CN106636471A - 同时检测对虾wssv、ahpnd、ehp、ihhnv的多重pcr检测方法和试剂盒 - Google Patents

同时检测对虾wssv、ahpnd、ehp、ihhnv的多重pcr检测方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于海洋生物病原检测技术领域，具体涉及一种同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测方法和试剂盒。采用多重PCR检测方法，能够一次性同时利用WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的专用检测引物WSSV‑F和WSSV‑R、AHPND‑F和AHPND‑R、EHP‑F和EHP‑R、IHHNV‑F和IHHNV‑R进行四种病原DNA的扩增。本发明是一种方便快捷，检测限低，且特异性强、灵敏度高、准确率高、且能同时检测对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR检测方法。

Description

同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测方法和 试剂盒
技术领域
本发明属于海洋生物病原检测技术领域，具体涉及一种同时检测对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、对虾急性肝胰腺坏死症(Acutehepatopancreatic necrosis disease，AHPND)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus,IHHNV)的多重PCR检测方法和试剂盒。
背景技术
对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)一直是引起对虾病毒病暴发流行的主要病毒。世界动物卫生组织(OIE)将此两种病划为须向其申报的甲壳类重要疾病。对虾急性肝胰腺坏死症(Acute hepatopancreatic necrosisdisease，AHPND)和虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是现阶段养殖对虾特别是南美白对虾的最大威胁，是对虾养殖过程中两种新发疫病，前者导致虾苗大量的死亡，后者导致对虾生长缓慢，参差不齐，甚至生长停滞。
目前，对虾病害种类较多，诊断手段主要包括病理学和生物学方法、免疫诊断法、分子杂交及PCR技术。已建立的常规PCR技术，常是一次只能检测一种病原，比较费时间。而多重PCR技术是一种特殊的PCR方法，在一个反应体系中加入多对病原特异性引物，能够同时检测多种病原体，从而缩短病原检测的周期，提高检测效率。但多重PCR检测也受多种因素的影响，比如DNA聚合酶的活性、模板的质量、所设计的病原引物的特异性、PCR反应条件、不同病原样本间对试剂的竞争等因素都会影响检测结果的敏感性和准确性。
基于当前现状，需建立一种准确、快速、简便的对虾病原检测方法，以利于对病原的早期诊断，便于及时采取有效的防治措施。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方便快捷，检测限低，且特异性强、灵敏度高、准确率高、且能同时检测对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR检测方法。
为实现上述目的，本发明提供一种同时检测对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR引物，所述引物分别为WSSV-F和WSSV-R、AHPND-F和AHPND-R、EHP-F和EHP-R、IHHNV-F和 IHHNV-R，序列如SEQ ID NO:1和2，SEQ IDNO:3和4，SEQ ID NO:5和6，SEQ ID NO:7和8所示。
还提供一种同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测试剂盒，包括WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的专用检测引物WSSV-F和WSSV-R、AHPND-F和AHPND-R、EHP-F和EHP-R、IHHNV-F和IHHNV-R、阳性对照品、阴性对照品、DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、Mg2+、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水；WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的专用检测引物WSSV-F和WSSV-R、AHPND-F和AHPND-R、EHP-F和EHP-R、IHHNV-F和IHHNV-R，序列如SEQ ID NO:1和2，SEQ IDNO:3和4，SEQ ID NO:5和6，SEQ ID NO:7和8所示，阳性对照品为SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列混合作为模板；阴性对照为：不含有对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒任一病原的任意DNA核酸序列。
同时，提供一种同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)提取DNA：
取疑似对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒发病对虾鳃和内脏组织，提取病原核酸DNA备用；
采用上述多重PCR专用检测引物；阳性对照为SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列混合作为模板，阴性对照为：不含有对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒任一病原的任意DNA核酸序列；
(2)多重PCR扩增：
提取好待检测的DNA模板，同时按照PCR检测的PCR反应体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品进行扩增；将各反应管放入PCR仪的反应槽内，设定多重PCR仪反应程序，进行多重PCR反应；
扩增产物检测与分析：1.5％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并成像分析；
(3)结果判定：
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，约为1189bp时，结果为对虾白斑综合征病毒阳性；如果没有1189条带，则为对虾白斑综合征病毒阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，约为719bp时，结果为对虾急性肝胰腺 坏死症阳性；如果没有719条带，则为对虾急性肝胰腺坏死症阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，约为512bp时，结果为虾肝肠胞虫阳性；如果没有512bp条带，则为虾肝肠胞虫阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，约为244bp时，结果为传染性皮下及造血组织坏死病毒阳性；如果没有244bp条带，则为传染性皮下及造血组织坏死病毒阴性；
当阴性对照出现条带时，表明操作过程中有试剂污染，检测结果无效；
当阳性对照无条带时，表明引物或者试剂盒中相关试剂降解，引物或试剂盒失效。
进一步的，所述步骤(1)提取病原核酸DNA的步骤为：取疑似对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒发病对虾鳃和内脏组织组织0.05-0.15g，加入400μL裂解液研磨均匀，加入蛋白酶K，终浓度为100μg/ml，震荡混匀后于55℃温育1-2h；
在反应液中加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇混匀，去除残余蛋白，10000r/min离心10min后取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇混匀，10000r/min离心10min，转移上层水相，加入1/10体积3mol/L乙酸钠，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，12000r/min离心5min，沉淀用75％冷乙醇洗涤2次，室温晾干后加入50μL TE，于-20℃保存备用。
进一步的，所述裂解液组成为15mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl,10mmol/LEDTA,1％SDS。
进一步的，所述步骤(2)中PCR检测的PCR反应体系为：50μL反应体系中包含有10倍浓度的含镁离子的Taq DNA聚合酶缓冲液5μL，Taq DNA聚合酶1μL，各引物终浓度为0.4μM，提取好待检测的DNA模板2μL。
进一步的，所述步骤(2)设定多重PCR反应条件为：95℃4分钟，1个循环；95℃1分钟，58.5℃1分钟，72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟，1个循环；4℃保存。
本发明根据对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、对虾急性肝胰腺坏死症(Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectioushypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)核酸序列，分别设计用于检测对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒的特异性引物。本发明通过对所设计的引物进行实验筛选，筛选出一组同时对对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒具有非常高的灵敏性和特异性的引物，引物序列如下：
对虾白斑综合征病毒
上游引物：WSSV-F：TTCTCACCTCATGCTTTCTTCC SEQ ID NO:1
下游引物：WSSV-R：TACTTGCTTAGAGATGGCTTCG SEQ ID NO:2
对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)
上游引物：AHPND-F：GGAAGTCGGTCGTAGTGTAG SEQ ID NO:3
下游引物：AHPND-R：ATATCGCATAACCAAGCCATTC SEQ ID NO:4
虾肝肠胞虫
上游引物：EHP-F：GAGAGTAGCGGAACGGATAG SEQ ID NO:5
下游引物：EHP-R：GCATCACGGACCTGTTATTG SEQ ID NO:6
传染性皮下及造血组织坏死病毒
上游引物：IHHNV-F：AAGAGCAGCGACAGTTCAG SEQ ID NO:7
下游引物：IHHNV-R：CGGCTTCCTTAGTTGATAGTTG SEQ ID NO:8
阳性质控品
阳性质控品：包括对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒的核酸DNA。分别为人工合成含有上述引物扩增目的片段的如下序列：
WSSV：TTCTCACCTCATGCTTTCTTCCATGGATTCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAACATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGCTTCTTCAAGAACATTGAACGATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCCATGTCCCACAAGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCAGATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTCCATGGAAGAAATTAGAGCCACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTGACAAACATTACGTGATGAACATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAACAGGATCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGGACTGAAATGAGAATGAACTCCAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTCTCCAACTCTGGCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAATGCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCACCGCCGACGCCAAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGGCAACCGATGGAAACGGTAACGAATCTGAACTGATCCAGAATGCTCTGCCAAGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGAACGCTCAAACTGTCGTGTTTGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTATCGTGAACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAAAACACCAAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATCTAATAATAATGGAGGAGTA GAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAACATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTCAGAAGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGAAAATGTACCATTCGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAAGGGAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTATCCTCTACCTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGCTCGAGTTTTCGAAGCCATCTCTAAGCAAGTA(SEQ ID NO:9)；
AHPND(pirVP)：
GGAAGTCGGTCGTAGTGTAGACATTGAGAATACGGGACGTGGGGAGCTTACCATTCAATACCAATGGGGTGCGCCATTTATGGCTGGCGGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATGTGGTACAACGTGATGAAACTTACCATTTACAACGCCCTGATAATGCATTCTATCATCAGCGTATTGTTGTAATTAACAATGGCGCTAGTCGTGGTTTCTGTACAATCTATTACCACTAAGAAGGTGCTCACATGACTAACGAATACGTTGTAACAATGTCATCTTTGACGGAATTTAACCCTAACAATGCTCGTAAAAGTTATTTATTTGATAACTATGAAGTTGATCCTAACTATGCTTTCAAAGCAATGGTTTCATTTGGTCTTTCAAATATTCCTTACGCGGGTGGTTTTTTATCAACGTTATGGAATATCTTTTGGCCAAATACGCCAAATGAGCCAGATATTGAAAACATTTGGGAACAATTACGTGACAGAATCCAAGATTTAGTAGATGAATCGATTATAGATGCCATCAATGGAATATTGGATAGCAAAATCAAAGAGACACGCGATAAAATTCAAGACATTAATGAGACTATCGAAAACTTCGGTTATGCTGCGGCAAAAGATGATTACATTGGTTTAGTTACTCATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGCGAGCTAGACGGTGATGAATGGCTTGGTTATGCGATAT(SEQ ID NO:10)
EHP：
GAGAGTAGCGGAACGGATAGGGAGCATGGTATAGGTGGGCAAAGAATGAAATCTCAAGACCCCACCTGGACCAACGGAGGCGAAAGCGATGCTCTTAGACGTATCTGGGGATCAAGGACGAAGGCTAGAGTATCGAAAGTGATTAGACACCGCTGTAGTTCTAGCAGTAAACTATGCCGACAATGCTGGGTGTTGCGAGAGCGATGCTTGGTGTGGGAGAAATCTTAGTTTTCGGGCTCTGGGGATAGTACGCTCGCAAGGGTGAAACTTAAAGCGAAATTGACGGAAGGACACTACCAGGAGTGGATTGTGCTGCTTAATTTAACTCAACGCGGGAAAACTTACCAGGGTCAAGTCTATCGTAGATTGGAGACATGAGGTAGACAAGAGTGGTGCATGGCCGTTGGAAATTGATGGGGCGACTTTTAGCTTAAGTGCTGGAACCAGTGAGATCTTCTAGACAGGTGTTATTTAGGCACAGGAGGGAGAAGGCAATAACAGGTCCGTGATGC(SEQ ID NO:11)
IHHNV：
AAGAGCAGCGACAGTTCAGCAACAGAAACACAACGATATAAGATGGTAAAATCAATGATGAAGACCTACGGATGGAAAGTACATAAAGCAGGCGTAGTGATGCACTCGATGGTACCCCTTATGAAAGACTTAAAAGTATCAGGAGGCACATCATTTGAGACTCTCACATTTACAGACACCCCATATTTAGAAATATTTAAGGATACTACTGGACTACATAATCAACTATCAACTAAGGAAGCCG(SEQ ID NO:12)
本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供了一种依赖于PCR的分子检测试剂盒及检测方法，为对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒的同时检测提供一种快速、简便、准确的检测方法及试剂盒。通过对引物的设计与筛选，使得检测的灵敏度更高，特异性更好。检测限低至10拷贝/μL，提高了检测水平。所建立的多重PCR体系可重复性好，稳定性强。该试剂盒为对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测提供更有效的检测方法，具有广泛的应用前景。
(2)本发明所选的4种对虾病原引物均是对应4种病原的专用检测引物，特异性强。是本发明的申请人经大量的试验验证后，筛选出的4对具有非常高的特异性的引物，具有非常好的敏感性，检测限低。高通量、低成本、高效率。
(3)本发明所涉及的4种病原包括世界各地的病原株，各自都有多种不同的病原株，一种病原的不同病原株的基因序列有的很保守，有的变异性比较大。并且不同病原之间还存在交叉反应，在综合比对这些病原株的序列后，申请人选择了一种病原不同病原株之间保守性好的序列，从而能够确保检测出这种病原的不同病原株。因此本发明在设计引物时，考虑到一种病原与其他病原的基因之间的序列差别，使得在检测时，假阳性率低。避免与其他病原发生交叉，申请人设计了很多对引物，再进行大量的试验验证，从而筛选出用于本发明的这4对引物。这4对病原引物彼此间无交叉，且不与其它病原产生交叉，假阳性率低，能够特异性的检测出分布于世界各地不同地区的4种病原的病原株，具有非常好的特异性，广泛适用性和实用性。
(4)本发明对检测的病原基因片段无需再进行克隆、测序和序列比对。一次实验即可检测出待测样品中是否含有这4种病原中的一种、两种、三种或四种。克服了以往单一检测的操作繁琐、灵敏度低、适用性低等诸多限制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技 术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为多重PCR体系中对虾白斑综合征病毒检测的敏感性实验结果图；
图2为多重PCR体系中对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)检测的敏感性实验结果图；
图3为多重PCR体系中虾肝肠胞虫检测的敏感性实验结果图；
图4为多重PCR体系中传染性皮下及造血组织坏死病毒检测的敏感性实验结果图；
图5为多重PCR体系中4种对虾病原混合检测的敏感性实验图；
图6为多重PCR体系中分别检测1中，2种，3种，4种对虾病原实验结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
检测对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒试验
1)试剂
10×Taq Buffer：Tris-HCl 100mM，KCl 500mM，MgCl220mM，dNTPs 2mM，Taq酶1U/μL；
引物：WSSPV-F、WSSV-R、AHPND-F、AHPND-R、EHP-F、EHP-R、IHHNV-F、IHHNV-R各10μM，纯水，阳性质控品DNA10μg/ml；
本发明根据对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、对虾急性肝胰腺坏死症(Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectioushypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)的核酸序列，分别设计用于检测对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒的特异性引物。本发明通过对所设计的引物进行实验筛选，筛选出一组同时对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒具有非常高的灵敏性和特异性的引物，引物序列如下：
对虾白斑综合征病毒
上游引物：WSSV-F：TTCTCACCTCATGCTTTCTTCC SEQ ID NO:1
下游引物：WSSV-R：TACTTGCTTAGAGATGGCTTCG SEQ ID NO:2
对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)
上游引物：AHPND-F：GGAAGTCGGTCGTAGTGTAG SEQ ID NO:3
下游引物：AHPND-R：ATATCGCATAACCAAGCCATTC SEQ ID NO:4
虾肝肠胞虫
上游引物：EHP-F：GAGAGTAGCGGAACGGATAG SEQ ID NO:5
下游引物：EHP-R：GCATCACGGACCTGTTATTG SEQ ID NO:6
传染性皮下及造血组织坏死病毒
上游引物：IHHNV-F：AAGAGCAGCGACAGTTCAG SEQ ID NO:7
下游引物：IHHNV-R：CGGCTTCCTTAGTTGATAGTTG SEQ ID NO:8
阳性质控品：包括对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒的核酸DNA。分别为人工合成(生工生物工程(上海)股份有限公司，以下均同此)含有上述引物扩增目的片段的如下序列：
WSSV：TTCTCACCTCATGCTTTCTTCCATGGATTCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAACATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGCTTCTTCAAGAACATTGAACGATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCCATGTCCCACAAGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCAGATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTCCATGGAAGAAATTAGAGCCACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTGACAAACATTACGTGATGAACATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAACAGGATCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGGACTGAAATGAGAATGAACTCCAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTCTCCAACTCTGGCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAATGCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCACCGCCGACGCCAAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGGCAACCGATGGAAACGGTAACGAATCTGAACTGATCCAGAATGCTCTGCCAAGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGAACGCTCAAACTGTCGTGTTTGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTATCGTGAACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAAAACACCAAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATCTAATAATAATGGAGGAGTAGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAACATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTCAGAAGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGAAAATGTACCATTCGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAAGGGAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTATCCTCTACCTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGCTCGAGTTTTCGAAGCCATCTCTAAGCAAGTA
AHPND：
GGAAGTCGGTCGTAGTGTAGACATTGAGAATACGGGACGTGGGGAGCTTACCATTCAATACCAATGGGGTGCGCCATTTATGGCTGGCGGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATGTGGTACAACGTGATGAAACTTACCATTTACAACGCCCTGATAATGCATTCTATCATCAGCGTATTGTTGTAATTAACAATGGCGCTAGTCGTGGTTTCTGTACAATCTATTACCACTAAGAAGGTGCTCACATGACTAACGAATACGTTGTAACAATGTCATCTTTGACGGAATTTAACCCTAACAATGCTCGTAAAAGTTATTTATTTGATAACTATGAAGTTGATCCTAACTATGCTTTCAAAGCAATGGTTTCATTTGGTCTTTCAAATATTCCTTACGCGGGTGGTTTTTTATCAACGTTATGGAATATCTTTTGGCCAAATACGCCAAATGAGCCAGATATTGAAAACATTTGGGAACAATTACGTGACAGAATCCAAGATTTAGTAGATGAATCGATTATAGATGCCATCAATGGAATATTGGATAGCAAAATCAAAGAGACACGCGATAAAATTCAAGACATTAATGAGACTATCGAAAACTTCGGTTATGCTGCGGCAAAAGATGATTACATTGGTTTAGTTACTCATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGCGAGCTAGACGGTGATGAATGGCTTGGTTATGCGATAT
EHP：
GAGAGTAGCGGAACGGATAGGGAGCATGGTATAGGTGGGCAAAGAATGAAATCTCAAGACCCCACCTGGACCAACGGAGGCGAAAGCGATGCTCTTAGACGTATCTGGGGATCAAGGACGAAGGCTAGAGTATCGAAAGTGATTAGACACCGCTGTAGTTCTAGCAGTAAACTATGCCGACAATGCTGGGTGTTGCGAGAGCGATGCTTGGTGTGGGAGAAATCTTAGTTTTCGGGCTCTGGGGATAGTACGCTCGCAAGGGTGAAACTTAAAGCGAAATTGACGGAAGGACACTACCAGGAGTGGATTGTGCTGCTTAATTTAACTCAACGCGGGAAAACTTACCAGGGTCAAGTCTATCGTAGATTGGAGACATGAGGTAGACAAGAGTGGTGCATGGCCGTTGGAAATTGATGGGGCGACTTTTAGCTTAAGTGCTGGAACCAGTGAGATCTTCTAGACAGGTGTTATTTAGGCACAGGAGGGAGAAGGCAATAACAGGTCCGTGATGC
IHHNV：
AAGAGCAGCGACAGTTCAGCAACAGAAACACAACGATATAAGATGGTAAAATCAATGATGAAGACCTACGGATGGAAAGTACATAAAGCAGGCGTAGTGATGCACTCGATGGTACCCCTTATGAAAGACTTAAAAGTATCAGGAGGCACATCATTTGAGACTCTCACATTT ACAGACACCCCATATTTAGAAATATTTAAGGATACTACTGGACTACATAATCAACTATCAACTAAGGAAGCCG
阴性质控品：不含WSSV、AHPND(PirVP)、EHP或IHHNV这四种病病原的任何DNA质粒。
以上四种病原核酸片段分别转入载体后，挑取阳性克隆菌落培养并提取质粒测其浓度后作为阳性质控品。
一种同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测试剂盒，包括WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的专用检测引物WSSV-F和WSSV-R、AHPND-F和AHPND-R、EHP-F和EHP-R、IHHNV-F和IHHNV-R、阳性对照品、阴性对照品、DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、Mg2+、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水；WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的专用检测引物WSSV-F和WSSV-R、AHPND-F和AHPND-R、EHP-F和EHP-R、IHHNV-F和IHHNV-R；
阳性对照品为SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列混合作为模板；
阴性对照为：不含有对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒任一病原的任意DNA核酸序列。
检测方法及步骤：
病原核酸DNA的提取：
取疑似对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒发病对虾鳃和内脏组织约0.1g，加入400μL裂解液(15mmol/L NaCl,10mmol/LTris-HCl,10mmol/L EDTA,1％SDS,pH8.0)研磨均匀，加入蛋白酶K，终浓度为100μg/ml，震荡混匀后于55℃温育1-2h。在反应液中加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25:24:1)混匀，去除残余蛋白，10000r/min离心10min后取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇(24:1)混匀，10000r/min离心10min，转移上层水相，加入1/10体积3mol/L乙酸钠(pH 5.2)，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，12000r/min离心5min，沉淀用75％冷乙醇洗涤2次，室温晾干后加入50μL TE，于-20℃保存备用。
多重PCR扩增：
所述的多重PCR反应体系为50μL，反应体系中包含有10倍浓度的含镁离子的TaqDNA聚合酶缓冲液5μL，Taq DNA聚合酶1μL，各引物终浓度为0.4μM，提取好待检测的DNA模板2μL，纯水补足至50μL，同时按上述体系设置阳性和阴性对照，加 入阳性质控品或阴性质控品1μL进行扩增。
将各反应管放入PCR仪的反应槽内，设定多重PCR仪反应程序，进行多重PCR反应。以检测所检测的对虾是否感染对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒。
设定多重PCR反应条件为：95℃4分钟，1个循环；95℃1分钟，58.5℃1分钟，72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟，1个循环；4℃保存。
扩增产物检测与分析：1.5％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并成像分析。
结果判定：
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，约为1189bp时，结果为对虾白斑综合征病毒阳性；如果没有1189条带，则为对虾白斑综合征病毒阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，约为719bp时，结果为对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)阳性；如果没有719条带，则为对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，约为512bp时，结果为虾肝肠胞虫阳性；如果没有512bp条带，则为虾肝肠胞虫阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，约为244bp时，结果为传染性皮下及造血组织坏死病毒阳性；如果没有244bp条带，则为传染性皮下及造血组织坏死病毒阴性；
当阴性对照出现条带时，表明操作过程中有试剂污染，检测结果无效；
当阳性对照无条带时，表明引物或者试剂盒中相关试剂降解，引物或试剂盒失效。
同时检测对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR检测引物、试剂盒及检测方法作进一步的效果检测。
一、敏感性实验
将上述人工合成的阳性质控品进行稀释，依次稀释为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL，分别作为多重PCR模板进行敏感性实验。结果见图1-5。
图1为多重PCR体系中对虾肝胰腺细小病毒检测的敏感性实验结果图。其中M为Takara DL2000 DNA Marker，1-8为阳性标准品(从1到8依次为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL)，9为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-8均有约1189bp清晰的PCR扩增条带，对虾白斑综合征病毒检测灵敏度达1×101拷贝/μL。
图2为多重PCR体系中对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)检测的敏感性实验结果图。其中M为Takara DL2000 DNA Marker，1-8为阳性标准品(从1到8依次为1×108、1×107、1 ×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL)，9为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-8均有约719bp清晰的PCR扩增条带，对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)检测灵敏度达1×101拷贝/μL。
图3为多重PCR体系中虾肝肠胞虫检测的敏感性实验结果图。其中M为TakaraDL2000 DNA Marker，1-8为阳性标准品(从1到8依次为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL)，9为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-8均有约512bp清晰的PCR扩增条带，虾肝肠胞虫检测灵敏度达1×101拷贝/μL。
图4为多重PCR体系中传染性皮下及造血组织坏死病毒检测的敏感性实验结果图。其中M为Takara DL2000 DNA Marker，1-8为阳性标准品(从1到8依次为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL)，9为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-8均有约244bp清晰的PCR扩增条带，传染性皮下及造血组织坏死病毒检测灵敏度达1×101拷贝/μL。
图5为多重PCR体系中4种对虾病原混合检测的敏感性实验结果图。其中M为TakaraDL2000 DNA Marker，1-5为阳性标准品(从1到5依次为1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL)，6为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-5均有约1189bp、719bp、512bp、244bp清晰的PCR扩增条带，再次证明对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒检测灵敏度达1×101拷贝/μL。综上所述，可以得出采用本发明的引物及试剂盒，对虾白斑综合征病毒检测灵敏度达1×101拷贝/μL；对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)检测灵敏度达1×101拷贝/μL；虾肝肠胞虫检测灵敏度达1×101拷贝/μL；传染性皮下及造血组织坏死病毒检测灵敏度达1×101拷贝/μL。由结果表明该多重PCR检测方法的灵敏度要高于普通PCR方法。
二、特异性实验
根据上述的多重PCR检测方法，分别采用对虾白斑综合征病毒(WSSV)、对虾急性肝胰腺坏死症(AHPND)(pirVP)、虾肝肠胞虫(EHP)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的其中1种、2种、3种或4种作模板以及阴性对照进行实验验证，实验结果表明，本发明试剂盒及检测方法特异性好，未出现假阳性或假阴性，实验结果见图6。
图6为多重PCR体系中分别检测1种，2种，3种，4种对虾病原实验结果图。其中M为Takara DL2000 DNA Marker，1-4为1种病原模板(从1到4依次为WSSV、AHPND(pirVP)、EHP、IHHNV)，5-10为2种病原模板(从5到10依次为WSSV和AHPND(pirVP)、WSSV和EHP、WSSV和IHHNV、AHPND(pirVP)和EHP、AHPND(pirVP)和IHHNV、EHP和IHHNV)，11-14为3种病原模板(从11到14依次为WSSV和AHPND(pirVP) 和EHP、WSSV和EHP和IHHNV、AHPND(pirVP)和EHP和IHHNV)，15为4种病原模板(WSSV和AHPND(pirVP)和EHP和IHHNV)，16为阴性对照。
综上所述，可以得出采样本发明的检测方法及试剂盒具有良好的特异性。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省海洋生物研究院
<120> 同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测方法和试剂盒
<130> 12
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttctcacctc atgctttctt cc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacttgctta gagatggctt cg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggaagtcggt cgtagtgtag 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atatcgcata accaagccat tc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gagagtagcg gaacggatag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcatcacgga cctgttattg 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aagagcagcg acagttcag 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cggcttcctt agttgatagt tg 22
<210> 9
<211> 1189
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ttctcacctc atgctttctt ccatggattc ccatacaaag tcatctttca tggacaacat 60
caaattgcac atgactgata ctcaatgctt cttcaagaac attgaacgat ttgagaaatt 120
cttgggaaga tatggggacg aatacgccat gtcccacaag caaaattgta actgcccctt 180
ccatctccac cacactttta ctccctcaga taacgagcat ctggtatcct ctttcgcatt 240
cgcccgccca gaagtctcca tggaagaaat tagagccaca ccctatcagg ccaacaagct 300
tattagtgac aaacattacg tgatgaacat gtccaagatc gattctagag taacaggatc 360
ttccctcctt aagaaggtta gcgaatggac tgaaatgaga atgaactcca actttaatgg 420
aacatttgaa ccatcaagac tcgccctctc caactctggc atgacaacgg caggagtcaa 480
cctcgacgtt attgtcaaac caaataatgc aagaagtgta ctaggaatat tggaatgtca 540
tcgccagcac gtgtgcaccg ccgacgccaa gggaactgtc gcttcagcca tgccagccgt 600
cttccaggca accgatggaa acggtaacga atctgaactg atccagaatg ctctgccaag 660
gaacagatac atccaaaaga gcacaatgaa cgctcaaact gtcgtgtttg ctaatgtttt 720
ggaacaactt atcgccgatc ttggaaaggt tatcgtgaac gaactggccg gcaccatcgc 780
tgaatctgta ccagaaagcg tatatgaaaa caccaaggaa atgattgata gactaggctc 840
tgacgacctc ttcaaatcta ataataatgg aggagtagaa tcaatggatt atgaagatag 900
cgaaacaaca tccaacaatg gtcccgtcct catctcagaa gccatgaaga atgccgtcta 960
tcacacacta atttccggca aggcagctcg cccggaaaat gtaccattcg cctcatgcgc 1020
cagcggccct ctcgcctttg atttccttct gtcaaaggga gatacattcg aagaaaagaa 1080
cgccgaacaa ggtgcagcag ctgccgtatc ctctacctat tcttcctctt ctaacactac 1140
tcttcgtaag catttggctc gagttttcga agccatctct aagcaagta 1189
<210> 10
<211> 719
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggaagtcggt cgtagtgtag acattgagaa tacgggacgt ggggagctta ccattcaata 60
ccaatggggt gcgccattta tggctggcgg ctggaaagtg gctaaatcac atgtggtaca 120
acgtgatgaa acttaccatt tacaacgccc tgataatgca ttctatcatc agcgtattgt 180
tgtaattaac aatggcgcta gtcgtggttt ctgtacaatc tattaccact aagaaggtgc 240
tcacatgact aacgaatacg ttgtaacaat gtcatctttg acggaattta accctaacaa 300
tgctcgtaaa agttatttat ttgataacta tgaagttgat cctaactatg ctttcaaagc 360
aatggtttca tttggtcttt caaatattcc ttacgcgggt ggttttttat caacgttatg 420
gaatatcttt tggccaaata cgccaaatga gccagatatt gaaaacattt gggaacaatt 480
acgtgacaga atccaagatt tagtagatga atcgattata gatgccatca atggaatatt 540
ggatagcaaa atcaaagaga cacgcgataa aattcaagac attaatgaga ctatcgaaaa 600
cttcggttat gctgcggcaa aagatgatta cattggttta gttactcatt acttgattgg 660
acttgaagag aactttaagc gcgagctaga cggtgatgaa tggcttggtt atgcgatat 719
<210> 11
<211> 512
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gagagtagcg gaacggatag ggagcatggt ataggtgggc aaagaatgaa atctcaagac 60
cccacctgga ccaacggagg cgaaagcgat gctcttagac gtatctgggg atcaaggacg 120
aaggctagag tatcgaaagt gattagacac cgctgtagtt ctagcagtaa actatgccga 180
caatgctggg tgttgcgaga gcgatgcttg gtgtgggaga aatcttagtt ttcgggctct 240
ggggatagta cgctcgcaag ggtgaaactt aaagcgaaat tgacggaagg acactaccag 300
gagtggattg tgctgcttaa tttaactcaa cgcgggaaaa cttaccaggg tcaagtctat 360
cgtagattgg agacatgagg tagacaagag tggtgcatgg ccgttggaaa ttgatggggc 420
gacttttagc ttaagtgctg gaaccagtga gatcttctag acaggtgtta tttaggcaca 480
ggagggagaa ggcaataaca ggtccgtgat gc 512
<210> 12
<211> 244
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aagagcagcg acagttcagc aacagaaaca caacgatata agatggtaaa atcaatgatg 60
aagacctacg gatggaaagt acataaagca ggcgtagtga tgcactcgat ggtacccctt 120
atgaaagact taaaagtatc aggaggcaca tcatttgaga ctctcacatt tacagacacc 180
ccatatttag aaatatttaa ggatactact ggactacata atcaactatc aactaaggaa 240
gccg 244

Claims (8)

1.一种同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测方法，其特征在于：采用多重PCR检测方法，能够一次性同时利用WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的专用检测引物WSSV-F和WSSV-R、AHPND-F和AHPND-R、EHP-F和EHP-R、IHHNV-F和IHHNV-R进行四种病原的扩增，引物序列如下：
对虾白斑综合征病毒WSSV
上游引物：WSSV-F：TTCTCACCTCATGCTTTCTTCC SEQ ID NO:1
下游引物：WSSV-R：TACTTGCTTAGAGATGGCTTCG SEQ ID NO:2
对虾急性肝胰腺坏死症AHPND
上游引物：AHPND-F：GGAAGTCGGTCGTAGTGTAG SEQ ID NO:3
下游引物：AHPND-R：ATATCGCATAACCAAGCCATTC SEQ ID NO:4
虾肝肠胞虫EHP
上游引物：EHP-F：GAGAGTAGCGGAACGGATAG SEQ ID NO:5
下游引物：EHP-R：GCATCACGGACCTGTTATTG SEQ ID NO:6
传染性皮下及造血组织坏死病毒IHHNV
上游引物：IHHNV-F：AAGAGCAGCGACAGTTCAG SEQ ID NO:7
下游引物：IHHNV-R：CGGCTTCCTTAGTTGATAGTTG SEQ ID NO:8；
所述4对病原引物彼此间无交叉，且不与其它病原产生交叉。
2.如权利要求1所述的一种同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)提取DNA：
取疑似对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒发病对虾鳃和内脏组织，提取病原核酸DNA备用；
采用权利要求1所述的多重PCR引物；阳性对照为SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列混合作为模板，阴性对照为：不含有对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒任一病原的任意DNA核酸序列；
(2)多重PCR扩增：
提取好待检测的DNA模板，同时按照PCR检测的PCR反应体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品进行扩增；将各反应管放入PCR仪的反应槽内，设定多重PCR仪反应程序，进行多重PCR反应；
扩增产物检测与分析：1.5％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并成像分析；
(3)结果判定：
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，约为1189bp时，结果为对虾白斑综合征病毒阳性；如果没有1189条带，则为对虾白斑综合征病毒阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，约为719bp时，结果为对虾急性肝胰腺坏死症阳性；如果没有719条带，则为对虾急性肝胰腺坏死症阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，约为512bp时，结果为虾肝肠胞虫阳性；如果没有512bp条带，则为虾肝肠胞虫阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，约为244bp时，结果为传染性皮下及造血组织坏死病毒阳性；如果没有244bp条带，则为传染性皮下及造血组织坏死病毒阴性；
当阴性对照出现条带时，表明操作过程中有试剂污染，检测结果无效；
当阳性对照无条带时，表明引物或者试剂盒中相关试剂降解，引物或试剂盒失效。
3.如权利要求2所述的一种同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(1)提取病原核酸DNA的步骤为：取疑似对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒发病对虾内脏组织0.05-0.15g，加入400μL裂解液研磨均匀，加入蛋白酶K，终浓度为100μg/ml，震荡混匀后于55℃温育1-2h；
在反应液中加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇混匀，去除残余蛋白，10000r/min离心10min后取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇混匀，10000r/min离心10min，转移上层水相，加入1/10体积3mol/L乙酸钠，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，12000r/min离心5min，沉淀用75％冷乙醇洗涤2次，室温晾干后加入50μL TE，于-20℃保存备用。
4.如权利要求3所述的一种同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测方法，其特征在于：所述裂解液组成为15mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA,1％SDS。
5.如权利要求2所述的一种同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR检测的PCR反应体系为：50μL反应体系中包含有10倍浓度的含镁离子的Taq DNA聚合酶缓冲液5μL，Taq DNA聚合酶1μL，各引物终浓度为0.4μM，提取好待检测的DNA模板2μL。
6.如权利要求2所述的一种同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(2)设定多重PCR反应条件为：95℃4分钟，1个循环；95℃1分钟，58.5℃1分钟，72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟，1个循环；4℃保存。
7.一种同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：包括WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的专用检测引物WSSV-F和WSSV-R、AHPND-F和AHPND-R、EHP-F和EHP-R、IHHNV-F和IHHNV-R、阳性对照品、阴性对照品、DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、Mg2+、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水；WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的专用检测引物WSSV-F和WSSV-R、AHPND-F和AHPND-R、EHP-F和EHP-R、IHHNV-F和IHHNV-R，引物序列如下：
对虾白斑综合征病毒WSSV
上游引物：WSSV-F：TTCTCACCTCATGCTTTCTTCC SEQ ID NO:1
下游引物：WSSV-R：TACTTGCTTAGAGATGGCTTCG SEQ ID NO:2
对虾急性肝胰腺坏死症AHPND
上游引物：AHPND-F：GGAAGTCGGTCGTAGTGTAG SEQ ID NO:3
下游引物：AHPND-R：ATATCGCATAACCAAGCCATTC SEQ ID NO:4
虾肝肠胞虫EHP
上游引物：EHP-F：GAGAGTAGCGGAACGGATAG SEQ ID NO:5
下游引物：EHP-R：GCATCACGGACCTGTTATTG SEQ ID NO:6
传染性皮下及造血组织坏死病毒IHHNV
上游引物：IHHNV-F：AAGAGCAGCGACAGTTCAG SEQ ID NO:7
下游引物：IHHNV-R：CGGCTTCCTTAGTTGATAGTTG SEQ ID NO:8；
阳性对照品为SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列混合作为模板；
阴性对照为：不含有对虾白斑综合征病毒、对虾急性肝胰腺坏死症(pirVP)、虾肝肠胞虫、传染性皮下及造血组织坏死病毒任一病原的任意DNA核酸序列。
8.一种同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR引物，其特征在于：引物序列如下：
对虾白斑综合征病毒WSSV
上游引物：WSSV-F：TTCTCACCTCATGCTTTCTTCC SEQ ID NO:1
下游引物：WSSV-R：TACTTGCTTAGAGATGGCTTCG SEQ ID NO:2
对虾急性肝胰腺坏死症AHPND
上游引物：AHPND-F：GGAAGTCGGTCGTAGTGTAG SEQ ID NO:3
下游引物：AHPND-R：ATATCGCATAACCAAGCCATTC SEQ ID NO:4
虾肝肠胞虫EHP
上游引物：EHP-F：GAGAGTAGCGGAACGGATAG SEQ ID NO:5
下游引物：EHP-R：GCATCACGGACCTGTTATTG SEQ ID NO:6
传染性皮下及造血组织坏死病毒IHHNV
上游引物：IHHNV-F：AAGAGCAGCGACAGTTCAG SEQ ID NO:7
下游引物：IHHNV-R：CGGCTTCCTTAGTTGATAGTTG SEQ ID NO:8。
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