CN103484571B - 传染性皮下及造血组织坏死病毒的lamp检测引物组、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

传染性皮下及造血组织坏死病毒的lamp检测引物组、检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。LAMP检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物：所述的外引物、内引物和环引物，其核苷酸序列分别为：IHHNV-F3：GAGACAACCGACGACATC；IHHNV-B3：TCTCTGATGACGAAGGTGT；IHHNV-FIP：TTGTGTTCCGCTACTACAGCTCGATCATGGAAGCAATGGA；IHHNV-BIP：TGAAGGGACTCCCAACGGATCTCACTCTCTTCCAGTCG；IHHNV-LF：CATCGGTAGGTTCCAGTCG；IHHNV-LB：CGGACGAAATGGACGGAA。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点。

Description

传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术：
传染性皮下及造血组织坏死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV）是世界各地养殖和野生对虾的重要病毒性病原之一。该病毒的感染宿主范围广、危害非常严重；对细角滨对虾（Litopenaeus stylirostris）有很高致病性，能造成其幼体和仔虾高达90%的死亡率；也会导致凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）慢性矮小残缺综合症（Runt-deformity syndrome,RDS），使养殖凡纳滨对虾规格参差不齐，产量下降，造成高达50%的经济损失。因此，国际兽疫局（OIE）将IHHNV引起的疾病列为必须报告的重要的水生动物病毒性疫病之一。通过原位杂交方法显示IHHNV普遍存在于我国的很多养殖对虾中。但是目前对IHHNV引起的对虾病害尚无有效的治疗方法,只能预防,避免与病毒病原体的接触是最有效的预防措施,而这又主要依赖于早期的快速诊断。因此,建立IHHNV快速、有效、准确的检测和诊断技术是预防此类疫病的重要技术手段之一。
近年来基于临床组织病理学、免疫学以及PCR技术等的各种诊断方法已被用于IHHNV的检测。但是现有的这些方法都存在一定的不足，例如：基于组织病理学的方法不仅操作繁琐、费时，而且灵敏度较低；基于免疫学的方法虽然具有敏感性高、检测快速等特点，可用于大批标本的检测，但对新鲜样品进行检测时出现的假阳性问题在一定程度上还限制着该方法的广泛应用；而PCR方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。
LAMP是由日本学者Notomi发明的一种新型核酸扩增技术，该技术针对靶基因的6或8个区域设计4或6条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温条件下即可完成核酸扩增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带。LAMP技术在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应的特异性和缩短了检测时间；特别是它不需使用昂贵的热循环仪，凝胶电泳和紫外检测等设备，降低了成本，已广泛应用于病原微生物的检测。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP检测引物组。
所述的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物：
所述的一对外引物，其核苷酸序列为：
IHHNV-F3：GAGACAACCGACGACATC（SEQ ID NO.1）；
IHHNV-B3：TCTCTGATGACGAAGGTGT（SEQ ID NO.2）；
所述的一对内引物，其核苷酸序列为：
IHHNV-FIP：TTGTGTTCCGCTACTACAGCTCGATCATGGAAGCAATGGA（SEQ IDNO.3）；
IHHNV-BIP：TGAAGGGACTCCCAACGGATCTCACTCTCTTCCAGTCG（SEQ IDNO.4）；
所述的一对环引物，其核苷酸序列为：
IHHNV-LF：CATCGGTAGGTTCCAGTCG（SEQ ID NO:5）；
IHHNV-LB：CGGACGAAATGGACGGAA（SEQ ID NO:6）。
本发明的第二个目的是提供一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照质控品、阴性对照质控品和LAMP检测引物组，其特征在于，所述的LAMP检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物：
所述的一对外引物，其核苷酸序列为：
IHHNV-F3：GAGACAACCGACGACATC（SEQ ID NO.1）；
IHHNV-B3：TCTCTGATGACGAAGGTGT（SEQ ID NO.2）；
所述的一对内引物，其核苷酸序列为：
IHHNV-FIP：TTGTGTTCCGCTACTACAGCTCGATCATGGAAGCAATGGA（SEQ IDNO.3）；
IHHNV-BIP：TGAAGGGACTCCCAACGGATCTCACTCTCTTCCAGTCG（SEQ IDNO.4）；
所述的一对环引物，其核苷酸序列为：
IHHNV-LF：CATCGGTAGGTTCCAGTCG（SEQ ID NO:5）；
IHHNV-LB：CGGACGAAATGGACGGAA（SEQ ID NO:6）。
所述的环介导等温扩增反应液是由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液按照体积比8：5：2混合而成。
所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
所述阳性对照为含有对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）非结构蛋白基因（NS1）片段的T载体克隆，阴性对照为超纯水。
所述的检测试剂盒中还可含有显色剂，所述显色剂为荧光染料SYTO-9。
本发明的第三个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（4）采用病毒DNA提取试剂盒提取样品DNA；
（5）使用上述的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP检测引物组，与环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶和样品DNA混合形成扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应，以阳性对照质控品和阴性对照质控品分别作为阳性对照和阴性对照；
（6）扩增反应完成后，通过与阳性对照和阴性对照进行对比，判断样品扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物，来判断样品中是否含有对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒。
所述的通过与阳性对照和阴性对照进行对比，判断样品扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物，来判断样品中是否含有对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒，具体为通过浊度仪软件自行分析反应管中的浊度变化来判断反应扩增结果，浊度仪软件界面出现“S”形扩增曲线为阳性，否则为阴性；或者当在检测试剂盒中含有显色剂的情况下，如含有荧光染料SYTO-9，在反应管中加入荧光染料SYTO-9，然后将反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。
所述步骤（2）的扩增反应体系为，25μl反应体系含有：IHHNV-F30.2μM，IHHNV-B30.2μM，IHHNV-FIP1.6μM，IHHNV-BIP1.6μM，IHHNV-LF0.8μM，IHHNV-LB0.8μM，环介导等温扩增反应液12.5μl，DNA聚合酶10U，样品DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl。
所述步骤（2）的进行环介导等温扩增反应，其反应参数为：63℃反应30～60min，并在80℃持续2min。
本研究采用新型的恒温反应及检测仪器ESE-Quant tube scanner开发IHHNV的LAMP检测方法，该仪器通过吸收荧光来实时判断反应的进行。比传统LAMP终点判断产物的浊度或颜色变化更客观可靠。由于过程的数据化和自动化，可用于科研，开发新的检测方法。由于其便携、易操作，比起定量PCR仪，节约了大量成本，适合基层推广检测，符合疾病检测的快速、准确的诊断需要。
本研究将以IHHNV非结构蛋白基因（NS1）为靶位点设计LAMP引物，以ESE-Quant tubescanner为恒温反应及检测平台，建立检测方法。并在此平台上与OIE（2012）PCR检测结果进行比较。
相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）快速高效：整个扩增只用30～60min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
（2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；
（3）高特异性：对健康对虾、耶尔森式菌、李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓杆菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌DNA不发生扩增，只特异性的对对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒发生扩增，这是由于本发明根据对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的非结构蛋白基因（GenBank登录号为AF218266.2）设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；。
（4）高灵敏度：最低检测极限可达到1fg/反应；
（5）鉴定简便：可通过是否存在焦磷酸镁沉淀，或者加入SYTO-9，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
因此本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点。
附图说明：
图1是实施例1的IHHNV实时荧光LAMP特异性检测结果图；
图2是实施例2的IHHNV实时荧光LAMP DNA灵敏度检测结果图，能检测到105倍稀释的DNA；
图3是实施例3的IHHNV实时荧光LAMP质粒灵敏度检测图，能检测到浓度为1fg/μl的阳性质粒。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
一、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测试剂盒
1、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的的检测引物组设计：以对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的非结构蛋白基因（GenBank登录号为AF218266.2）为靶位点，利用在线设计软件Primer Explorer version4(http://primerexplorer.jp/e)进行LAMP引物的设计。引物序列见表1。
表1：引物序列表
2、环介导等温扩增反应液：由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，按照体积比8：5：2混合而成。
3、阳性对照为含有对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）囊膜蛋白基因片段的T载体克隆，其制备方法为：以分离鉴定的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒DNA为模板，利用表1中的外引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）对IHHNV DNA进行扩增，所得基因片段长度为214bp，序列如SEQ ID NO:7所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。
4、阴性对照为超纯水。
二、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测以及特异性实验
样品：对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、健康对虾、耶尔森式菌、李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓杆菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌，按照常规方法分别提取上述样品的基因组DNA。
环介导等温扩增反应：25μl反应体系含有：IHHNV-F30.2μM，IHHNV-B30.2μM，IHHNV-FIP1.6μM，IHHNV-BIP1.6μM，IHHNV-LF0.8μM，IHHNV-LB0.8μM，环介导等温扩增反应液12.5μl，Bst DNA聚合酶10U，10×SYTO-90.5μl，样品基因组DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，于63℃反应60min，并在80℃持续2min；
（3）结果判断：将反应管放置在ESE-Quant tube scanner中进行反应，观察ESE-Quant tubescanner软件判断扩增结果，如果出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
鉴定结果如图1所示，由图1可以看出，以对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测引物组为引物，IHHNV DNA正常扩增，阴性对照水及健康对虾、耶尔森式菌、李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓杆菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌的基因组DNA没有扩增。显示出良好的特异性。
实施例2：灵敏度实验
将已纯化的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的基因组DNA作10倍梯度稀释作为稀释样品的基因组DNA。
环介导等温扩增反应：25μl反应体系含有：IHHNV-F30.2μM，IHHNV-B30.2μM，IHHNV-FIP1.6μM，IHHNV-BIP1.6μM，IHHNV-LF0.8μM，IHHNV-LB0.8μM，环介导等温扩增反应液12.5μl，Bst DNA聚合酶10U，10×SYTO-90.5μl，稀释样品的基因组DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，于63℃反应60min，并在80℃持续2min；
（3）结果判断：将反应管放置在ESE-Quant tube scanner中进行反应，观察ESE-Quant tubescanner软件判断扩增结果，如果出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
鉴定结果如图2所示，从图2可以看出，101～105倍稀释的IHHNV DNA发生扩增，106～107倍稀释模板没有扩增。而OIE(2012)PCR方法能检测104倍稀释DNA。说明本研究构建的LAMP方法灵敏度高于OIE(2012)PCR方法。
实施例3：阳性质粒灵敏度实验
用紫外分光光度计测量阳性质粒（含有对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）囊膜蛋白基因片段的T载体克隆）的浓度，并将其稀释到1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、100ag/μl，将其作为样品的DNA。参照实施例2的操作方法分别对稀释后的阳性质粒进行检测。
鉴定结果如图3所示，从图3可以看出，对阳性质粒的检测限达到1fg/μl
实施例4：
采用本发明的检测试剂盒进行临床标本盲检的实验，检测59份对虾标本，参照实施例2的操作方法进行。同时应用OIE（2012）PCR检测方法对该59份对虾标本进行检测。
结果显示，本发明的检测试剂盒检测阳性率为25.4%（15/59），PCR方法的阳性率为16.7%（11/66），两者存在4个阳性结果的差异，分别对这差异样品DNA进PCR扩增并测序，测序结果显示本发明建立的方法外引物扩增后的产物测序为阳性，由此证明本发明的检测方法是正确可靠的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP检测引物组，其特征在于，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物：
所述的一对外引物，其核苷酸序列为：
IHHNV-F3：GAGACAACCGACGACATC；
IHHNV-B3：TCTCTGATGACGAAGGTGT；
所述的一对内引物，其核苷酸序列为：
IHHNV-FIP：TTGTGTTCCGCTACTACAGCTCGATCATGGAAGCAATGGA；
IHHNV-BIP：TGAAGGGACTCCCAACGGATCTCACTCTCTTCCAGTCG；
所述的一对环引物，其核苷酸序列为：
IHHNV-LF：CATCGGTAGGTTCCAGTCG；
IHHNV-LB：CGGACGAAATGGACGGAA。
2.一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照质控品、阴性对照质控品和LAMP检测引物组，其特征在于，所述的LAMP检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物：
所述的一对外引物，其核苷酸序列为：
IHHNV-F3：GAGACAACCGACGACATC；
IHHNV-B3：TCTCTGATGACGAAGGTGT；
所述的一对内引物，其核苷酸序列为：
IHHNV-FIP：TTGTGTTCCGCTACTACAGCTCGATCATGGAAGCAATGGA；
IHHNV-BIP：TGAAGGGACTCCCAACGGATCTCACTCTCTTCCAGTCG；
所述的一对环引物，其核苷酸序列为：
IHHNV-LF：CATCGGTAGGTTCCAGTCG；
IHHNV-LB：CGGACGAAATGGACGGAA。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应液是由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液按照体积比8：5：2混合而成。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照质控品为含有对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒非结构蛋白基因NS1片段的T载体克隆，阴性对照质控品为超纯水。
6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒中还含有显色剂，所述显色剂为荧光染料SYTO-9。
7.一种非疾病的诊断和治疗目的的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采用病毒DNA提取试剂盒提取样品DNA；
（2）使用权利要求1所述的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP检测引物组，与环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶和样品DNA混合形成扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应，以阳性对照质控品和阴性对照质控品分别作为阳性对照和阴性对照；
（3）扩增反应完成后，通过与阳性对照和阴性对照进行对比，判断样品扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物，来判断样品中是否含有对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的通过与阳性对照和阴性对照进行对比，判断样品扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物，来判断样品中是否含有对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒，具体为通过浊度仪软件自行分析反应管中的浊度变化来判断反应扩增结果，浊度仪软件界面出现“S”形扩增曲线为阳性，否则为阴性；或者当含有显色剂荧光染料SYTO-9的情况下，在反应管中加入荧光染料SYTO-9，然后将反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）的扩增反应体系为，25μl反应体系含有：IHHNV-F30.2μM，IHHNV-B30.2μM，IHHNV-FIP1.6μM，IHHNV-BIP1.6μM，IHHNV-LF0.8μM，IHHNV-LB0.8μM，环介导等温扩增反应液12.5μl，DNA聚合酶10U，样品DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μl。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）的进行环介导等温扩增反应，其反应参数为：63℃反应30～60min，并在80℃持续2min。
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