CN114934133A - 快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法 - Google Patents

快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114934133A
CN114934133A CN202210330412.6A CN202210330412A CN114934133A CN 114934133 A CN114934133 A CN 114934133A CN 202210330412 A CN202210330412 A CN 202210330412A CN 114934133 A CN114934133 A CN 114934133A
Authority
CN
China
Prior art keywords
eapv
virus
east asia
rapidly detecting
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210330412.6A
Other languages
English (en)
Inventor
罗杰
李名扬
王瑞
王玉慧
郭志宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hainan University
Original Assignee
Hainan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hainan University filed Critical Hainan University
Priority to CN202210330412.6A priority Critical patent/CN114934133A/zh
Publication of CN114934133A publication Critical patent/CN114934133A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法，简单易行，具有灵敏度高、特异性强、反应时间短(仅需30min)等特点，可以实现常温操作，常温反应以及常温保存，非常适合田间大规模快速检测。

Description

快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及植物病毒检测技术领域，具体涉及快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法。
背景技术
东亚西番莲病毒(East Asian passiflora virus，EAPV)是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒中的一种，是百香果(Passiflora edulis)上危害较严重的一类病毒。EAPV病毒病发生后，百香果会表现为花叶、斑驳和皱缩，会通过介体传播及非介体传播在种苗间快速扩散感染，感染率在30％～40％，严重的90％以上，并且一旦感染，治愈率几乎为0。最佳防御措施是高温销毁以阻断传播。目前EAPV已在中国、日本等亚洲国家和地区陆续发生，对百香果产量和品质造成了不同程度的影响。
自2018年开始，百香果被列为海南特色农产品调优增效产业之一，目前全省种植面积为1.3万亩左右，反季节销售使百香果已成为促进当地农业经济增长的重要产业。但海南省百香果种植目前尚无自主培育的优良新品种，近年来大规模引种栽培百香果易忽视病毒病防控工作。同时海南百香果销售很大部分是以个体农户或小规模的生产经营为主，种植技术水平较低，田间管理较粗放，病毒病介体传播及非介体传播防治还不到位。所以病毒病成为了威胁百香果产业发展的一个重要技术障碍，与此同时大规模的对百香果实现田间病毒病快速检测，从源头阻断传播、降低田间感染率成为百香果病毒病防控的重中之重。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法，可以在田间实现短时、准确的批量检测EAPV病毒。
为了实现本发明的技术目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒，包括：EAPV引物，所述EAPV引物的序列为：
EAPV-F：5′-gattcaaatcttggaagatgacccatatatcc-3′，
EAPV-R：5′-gtatgagtgtgattgtgatgggcaatccac-3′。
优选地，还包括EAPV探针，所述EAPV探针包括四个修饰位点：距离5′端≥35nt的中部位置标记一个dSpacer(四氢呋喃，THF)，作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基团，两个基团的间距为2-4nt；THF距离3′末端≥15nt，并且3′末端标记一个修饰基团。
更优选地，所述修饰基团选自胺基、磷酸基团或C3-Spacer。
更优选地，所述EAPV探针的序列为：
tgctaatccatatgtaccgtatgcgtca[FAM-dT]t[THF][BHQ1-dT]gagaagggtataca[C3-spacer]。
本发明还提供了快速检测东亚西番莲病毒的方法，包括：
1)向反应管中加入上游引物、下游引物、探针、RNase-free水、核酸模板和缓冲液；
上游引物的序列为：5′-gattcaaatcttggaagatgacccatatatcc-3′，
下游引物的序列为：5′-gtatgagtgtgattgtgatgggcaatccac-3′，
探针序列为：
tgctaatccatatgtaccgtatgcgtca[FAM-dT]t[THF][BHQ1-dT]gagaagggtataca[C3-spacer]；
2)混匀后，将反应液甩至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中，恒温42℃，反应时间30min。
3)将反应后的产物置于荧光检测仪中，在阴性对照呈现无荧光，阳性对照呈现荧光的情况下，若样品呈现荧光，说明此样品存在EAPV病毒的感染；若样品无荧光，说明此样品不存在EAPV病毒的感染。
优选地，步骤1)中通过以下方法获取核酸模板：取5-10g百香果新鲜的嫩叶置于1.5mL的离心管中(RNA专用)，加入15-25μL RNase free水，用研磨棒将其研磨至匀浆状，吸取2μL至新的离心管中并稀释至50μL作为核酸模板使用。
优选地，步骤1)每10μL反应体系中，加入0.4μL上游引物、0.4μL下游引物、0.24μL探针、2.08μL RNase-free水、0.5μL核酸模板和6.38μL缓冲液。
优选地，步骤1)中引物和探针浓度分别为10μM和5μM。
优选地，步骤3)中阴性对照的模板为RNase-free水(去RNA酶水)，阳性对照的模板为EAPV质粒。
本发明的有益效果在于：
本发明基于MIRA法实现的东亚西番莲病毒快速检测操作方法简单易行，具有灵敏度高、特异性强、反应时间短(仅需30min)等特点，可以实现常温操作，常温反应以及常温保存，非常适合田间大规模快速检测。
附图说明
图1本发明RT-PCR法检测EAPV不同稀释倍数的电泳图。
图2本发明检测EAPV特异性荧光图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
申请人为了帮助农户解决田间快速鉴定百香果病毒病的问题，在全省进行调研，了解到EAPV病毒病在海南省百香果种植中分布较广，危害较重。本申请针对EAPV病毒设计特异性引物，证实利用RNA恒温快速扩增荧光(Multienzyme Isothermal RapidAmplification，MIRA)型试剂盒可以在田间实现短时、准确的批量检测EAPV病毒。以下检测试剂(如A buffer、B buffer)来自RNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)试剂盒(潍坊安普未来生物科技有限公司)。
实施例
一、MIRA法检测EAPV具体步骤：
1.引物设计：根据EAPV保守序列设计引物。
表一EAPV引物序列
Figure BDA0003572831450000031
2.探针设计：探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。
探针共有四个修饰位点：距离5’端的≥35nt的中部位置标记一个dSpacer(四氢呋喃，THF)，作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个粹灭基团，两个基团的间距为2-4nt；THF距离3’末端≥15nt,并且3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer。
表二EAPV探针序列
Figure BDA0003572831450000041
3.取样：取小片(约5g)百香果新鲜的嫩叶置于1.5mL的离心管中(RNA专用)，加入15-25μL RNase free，用研磨棒将其研磨至匀浆状，吸取2μL至新的离心管中并稀释至50μL作为核酸模板使用。
4.检测操作步骤：
1)每个干粉反应管加入29.4μL A buffer(注意：A buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响)、2μL上游引物、2μL下游引物和1.2μL探针(引物和探针浓度分别为10μM和5μM)，混匀后平均分装至5个反应管，每管6.92微升上述混匀液；
2)向每个反应管中依次加入2.08μL RNase-free水和0.5μL核酸模板；
3)最后向反应管中加入0.5μL B buffer并充分混合；
4)混匀后，将反应液甩(或快速离心)至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中。恒温42℃，反应时间30min。
5)将反应后的产物至于荧光检测仪中。在阴性对照(RNAse-free水)呈现无荧光，阳性对照(EAPV质粒，浓度为93ng/μL)呈现荧光的情况下，若样品呈现荧光，说明此样品存在EAPV病毒的感染；若样品无荧光，说明此样品不存在EAPV病毒的感染。
二、灵敏度测试
对EAPV质粒(浓度91ng/μL)先进行10倍梯度稀释，稀释106倍后以2倍梯度稀释测试其灵敏度(表三)，同时RT-PCR辅助验证(图1)。发现MIRA法比RT-PCR法检测EAPV的灵敏度要高达320倍。
表三MIRA法检测EAPV不同稀释倍数的荧光值
Figure BDA0003572831450000051
注：阴性对照为RNAse-free水(去RNA酶水)。
三、特异性测试
用百香果常见的三种病毒病夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus，TeMV)、西番莲斑驳病毒(Passiflora mottle virus，PaMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)检测EAPV引物的特异性，由图2发现，EAPV的引物具有特异性，适用于田间快速检测EAPV病毒病。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒，包括：EAPV引物，所述EAPV引物的序列为：
EAPV-F：5′-gattcaaatcttggaagatgacccatatatcc-3′，
EAPV-R：5′-gtatgagtgtgattgtgatgggcaatccac-3′。
2.根据权利要求1所述的快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒，其特征在于，还包括EAPV探针，所述EAPV探针包括四个修饰位点：距离5′端≥35nt的中部位置标记一个dSpacer，THF，作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基团，两个基团的间距为2-4nt；THF距离3′末端≥15nt，并且3′末端标记一个修饰基团。
3.根据权利要求2所述的快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒，其特征在于，所述修饰基团选自胺基、磷酸基团或C3-Spacer。
4.根据权利要求2或3所述的快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒，其特征在于，所述EAPV探针的序列为：
tgctaatccatatgtaccgtatgcgtca[FAM-dT]t[THF][BHQ1-dT]gagaagggtataca[C3-spacer]。
5.快速检测东亚西番莲病毒的方法，包括：
1)向反应管中加入上游引物、下游引物、探针、RNase-free水、核酸模板和缓冲液；
上游引物的序列为：5′-gattcaaatcttggaagatgacccatatatcc-3′，
下游引物的序列为：5′-gtatgagtgtgattgtgatgggcaatccac-3′，
探针序列为：
tgctaatccatatgtaccgtatgcgtca[FAM-dT]t[THF][BHQ1-dT]gagaagggtataca[C3-spacer]；
2)混匀后，将反应液甩至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中，恒温42℃，反应时间30min；
3)将反应后的产物置于荧光检测仪中，在阴性对照呈现无荧光，阳性对照呈现荧光的情况下，若样品呈现荧光，说明此样品存在EAPV病毒的感染；若样品无荧光，说明此样品不存在EAPV病毒的感染。
6.根据权利要求5所述的快速检测东亚西番莲病毒的方法，其特征在于，步骤1)中通过以下方法获取核酸模板：取5-10g百香果新鲜的嫩叶置于1.5mL的离心管中，加入15-25μLRNase free水，用研磨棒将其研磨至匀浆状，吸取2μL至新的离心管中并稀释至50μL作为核酸模板使用。
7.根据权利要求5所述的快速检测东亚西番莲病毒的方法，其特征在于，步骤1)每10μL反应体系中，加入0.4μL上游引物、0.4μL下游引物、0.24μL探针、2.08μL RNase-free水、0.5μL核酸模板和6.38μL缓冲液。
8.根据权利要求5所述的快速检测东亚西番莲病毒的方法，其特征在于，步骤1)中引物和探针浓度分别为10μM和5μM。
9.根据权利要求5-7任意一项所述的快速检测东亚西番莲病毒的方法，其特征在于，步骤3)中阴性对照的模板为RNase-free水，阳性对照的模板为EAPV质粒。
CN202210330412.6A 2022-03-30 2022-03-30 快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法 Pending CN114934133A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210330412.6A CN114934133A (zh) 2022-03-30 2022-03-30 快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210330412.6A CN114934133A (zh) 2022-03-30 2022-03-30 快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114934133A true CN114934133A (zh) 2022-08-23

Family

ID=82862940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210330412.6A Pending CN114934133A (zh) 2022-03-30 2022-03-30 快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114934133A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180054160A (ko) * 2016-11-15 2018-05-24 대한민국(농촌진흥청장) 패션프루트 감염 바이러스 4종 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
WO2019023587A1 (en) * 2017-07-28 2019-01-31 Two Blades Foundation POTYVIRUS RESISTANCE GENES AND METHODS OF USE
CN110846440A (zh) * 2019-12-16 2020-02-28 福建省农业科学院果树研究所 一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用
CN111424117A (zh) * 2020-04-23 2020-07-17 舟山医院 一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光rt-raa检测试剂盒
CN111621579A (zh) * 2020-05-30 2020-09-04 潍坊安普未来生物科技有限公司 常温等温快速检测副溶血弧菌的引物、探针、试剂和方法
CN113025750A (zh) * 2021-02-20 2021-06-25 广东省科学院生物工程研究所 一种同时检测百香果三种病毒的引物组、试剂盒及方法
CN113430302A (zh) * 2021-06-29 2021-09-24 宁波大学 番茄花叶病毒的rt-raa-lfs快速可视化检测引物、探针和试剂盒及应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180054160A (ko) * 2016-11-15 2018-05-24 대한민국(농촌진흥청장) 패션프루트 감염 바이러스 4종 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
WO2019023587A1 (en) * 2017-07-28 2019-01-31 Two Blades Foundation POTYVIRUS RESISTANCE GENES AND METHODS OF USE
CN110846440A (zh) * 2019-12-16 2020-02-28 福建省农业科学院果树研究所 一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用
CN111424117A (zh) * 2020-04-23 2020-07-17 舟山医院 一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光rt-raa检测试剂盒
CN111621579A (zh) * 2020-05-30 2020-09-04 潍坊安普未来生物科技有限公司 常温等温快速检测副溶血弧菌的引物、探针、试剂和方法
CN113025750A (zh) * 2021-02-20 2021-06-25 广东省科学院生物工程研究所 一种同时检测百香果三种病毒的引物组、试剂盒及方法
CN113430302A (zh) * 2021-06-29 2021-09-24 宁波大学 番茄花叶病毒的rt-raa-lfs快速可视化检测引物、探针和试剂盒及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111593141A (zh) 基于rpa的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒及检测方法
CN114045356B (zh) 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病的试剂盒及方法
CN103484571B (zh) 传染性皮下及造血组织坏死病毒的lamp检测引物组、检测试剂盒及检测方法
Zong et al. Rapid detection of Prunus necrotic ringspot virus using magnetic nanoparticle-assisted reverse transcription loop-mediated isothermal amplification
CN114231665A (zh) 一种菜豆金色花叶病毒属rpa-lfd检测试剂盒及其应用
CN114934133A (zh) 快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法
CN110499370A (zh) 一种基于rpa技术检测爪哇根结线虫的引物和探针
CN112538532A (zh) 一种松材或拟松材线虫的荧光定量pcr检测引物、试剂盒及方法
Khurana et al. Recent developments towards detection & diagnosis for management of plant viruses
CN114941040A (zh) 快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒及方法
CN114934134A (zh) 快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒及方法
CN114381551B (zh) 一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光raa引物、探针及试剂盒
CN116287427A (zh) Raa-lfd检测鸭坦布苏病毒的引物和探针组合及其应用
CN108330178A (zh) 一种检测番茄早疫病菌的环介导等温扩增引物及应用
CN104862426B (zh) 柑桔褪绿矮化相关病毒的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN110804674B (zh) 一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆根腐病的引物探针组合物、试剂盒及其应用
CN109735606B (zh) 荧光定量pcr对吡虫啉水体污染的快速检测方法
CN106521038A (zh) 一种高灵敏度的bhv‑2实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN109825647A (zh) 一种紫云英矮缩病毒的快速检测试剂盒
CN109371173A (zh) 一种基于rpa检测番茄褪绿病毒的方法
CN110885892A (zh) 一种多杀性巴氏杆菌的检测方法及其引物和探针
CN110894554B (zh) 一种检测鲤疱疹病毒ii型的引物探针组、试剂盒与应用
CN110004249A (zh) 一种鉴定新型鹅细小病毒的方法
CN113322353B (zh) 一种检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的rpa试剂盒
CN117757984B (zh) 一种用于假高粱鉴定的dna探针、试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination