT）RAA-LFS体系灵敏度评估

1、以pEASY-ToMV-MP&CP重组质粒为模板

将pEASY-ToMV-MP&CP重组质粒用ddH₂O依次进行（10⁶~10⁰ copy/μL）的十倍梯度稀释，ddH₂O为阴性对照模板；制备辣椒、番茄健康叶片混样粗提液，取健康叶片各300 mg置于网格磨样袋，加入2 mL含0.05 % Tween-20的PBS溶液，充分研磨，然后将pEASY-ToMV-MP&CP重组质粒用辣椒、番茄健康叶片混样粗提液依次进行（10⁶~10⁰ copy/μL）的十倍梯度稀释，健康叶片粗提液为阴性对照模板，将以上稀释好的模板置于冰上备用。

用以上两种不同的稀释模板，以筛选出的最优引物探针作为后续评估ToMV-RT-RAA-LFS检测体系的引物探针组合，用安普RNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）作RAA-LFS灵敏度测试，扩增步骤如下：

（2）立即将反应管放入恒温金属浴中，39 ℃孵育30 min；

同时设计ToMV的PCR检测引物进行ddH₂O稀释质粒模板的PCR灵敏度测试，引物信息见表5所示。将三种检测方式的灵敏性结果进行比对分析。

表5 ToMV PCR检测引物

。

2、以ToMV侵染的本氏烟叶片总RNA为模板

将起始浓度约为1,000 ng/μL的病样总RNA用无RNA酶的H₂O进行（10⁰~10^-6 copy/μL）的十倍梯度稀释，无RNA酶的H₂O为阴性对照模板，将以上稀释好的模板置于冰上备用。

分别用TOYOBO一步法RT-PCR检测试剂盒和安普RNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）进行RT-PCR和RT-RAA-LFS两种方式的扩增反应。将两种方式检测的灵敏性进行比对分析。

3、以ToMV-MP&CP的RNA链为模板

通过利用SnapGene序列分析软件对参与比对的6条ToMV序列MP&CP区段进行酶切位点分析，该区段无Pst I内切酶的酶切位点，可通过pEASY-T5-Zero载体上的Pst I内切酶酶切位点将pEASY-ToMV-MP&CP重组质粒线性化，具体步骤如下：按照如下体系配制酶切体系：5 μL10×QuickCut Buffer，≤ 1 μg质粒DNA，1 μL QucikCut Pst I，加ddH₂O至体积为50 μL，轻轻吹打混匀，37 ℃水浴5 min；加入9 μL 6×Loading Buffer，吹打混匀，进行琼脂糖凝胶电泳（线性化的质粒一般电泳条带长度与Marker一致，但环状质粒电泳条带小于Marker）；切胶回收目的条带，用Nanodrop One进行浓度测定，置于冰上备用。

参考Promega T7体外转录试剂盒说明书，利用pEASY-T5-Zero载体上的T7启动子序列，将线性化的质粒转录为含ToMV-MP&CP的RNA单链片段，转录纯化步骤如下：

（1）提前10 min将冻存于-20 ℃的T7体外转录试剂盒各组分取出；

（2）置于冰上融化；以下体系在无RNA酶的200 μL EP管中配制T7转录反应混合液：

表 6 T7转录反应混合液

。

表7 试剂盒自带的阳性对照体外转录体系反应体系

混合后轻轻吹打混匀，于37 ℃水浴2~4 h；

（3）反应结束后在管中加入对应体系中每1 μg模板DNA添加1 U的RQ1 无RNA酶的DNA酶，37 ℃水浴15 min；

（4）取5 μL反应液至无RNA酶的EP管（原转录管暂置于冰上），加入1 μL 6×上样缓冲液，吹打混匀，进行琼脂糖凝胶电泳（为防止RNA过度降解，可先用RNA酶清除剂喷洒模具），检测否形成预期大小的RNA条带；

（5）在原转录管中加入1：1体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），涡旋震荡1 min萃取，4 ℃，13,200 rpm，离心2 min；

（6）将上层水相转移至无RNA酶的EP管中，并加入1：1体积的氯仿/异戊醇（24：1），涡旋震荡1 min萃取，4 ℃，13,200 rpm，离心2 min（该步骤可选）；

（7）将上层水相转移至无RNA酶的EP管中，加入1/10体积的醋酸钠（3 M，pH 5.2）和1：1体积的异丙醇，混合后放置于冰上2~5 min，于4 ℃，13,200 rpm，离心2 min；

（8）小心倒出或吸出上清液，加入300 μL 70 %乙醇（无RNA酶的H₂O配制）洗涤沉淀（即RNA片段），再重复洗涤一次；

（9）吸出残留的70 %乙醇，37 ℃烘箱放置5 min，干燥沉淀；

（10）加入100 μL 无核酸酶的H₂O或TE缓冲液溶解沉淀，Nanodrop One测定RNA浓度，置于冰上备用或-70 ℃保存。

将T7转录得到的ToMV-MP&CP RNA片段按浓度换算为拷贝数，换算公式如下：

根据RNA拷贝数，用无RNA酶的H₂O进行（10⁶~10⁰拷贝）的十倍梯度稀释，以无RNA酶的H₂O作为阴性对照，所有模板置于冰上备用。分别用TOYOBO一步法RT-PCR检测试剂盒和安普RNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）进行RT-PCR和RT-RAA-LFS两种方式的扩增反应。将两种方式检测的灵敏性进行比对分析。

以ddH₂O梯度稀释的pEASY-ToMV-MP&CP重组质粒作为模板，分别进行PCR和RAA-LFS灵敏度测试。如图5所示，结果显示，前者最低可检测到浓度为10³拷贝的重组质粒（图5a），后者则可检测到的质粒浓度低至10¹ copy/μL（图5b）。为适应田间样品的检测背景，我们用健康辣椒、番茄粗提液混液对pEASY-ToMV-MP&CP重组质粒进行了梯度稀释，并进行RAA-LFS检测，检测结果显示其灵敏度仍可至10¹ copy/μL（图5c）。

为比较RT-PCR和RT-RAA-LFS对田间样品的检测性能，以ToMV侵染的本氏烟叶片总RNA为模板进行了RT-PCR和RT-RAA-LFS灵敏度测试。如图6所示，结果显示，前者最低可检测稀释10³倍的总RNA中的ToMV（图6a），而后者最高可检测到的模板稀释倍数为10⁴~10⁵（图6b）。但此法仅能比较两种检测体系的灵敏度差异，难以对特异性检测病毒浓度的灵敏度值进行定量。为探索ToMV-RT-RAA-LFS检测体系在RNA形式下的灵敏度值，我们用T7体外转录的ToMV-MP&CP纯化后的ssRNA片段进行梯度稀释，分别作一步法RT-PCR和RT-RAA-LFS检测。如图7所示，检测结果显示，RT-PCR的灵敏度为10⁴ copy/μL（图7a），而RT-RAA-LFS体系检测灵敏度仍可至10¹ copy/μL（图7b）。在灵敏度的评估中，相比重组质粒作为模板，RT-PCR灵敏度降低了1个数量级，原因推测是模板片段以ssRNA的形式存在，而RT-PCR反应涉及高温变性，且反应时间较长，使模板产生了一定的降解，在较低拷贝浓度模板的情况下影响了RT-PCR的灵敏度。

具体实施例四

ToMV-RT-RAA-LFS体系特异性评估

为测定我们设计优选的ToMV-RT-RAA检测引物的特异性，分别以田间辣椒及番茄植物上检出率较高的黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、番茄斑萎病毒、蚕豆萎蔫病毒、辣椒轻斑驳病毒、马铃薯X病毒侵染的病样RNA为特异性评估模板，以ToMV侵染的本氏烟病叶RNA为阳性模板，以健康辣椒，番茄叶片RNA混样为阴性模板，用安普RNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）进行RT-RAA-LFS检测，检测结果拍照记录。

如图8所示，反应结果显示筛选的引物应用于RT-RAA检测与以上病毒模板均不产生交叉反应。同时，本实验选用的样本包含辣椒、番茄、黄瓜、菊三七等多种寄主植物，一定程度上表明不同寄主植物来源的汁液对该检测体系影响也较小。综上所述，本研究建立的ToMV检测体系具有良好的专一性。

具体实施例五

ToMV-RT-RAA-LFS体系反应时间评估

为筛选ToMV-RT-RAA-LFS检测体系检测田间样品的合适反应时间，我们以ToMV侵染的番茄显症叶片粗提液为模板进行反应，每隔5 min设置梯度反应时间。具体为：随机挑选ToMV侵染的山东番茄显症病叶300 mg（取3次病样作为独立重复），分别取健康及发病的番茄叶片各300 mg置于网格磨样袋，加入2 mL含0.05 % Tween-20的PBS溶液，充分研磨后放置于冰上作模板备用。设置RT-RAA反应时间为0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25min、30 min七个梯度，用安普RNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）进行扩增反应。各时间梯度反应结束立即将反应单元置于冰上，取5 μL反应液稀释至50 μL，插入侧流层析试纸条检测结果并记录。如图9所示，LFS监测结果显示，在反应时间20 min起即可观察到明显的阳性检测线。

具体实施例六

ToMV-RT-RAA-LFS体系田间样品检出率分析

取16株采自云南、宁夏和浙江省的田间辣椒疑似病毒病样叶片，实验室温室种植的辣椒（杭椒1号）健康样叶片（作阴性对照）各300 mg，制成粗提液，置于冰上作模板备用。使用安普RNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型），对辣椒模板进行RT-RAA-LFS体系检测，同时将以上辣椒模板对应的cDNA样品作为模板进行PCR检测。比较分析田间辣椒疑似病毒感染样品的RT-RAA-LFS与PCR的检出率和两种方法检测结果之间的相关性。

如图10所示，对16株辣椒田间疑似感染病毒病样品粗提液的RT-RAA-LFS检测结果显示，有12株检测ToMV阳性，检出率为75 %，与PCR法的检测结果一致。如图11所示，对8株番茄田间疑似病毒病样品粗提液的RT-RAA-LFS检测结果显示，有3株检测ToMV阳性，检出率为37.5 %，也与PCR法的检测结果一致。综上所述，本研究建立的ToMV-RT-RAA-LFS检测体系具有和传统RT-PCR方法一致的检测结果，针对多个地区辣椒和番茄田间发生的病毒病害样品检测，表现出良好的普适性。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁波大学

<120> 番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测引物、探针和试剂盒及应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 上游引物ToMV-RAA-F5(AGTGCGGGCTACTGCCCTTTGTCATTAGAA)

<400> 1

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 下游引物ToMV-RAA-R5(Biotin-TATTTTTCGGACCTCTTTTTGAGGATTTGGT)

<400> 2

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 探针ToMV-probe-5(FAM-TAATATAAAATTGGGTTTGAGGGAGAAAGTATHFCGAGTGTGAACGATGGA-C3-Spacer)

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> ToMV-MP&CP（+）（ATGGCTCTAGTTGTTAAAGGT）

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> TuMV-MP&CP（-）（TTAAGATGCAGGTGCAGAGGT）

<400> 5

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-F1（CTGTCCGAACTGTCTGTACTTAAAAATTCA）

<400> 6

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-R1（TGTATGAAGATTCAGGAACGTCGCCAGATAAT）

<400> 7

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-F2（ATTATCTGGCGACGTTCCTGAATCTTCATACA）

<400> 8

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-R2（GTTCTTTGCGGATGGTTTAACTAGCCACCTTTTC）

<400> 9

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-F3（GTATGTTTGCTTAGTTGGTCTTGTTGTGTCC）

<400> 10

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-R3（TATGTTCTTTTCTGCATCCTTTGTTGTAATAC）

<400> 11

<210> 12

<211> 54

<212> DNA

<213> ToMV-probe-3（FAM-CCGTGGTGGTGTGAGTGTCTGCATGGTTGACAA(THF)AGAATGGAAAGAGCGG-C3-Spacer）

<400> 12

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-F4（GTATGTTTGCTTAGTTGGTCTTGTTGTGTCC）

<400> 13

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-R4（TTCTAATGACAAAGGGCAGTAGCCCGCACT）

<400> 14

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> ToMV-probe-4（FAM-CAGTTTAAAGTGGTCCCAAATTACGGTATTACAAC(THF)AAGGATGCAGAA-C3-Spacer）

<400> 15

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-F6（AGTGCGGGCTACTGCCCTTTGTCATTAGAA）

<400> 16

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-R6（CTTCATCAAAACTTTTTGGTTTAGGCCTTCCGC）

<400> 17

<210> 18

<211> 51

<212> DNA

<213> ToMV-probe-6（FAM-TTATAAAAATAATATAAAATTGGGTTTGAG(THF)GAGAAAGTAACGAGTG-C3-Spacer）

<400> 18

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-F7（ACCAAATCCTCAAAAAGAGGTCCGAAAAATA）

<400> 19

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-R7（CCCCAGCAACGCAGTAATTAGAGGATCTAAAACT）

<400> 20

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-F8（GGCGGAAGGCCTAAACCAAAAAGTTTTGATGAAG）

<400> 21

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> ToMV-RAA-R8（CCCCAGCAACGCAGTAATTAGAGGATCTAAAACT）

<400> 22

Claims

1.一种番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测引物、探针，其特征在于包括根据番茄花叶病毒的运动蛋白和外壳蛋白区段设计特异性引物及荧光探针，引物序列具体如下：上游引物ToMV-RAA-F5：AGTGCGGGCTACTGCCCTTTGTCATTAGAA；下游引物ToMV-RAA-R5：Biotin-TATTTTTCGGACCTCTTTTTGAGGATTTGGT；探针ToMV-probe-5：FAM-TAATATAAAATTGGGTTTGAGGGAGAAAGTA(THF)CGAGTGTGAACGATGGA-C3-pacer。

2.一种番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括反应体系如下：29.4 μL A 缓冲液，2.1 μL 10 μM的上游引物，3 μL10 μM的下游引物，0.6μL10 μM的探针，1 μL RNA模板，11.4 μL ddH₂O，2.5 μL B 缓冲液，总体积为50 μL，其中引物序列具体如下：上游引物ToMV-RAA-F5：AGTGCGGGCTACTGCCCTTTGTCATTAGAA；下游引物ToMV-RAA-R5：Biotin-TATTTTTCGGACCTCTTTTTGAGGATTTGGT；探针ToMV-probe-5：FAM-TAATATAAAATTGGGTTTGAGGGAGAAAGTA(THF)CGAGTGTGAACGATGGA-C3-pacer。

3.权利要求1所述的番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测引物、探针的应用，其特征在于用于检测番茄花叶病毒包括以下步骤：

（2）立即将反应管放入恒温金属浴中，39 ℃孵育30 min；

（3）反应结束后，从每个反应管中取出5 μL反应液转至新的离心管中，用ddH₂O稀释至50μL，吹打混匀；