CN112342317A

CN112342317A - Ihhnv病毒lamp-crispr等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN112342317A
Application number: CN202011349245.7A
Authority: CN
Inventors: 黄�俊; 张徐俞; 杨稳; 付媛媛; 俞晓平; 郑晓叶; 朱凝瑜; 骆志成; 樊伟东
Original assignee: HANGZHOU ALLSHENG INSTRUMENTS CO Ltd; Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd
Current assignee: HANGZHOU ALLSHENG INSTRUMENTS CO Ltd; Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd; Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2021-02-09

Abstract

本发明公开了一种IHHNV病毒LAMP‑CRISPR等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法，该核酸序列组合包括用于LAMP检测的引物组、crRNA和探针。本发明检测方法包括采用所述核酸序列组合或者试剂盒对IHHNV病毒进行LAMP‑CRISPR等温检测；具体包括：(1)提取待检测样品的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用权利要求1中的引物组、crRNA和探针进行LAMP‑CRISPR等温扩增反应；(3)通过等温扩增仪对步骤(2)LAMP‑CRISPR等温扩增结果进行分析，出现扩增曲线为阳性，否则为阴性。本发明的试剂盒和检测方法操作简便快速，适合现场检测；特异性强；检测灵敏度高，可达到0.1ag/μL；准确率高、可靠性强，具有广泛的应用前景。

Description

IHHNV病毒LAMP-CRISPR等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及海洋水产养殖业的检测技术领域，尤其涉及一种IHHNV病毒LAMP-CRISPR等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法。

背景技术

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus，IHHNV)属于细小病毒科，病毒粒子直径约20nm左右，是无囊膜二十面体，内含单链DNA，该病毒能够感染外胚层组织，如鳃、表皮、前后肠上皮细胞、神经索和神经节，以及中胚层器官等部位，在宿主细胞核内形成包涵体。IHHNV可感染世界各地的养殖对虾，感染该病毒的虾苗会出现急性和慢性感染病症：(1)急性感染IHHNV的对虾最初表现为摄食明显减少、游动异常，病虾缓慢浮游至水面，静止不动，继而沉到池底，停止摄食和游动，一段时间后又上浮，一系列动作在几小时内不断重复，直至死亡，死亡率能高达90％；(2)慢性感染症状，表现为生长迟缓、畸形，出现慢性感染后30％以上的对虾生长缓慢，在整个养殖期无法长大，而受感染存活的对虾终生带毒，可通过垂直和水平传播，进一步感染其余虾群，从而造成重大的经济损失。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的检测方法是减少肠胞虫病发生和危害的重要途径。

目前，检测对虾是否感染对虾染性皮下及造血组织坏死病毒通常采用病理学显微镜观察、生化测定、免疫学试验、细胞培养和PCR等，这些方法耗时、耗力、操作复杂，很难适应当前快速、准确检测的需要。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件下完成核酸扩增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带，该技术在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应的特异性和缩短了检测时间；特别是它不需使用昂贵的热循环仪，凝胶电泳和紫外检测等设备，降低了成本，已广泛应用于病原微生物的检测。

例如：授权公告号为CN103484571B的发明专利公开了一种传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。该LAMP检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；检测方法为：(1)采用病毒DNA提取试剂盒提取样品DNA；(2)使用权利要求1所述的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP检测引物组，与环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶和样品DNA混合形成扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应，以阳性对照质控品和阴性对照质控品分别作为阳性对照和阴性对照；(3)扩增反应完成后，通过与阳性对照和阴性对照进行对比，判断样品扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物，来判断样品中是否含有对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒。但，上述LAMP检测引物组及检测方法的检测极限仅为1fg/反应，还有待进一步提高。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)技术和CRISPR基因编辑技术的出现为病原微生物的检测带来了一种更简便灵敏的检测方式，这是一种在恒温下可以快速检测的方法。然而，目前的现有技术中还未有针对对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoieticnecrosisvirus，IHHNV)的LAMP-CRISPR等温检测用核酸序列组合、试剂盒及方法。

发明内容

本发明针对现有技术中IHHNV病毒检测灵敏度低等问题，提供了一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)病毒LAMP-CRISPR等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法。

具体技术方案如下：

本发明首先提供了一种IHHNV病毒LAMP-CRISPR等温检测用的核酸序列组合，包括用于LAMP检测的引物组、crRNA和探针；

其中，引物组为：

IHHNV1-B3:GTGTCTGTAAATGTGAGAGTC；

IHHNV1-F3:TCTATGGTCTAAAGAGCAGC；

IHHNV1-BIP:GAAAGTACATAAAGCAGGCGTAGTTTTTTCAAATGATGTGCCTCCT；

IHHNV1-FIP:CATCCGTAGGTCTTCATCATTGATTTTTTGACAGTTCAGCAACAGAAAC；

IHHNV1-LB:GATGCACTCGATGGTACCC；

crRNA为：GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACUAUCGUUGUGUUUCUGUUGC；

探针为：Fam-TTATT-Bhq1。

本发明还提供了上述核酸序列组合在对IHHNV病毒进行LAMP-CRISPR等温检测中的应用。

本发明还提供了一种IHHNV病毒LAMP-CRISPR等温检测用的试剂盒，该试剂盒包括如上所述的核酸序列组合。

所述的试剂盒，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的表达载体，所述阴性对照为无核酸的超纯水。

所述的试剂盒，还包括用于LAMP等温扩增反应的Bst DNA聚合酶、dNTP、LAMP反应缓冲液、MgSO₄，以及用于CRISPR等温检测反应的Aapcas12b酶、RNA酶抑制剂、CRISPR反应缓冲液。

本发明还提供了上述试剂盒在对IHHNV病毒进行LAMP-CRISPR等温检测中的应用。

本发明还提供了一种对IHHNV病毒进行LAMP-CRISPR等温检测的方法，该方法采用如上所述的核酸序列组合或者如上所述的试剂盒对IHHNV病毒进行LAMP-CRISPR等温检测；

具体检测方法包括：

(1)提取待检测样品的DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用权利要求1中的引物组、crRNA和探针进行LAMP-CRISPR等温扩增反应；

(3)通过等温扩增仪对步骤(2)LAMP-CRISPR等温扩增结果进行分析，出现扩增曲线为阳性，否则为阴性。

进一步地，步骤(2)中，LAMP-CRISPR等温扩增反应体系为：25μl反应体系含有:10mM dNTP 3.5μL，10×ThermoPol反应缓冲液2.5μL，150mM MgSO₄水溶液1.5μL，Bst DNA聚合酶0.5μl，10μM IHHNV-F3 0.2μL，10μM IHHNV-B3 0.2μL，10μM IHHNV-FIP 0.8μL，10μMIHHNV-BIP 0.8μL，10μM IHHNV-LB 0.4μL；10X Aapcas12b Bufffer 2.5μl，10μMAapcas12b 1μl，10μM crRNA 2μl，5U/μL RNase inhibitor 1μl，10μM IHHNV-P 1μl，DNA模板2μL，余量为ddH₂O；待检DNA 1～100ng，用超纯水补齐到25μL。

步骤(2)中，LAMP-CRISPR等温扩增反应程序为：在等温扩增仪上60℃反应40min，并采集荧光信号。

现有技术中，LAMP-CRISPR等温扩增反应体系通常采用Fncas12a酶进行CRISPR等温检测，但该酶的最适温度仅为37℃，无法与63℃的LAMP等温扩增反应在同一试剂管中进行；本发明采用了更耐高温的Aapcas12b酶进行CRISPR等温检测，不仅不会影响检测效果，而且能够使得LAMP等温扩增反应和CRISPR等温检测在同一反应体系中进行，解决了上述问题。

上述检测方法的具体反应原理如下：首先，在60℃的反应温度下，采用LAMP等温扩增方法，依赖识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶(Bst酶)可高效、快速、高特异地扩增靶序列，使反应产物呈指数级增长；然后，利用Aapcas12b酶同样在60℃恒温条件下，在crRNA的引导下与目标序列结合后，便会切换为激活状态，高效的切割体系内其它的单链DNA；在体系内加入含有报告基团的单链DNA探针底物后，如果Aapcas12b识别到靶序列的存在，就会切割单链DNA探针底物从而释放荧光报告基团。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明

1)快速高效：整个过程仅需要40min；

2)操作简便：不需要复杂的仪器，仅需要60℃恒温荧光检测，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，条件比较温和；

3)高特异性：本发明设计的crRNA具有极高的特异性，且非常稳定，能有效的避免非特异性扩增而产生的假阳性；

4)高灵敏度：本发明的最低检测极限可达到0.1ag/μL；

5)鉴定简便：本发明可根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果；无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。

附图说明

图1为实施例1第5部分中IHHNV-crRNA筛选结合检测结果图。

图2为实施例1第6部分中实际样本检测的结果图。

图3为实施例1第7部分中引物特异性实验的结果图。

图4为实施例1第8部分中灵敏度实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

1、实验材料

样本1：编号ND01，采样于杭州某虾苗养殖厂；

样本2：编号HZ02，采样于杭州萧山某虾苗养殖厂；

样本3：编号HZ03，采样于杭州萧山某虾苗养殖厂；

样本4：编号FZ04，采样于福州虾苗某养殖厂；

样本5：编号FZ05，采样于福州虾苗某养殖厂；

样本6：编号FZ06，采样于福州虾苗某养殖厂。

2、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)DNA的提取

具体步骤为：

(1)称取30mg的实验样本，由于实际样本在70％无水乙醇中保存，因此需加入500μL的生理盐水进行清洗，颠倒混匀后去除液体，重复该步骤一次；

(2)将洗净的虾苗置于研磨管中，加入一颗研磨珠(直径8mm)，加入100μL的裂解液，放入均质仪中，以6m/s匀浆20s(或用牙签等捣碎)；

(3)再加入100μL的裂解液，并加入20μL的蛋白酶K，56℃温浴1h；

(4)加入200μL的结合液，70℃下放置10min；

(5)加入200μL的无水乙醇，颠倒混匀后加入吸附柱中，12000rpm离心30s；

(6)倒掉废液，向吸附柱中加入500μL的盐洗液，12000rpm离心30s；

(7)倒掉废液，向吸附柱中加入600μL的漂洗液，12000rpm离心30s；

(8)重复步骤7；

(9)彻底晾干漂洗液，加入100μLTE Buffer，离心，得到传染性皮下及造血组织坏死病毒DNA。

3、LAMP引物、试剂盒及LAMP-CRISPR检测方法

3.1LAMP引物设计

通过http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/primer.html该网站进行引物设计，获得一组LAMP引物组，其核苷酸序列如下所示：

IHHNV1-B3:5’-GTGTCTGTAAATGTGAGAGTC-3’(SEQ ID NO.2)；

IHHNV1-F3:5’-TCTATGGTCTAAAGAGCAGC-3’(SEQ ID NO.3)；

IHHNV1-BIP:5’-GAAAGTACATAAAGCAGGCGTAGTTTTTTCAAATGATGTGCCTCCT-3’(SEQID NO.4)；

IHHNV1-FIP:5’-CATCCGTAGGTCTTCATCATTGATTTTTTGACAGTTCAGCAACAGAAAC-3’(SEQ ID NO.5)；

IHHNV1-LB:5’-GATGCACTCGATGGTACCC-3’(SEQ ID NO.6)。

3.2IHHNV-crRNA的制备

3.2.1引物合成：

根据等温扩增产物序列设计特异性的IHHNV-crRNA引物，引物如下：

引物1：

F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGGTCTAGAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCTCAAATCTGAGAAGTGGCACCACAACGATATAAGATGG-3’(SEQ IDNO.7)；

R：5’-CCATCTTATATCGTTGTGGTGCCACTTCTCAGATTTGAGAAGCTCAACGGGCTTTGCCACCTGGAAAGTGCCATTGGCACACCCGTTGAAAAATTCTGTCCTCTAGACCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’(SEQ IDNO.8)；

引物2：

F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGGTCTAGAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCTCAAATCTGAGAAGTGGCACGCAACAGAAACACAACGATA-3’(SEQ IDNO.9)；

R：5’-TATCGTTGTGTTTCTGTTGCGTGCCACTTCTCAGATTTGAGAAGCTCAACGGGCTTTGCCACCTGGAAAGTGCCATTGGCACACCCGTTGAAAAATTCTGTCCTCTAGACCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’(SEQ IDNO.10)；

引物3：

F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGGTCTAGAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCTCAAATCTGAGAAGTGGCACTCATTGATGAAGACCTACGGATG-3’(SEQID NO.11)；

R：5’-CATCCGTAGGTCTTCATCAATGAGTGCCACTTCTCAGATTTGAGAAGCTCAACGGGCTTTGCCACCTGGAAAGTGCCATTGGCACACCCGTTGAAAAATTCTGTCCTCTAGACCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’(SEQID NO.12)。

3.2.2双链DNA的合成

以等温扩增产物序列为模板，利用上述IHHNV-crRNA引物进行扩增反应，反应体系的试剂配制和扩增程序如表1：

表1试剂配制：

试剂名称	体积(50μL)
		10×Buffer(without Mgcl2)	5μL
引物F(100μM)	5μL
		引物R(100μM)	5μL
水	35μL

程序：99℃10min；85℃，5min；80℃，5min；75℃，5min；70℃，5min；将扩增产物(双链DNA)切胶回收。

3.2.3转录和纯化RNA

对3.2.2扩增得到的双链DNA进行转录和RNA的纯化，转录所用试剂和转录试剂如表2：

表2转录试剂配制:

其中，转录试剂盒购于南京诺唯赞(货号：TR101)

程序：37℃6h，结束后加入DNaseI，37℃消化15min，去除模板DNA。

2、RNA纯化(天根RNA纯化试剂盒(货号：DP412))：

(1)将未纯化的RNA产物用RNase-Free ddH2O补足至100μL，然后加入350μL的PK溶液；

(2)混匀后加入250μL无水乙醇；

将混合物加入至纯化柱中，12000rpm离心30s，弃废液；

(3)向管中加入500μL的漂洗液，室温放置2min，12000rpm离心30s，弃废液；

(4)重复上述步骤；

(5)加入14-20μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min；

(6)转录产物置于-80℃冰箱保存备用。

3.3重组酶聚合酶等温扩增反应

采用3.1的LAMP引物和3.2制备的IHHNV-crRNA引物进行重组酶聚合酶等温扩增反应，反应体系如下表3所示(总体积25μL)。

表3

试剂成分	试剂量
		dNTP(10μM)	3.5μL
10×Buffer	2.5μL
		MgSO4(150mM)	1.5μL
Bst酶	0.5μL
		IHHNV-FIP(10μM)	0.8μL
IHHNV-BIP(10μM)	0.8μL
		IHHNV-LB(10μM)	0.4μL
IHHNV-F3(10μM)	0.2μL
		IHHNV-B3(10μM)	0.2μL
IHHNV-P(10μM)	1μL
		AapCas12b	1μL
crRNA	2μL
		DNA模板	2μL
ddH<sub>2</sub>O	Up to 25μL

混匀后在60℃放置40min。

AapCas12b酶购自广州美格生物科技有限公司

4、荧光检测的方法和结果

检测方法：

将配制好的反应管离心，置于ABI Step One仪器中，设置程序，程序如下：

检测结果：

根据实验结果，出现扩增曲线的为阳性，无扩增曲线的则为阴性，实际样本出现了扩增曲线，而阴性对照未出现扩增(如图1所示)。

5、IHHNV-crRNA筛选

检测方法：分别对四组IHHNV-crRNA进行筛选，选择最优的crRNA引物组。

检测结果：实验结果表明，最优的IHHNV-crRNA引物为IHHNV-crRNA-2组引物(如图1所示)，其crRNA序列为：5’-GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACGCAACAGAAACACAACGAUA-3’(SEQ ID NO.13)。

6、实际样本检测

分别提取样本1：编号ND01，样本2：编号HZ02，样本3：编号HZ03，样本4：编号FZ04，样本5：编号FZ05，样本6：编号FZ06的DNA，采用LAMP-CRISPR检测方法对样本中的传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)进行检测，检测结果与水产所提供的国标法检测结果进行对比。

结果显示，LAMP-CRISPR法共检出阳性标本6份(如图2)；水产所提供的国标法检测结果也为阳性标本6份，证明2种方法的检测效果一致。

7、引物特异性实验

为检测本试剂盒的引物特异性，采用上述LAMP-CRISPR等温扩增检测方法，分别对病毒WSSV、IHHNV、EHP、SHIV进行检测，分析本试剂盒对对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒和对虾其他常见病毒的检测情况。

检测结果：检测结果表明，仅对虾肝肠胞虫样品出现扩增曲线，阴性对照(超纯水)及病毒WSSV、EHP、SHIV样品均未出现扩增(如图3所示)。上述实验结果说明，本LAMP-CRISPR等温扩增检测试剂盒能特异性扩增检测出对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)中的靶序列，而不与其它病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阳性。

8、灵敏度实验

检测方法：提取阳性质粒(含有靶序列片段的T载体)，通过NanoDrop One对阳性质粒进行定量，并将其分别稀释到1pg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL、0.1ag/μL。采用上述LAMP-CRISPR检测方法，对稀释后的各浓度阳性质粒进行扩增检测。

检测结果：检测结果如图4所示，从左到右的曲线依次为1pg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL、0.1ag/μL的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的CRISPR试剂盒检测的灵敏度可达0.1ag/μL，精确性优于普通PCR检测方法，表明本发明的LAMP-CRISPR检测试剂盒和检测方法对对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的诊断具有高度的灵敏性。

序列表

<110> 杭州奥盛仪器有限公司

浙江科技学院

<120> IHHNV病毒LAMP-CRISPR等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus)

<400> 1

tcgacggaaa aatttatact gcctcccact acattggatg aacttatatc tctatggtct 60

aaagagcagc gacagttcag caacagaaac acaacgatat aagatggtaa aatcattgat 120

gaagacctac ggatggaaag tacataaagc aggcgtagtg atgcactcaa tggtacccct 180

tatgaaagac ttgaaagtat caggaggcac atcatttgag actctcacat ttacagacac 240

cccatattta gaaatattta aggatactac tggactacat aatcaactat caactaagga 300

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgtctgtaa atgtgagagt c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctatggtct aaagagcagc 20

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaagtacat aaagcaggcg tagttttttc aaatgatgtg cctcct 46

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catccgtagg tcttcatcat tgattttttg acagttcagc aacagaaac 49

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatgcactcg atggtaccc 19

<210> 7

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taatacgact cactataggg gtctagagga cagaattttt caacgggtgt gccaatggca 60

ctttccaggt ggcaaagccc gttgagcttc tcaaatctga gaagtggcac cacaacgata 120

taagatgg 128

<210> 8

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccatcttata tcgttgtggt gccacttctc agatttgaga agctcaacgg gctttgccac 60

ctggaaagtg ccattggcac acccgttgaa aaattctgtc ctctagaccc ctatagtgag 120

tcgtatta 128

<210> 9

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taatacgact cactataggg gtctagagga cagaattttt caacgggtgt gccaatggca 60

ctttccaggt ggcaaagccc gttgagcttc tcaaatctga gaagtggcac gcaacagaaa 120

cacaacgata 130

<210> 10

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tatcgttgtg tttctgttgc gtgccacttc tcagatttga gaagctcaac gggctttgcc 60

acctggaaag tgccattggc acacccgttg aaaaattctg tcctctagac ccctatagtg 120

agtcgtatta 130

<210> 11

<211> 133

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taatacgact cactataggg gtctagagga cagaattttt caacgggtgt gccaatggca 60

ctttccaggt ggcaaagccc gttgagcttc tcaaatctga gaagtggcac tcattgatga 120

agacctacgg atg 133

<210> 12

<211> 133

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

catccgtagg tcttcatcaa tgagtgccac ttctcagatt tgagaagctc aacgggcttt 60

gccacctgga aagtgccatt ggcacacccg ttgaaaaatt ctgtcctcta gacccctata 120

gtgagtcgta tta 133

<210> 13

<211> 110

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gucuagagga cagaauuuuu caacgggugu gccaauggca cuuuccaggu ggcaaagccc 60

guugagcuuc ucaaaucuga gaaguggcac gcaacagaaa cacaacgaua 110

Claims

1.一种IHHNV病毒LAMP-CRISPR等温检测用的核酸序列组合，包括用于LAMP检测的引物组、crRNA和探针；

其中，引物组为：

IHHNV1-B3:GTGTCTGTAAATGTGAGAGTC；

IHHNV1-F3:TCTATGGTCTAAAGAGCAGC；

IHHNV1-BIP:GAAAGTACATAAAGCAGGCGTAGTTTTTTCAAATGATGTGCCTCCT；

IHHNV1-FIP:CATCCGTAGGTCTTCATCATTGATTTTTTGACAGTTCAGCAACAGAAAC；

IHHNV1-LB:GATGCACTCGATGGTACCC；

探针为：Fam-TTATT-Bhq1。

2.如权利要求1所述的IHHNV病毒LAMP-CRISPR等温检测用的核酸序列组合在对IHHNV病毒进行LAMP-CRISPR等温检测中的应用。

3.一种IHHNV病毒LAMP-CRISPR等温检测用的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的核酸序列组合。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的表达载体，所述阴性对照为无核酸的超纯水。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于LAMP等温扩增反应的Bst DNA聚合酶、dNTP、LAMP反应缓冲液、MgSO₄，以及用于CRISPR等温检测反应的Aapcas12b酶、RNA酶抑制剂、CRISPR反应缓冲液。

6.如权利要求3～5任一项所述的IHHNV病毒LAMP-CRISPR等温检测用的试剂盒在对IHHNV病毒进行LAMP-CRISPR等温检测中的应用。

7.一种对IHHNV病毒进行LAMP-CRISPR等温检测的方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的核酸序列组合或者如权利要求3～5任一所述的试剂盒对IHHNV病毒进行LAMP-CRISPR等温检测；

具体检测方法包括：

(1)提取待检测样品的DNA；

8.如权利要求7所述的对IHHNV病毒进行LAMP-CRISPR等温检测的方法，其特征在于，步骤(2)中，LAMP-CRISPR等温扩增反应体系为：25μl反应体系含有:10mM dNTP 3.5μL，10×ThermoPol反应缓冲液2.5μL，150mM MgSO₄水溶液1.5μL，Bst DNA聚合酶0.5μl，10μMIHHNV-F3 0.2μL，10μM IHHNV-B3 0.2μL，10μM IHHNV-FIP 0.8μL，10μM IHHNV-BIP 0.8μL，10μM IHHNV-LB 0.4μL；10X Aapcas12b Bufffer 2.5μl，10μM Aapcas12b 1μl，10μM crRNA2μl，5U/μL RNase inhibitor 1μl，10μM IHHNV-P 1μl，DNA模板2μL，余量为ddH₂O；待检DNA1～100ng，用超纯水补齐到25μL。

9.如权利要求7所述的对IHHNV病毒进行LAMP-CRISPR等温检测的方法，其特征在于，步骤(2)中，LAMP-CRISPR等温扩增反应程序为：在等温扩增仪上60℃反应40min，并采集荧光信号。